Introduction
De mechanismen waarmee de darm reguleert dieet lipide verwerking, de lever stuurt complex lipidesynthese en lipoproteïne metabolisme, en hoe deze organen met het centrale zenuwstelsel voedselinname zijn onvolledig begrepen. Het is van biomedische belang deze biologie verhelderen in het licht van de huidige epidemieën van zwaarlijvigheid, hart- en vaatziekten, diabetes en niet-alcoholische steatohepatitis. Studies in celcultuur en muizen hebben op voorwaarde dat de meerderheid van onze kennis van de mechanistische relaties tussen de voeding vetten en de ziekte, en de zebravis (Danio rerio) zijn in opkomst als een ideaal model om dit werk aan te vullen.
Zebravis soortgelijke gastrointestinale (GI) organen, lipidemetabolisme en lipoproteïne transport hogere vertebraten 1,2, snel ontwikkelen en genetisch handelbaar. De optische helderheid van de larvale zebravis vergemakkelijkt in vivo studies, een particular voordeel voor de studie van het GI-systeem als zijn extracellulaire milieu (dwz, gal, microbiota, endocriene signalering) is het vrijwel onmogelijk om te modelleren ex vivo. Volgens een lichaam van het onderzoek combineren van de genetische tractability en bevorderlijk zijn beeldvorming van de zebravis larven leven diverse manipulaties dieet (vetrijk 3,4, 5 -cholesterol en -carbohydrate diëten 6,7) en modellen van hart- en vaatziekten 8, diabetes 9,10, hepatische steatose 11-13, 14-16 en obesitas, ontstaan van een groot aantal metabole inzichten.
Essentieel overgang de larvale zebravis in de metabole activiteit is het optimaliseren van technieken die in andere modeldieren de zebravis en de ontwikkeling van nieuwe assays die de unieke sterktes van de zebravis benutten. Dit protocol presenteert technieken ontwikkeld en geoptimaliseerd om larvale zebravis diervoeders een Lipid-rijke maaltijd, visualiseren dieet lipide de verwerking van het hele lichaam naar subcellulaire resolutie, en meet voedselinname. Kip eidooier werd gekozen om de vetrijke maaltijd samenstellen aangezien het een hoog gehalte aan vetten en cholesterol (lipiden samen ~ 58% kip eigeel, waarvan ~ 5% cholesterol, 60% triglyceriden en 35% fosfolipiden ). Kip eidooier bevat meer vet dan typische commerciële zebravis micropellet voedingsmiddelen (~ 15% lipiden) en het voordeel dat het een gestandaardiseerde feed met bekende percentages van specifieke vetzuren species, zoals zebravis dieet en voeding regimenten niet in laboratoria 17 gestandaardiseerd. Bovendien fluorescerende lipide analogen die in de eidooier visualiseren transport en de accumulatie van voedingslipiden 18, stock celcomponenten inclusief vetdruppels door zowel fungeert als vitale kleurstoffen 3 en door covalente opname in complexe lipiden onderzoeken metabolisme met dunnelaagchromatografie (TLC) 19 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze protocollen zijn goedgekeurd door het Carnegie Institution for Science Institutional Animal Care en gebruik Comite (protocol nr. 139).
1. Dierlijke Voorbereiding
- Handhaaf volwassenen en larven bij 28 ° C op een 14 uur: 10 uur licht: donker cyclus. Feed volwassenen tweemaal daags met shell gratis Artemia (decapsulated, niet uitkomen, te beginnen bij 14 DPF) en commerciële micropellets.
- Deze protocollen zijn geoptimaliseerd voor het gebruik van 6-7 dpf larven door natuurlijke paaien van de AB achtergrond verzameld. Protocollen kunnen worden aangepast voor de larven van andere leeftijden en achtergronden. Bieden geen exogeen voedsel vóór 6 DPF.
- Verdoven larven tricaïne in embryomedium (EM) (4,2 ml 4 mg / ml tricaïne per 100 ml EM) bij kamertemperatuur (RT).
2. Bereiding van Lipid-rijke eigeel Feed
- Voor te bereiden en op te slaan de kip eidooiers. Scheid de dooier en wit van 12 kippeneieren. Zwembad de dooiers, monster 1 ml in 1,5ml buizen en bewaar bij -80 ° C tot 1 jaar (12 dooiers maakt ~ 80 monsters). Zwembad de blanken, op te slaan en te gebruiken als een lipide-arme, eiwitrijke voeding.
- Bereid fluorescerende lipide analoog (en) worden toegevoegd aan het eigeel geven indien gewenst.
- Schorsen de gekochte, gepoederde fluorescerende lipide analoge in 100% ethanol en 100% chloroform bij 0,1 ug / ul (zie opmerking hieronder bespreken oplosmiddelen), aliquot in ondoorzichtige glazen buizen, afdichting met parafilm en opslag volgens de instructies van de fabrikant. Door snelle verdamping van organische oplosmiddelen niet gebruikte hoeveelheid volumes van minder dan ~ 400 ul voor langdurige opslag.
Opmerking: Als de lipide analoge in ethanol gesuspendeerd, worden grote hoeveelheden van het lipide analoge worden gebruikt omdat het sneller droogt onder N2 dan chloroform. Indien de lipide analoge in ethanol wordt opgeschort hoeft niet te worden gedroogd en geresuspendeerd alvorens het aan het liposoom voeding in stap 2.2.4, maar de totale ethanolconcentratie mag niet meer dan 0.1% in de voeding liposoom teneinde mogelijk verstorende fysiologische effecten van ethanol voorkomen. - Voor fluorescente vetzuur analogen: Bereid een totaal volume van 20 ml 5% eierdooier emulsie in EM. Vanaf dat bereiden 5 ml aliquots met een eindconcentratie van 6,4 uM 4,4-difluor-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indaceen (BODIPY C 16) voor levende confocale beeldvorming en voedselinname assays of 1 ug / ml BODIPY C 12 voor stereomicroscoop beeldvorming. Breng de gewenste hoeveelheid van de fluorescente lipide analoge in een 1,5 ml plastic buis. Droog het lipide onder een stroom N2, verzorgen het lipide niet te blazen van de buis.
- Onmiddellijk hersuspenderen in 5 pi 100% ethanol door pipetteren een stroom langs de zijkanten van de buis, voeg 95 ul EM en meng goed.
Opmerking: Het mengsel moet homogeen te verschijnen; Als gekleurde lipide blijft aan de zijkanten van de buis of de vloeistof klonterig is het lipide niet volledig oplosbaar en vereist meer ethanol. Bescherm de buis weerm licht en op te slaan op het ijs. - Voor TL cholesterol analoge: bereid een eindconcentratie van 2,4 ug / ml cholesterol in 5 ml 0,5-5% eigeel emulsie voor levende imaging studies. Breng de gewenste hoeveelheid cholesterol in een 1,5 ml plastic buis. Droog het lipide onder een stroom N2, verzorgen het lipide niet te blazen van de buis.
- Onmiddellijk resuspendeer in 15 ui RT 100% ethanol door pipetteren een stroom langs de zijkanten van de buis en meng met 85 ui RT 1% vetzuur-vrij BSA in gezuiverd H 2 O. Bescherm de buis van licht en op te slaan op het ijs.
- Schorsen de gekochte, gepoederde fluorescerende lipide analoge in 100% ethanol en 100% chloroform bij 0,1 ug / ul (zie opmerking hieronder bespreken oplosmiddelen), aliquot in ondoorzichtige glazen buizen, afdichting met parafilm en opslag volgens de instructies van de fabrikant. Door snelle verdamping van organische oplosmiddelen niet gebruikte hoeveelheid volumes van minder dan ~ 400 ul voor langdurige opslag.
- Bereid Egg Yolk liposoom-feed.
- Voeg een ontdooide hoeveelheid van eigeel aan EM in een 50 ml conische buis. Vortex de verdunde eidooier mengsel voor 1-2 min; het mengsel moet blijken een homogene emulsie.
- Giet het mengsel door een fijne zeef om eiwitten conglomeraten te verwijderen en te verzamelen in een nieuwe, frisse 50 ml conische buis.
- Pulse SONICATÉ het eimengsel met een vierde inch conische micropunt (5 keer (5 x 1 seconde aan, 1 seconde uit) pauzeren 5-10 sec tussen elke set; uitgang intensiteit: 6 W) bij RT om liposomen te maken. Ultrasoonapparaat energie-instellingen zijn instrument afhankelijk en vereisen daarom optimalisatie voor elk instrument en micropunt.
Opmerking: Continu rocken liposoom mengsel bij KT om de homogeniteit tot gebruik te handhaven.
- Voeg de fluorescerende lipide analoog het eigeel liposomen, indien gewenst. Onmiddellijk na sonicatie, pipet de bereide lipiden in het liposoom mengsel en vortex met hoge snelheid gedurende 30 seconden op te nemen in liposomen. Bescherm het mengsel van licht door het wikkelen van de buis in folie en blijven schommelen bij RT.
3. Feeding Paradigm
- Bereid de Larven voor het voeden.
- Voorafgaand aan het begin van de voeding, het scherm larven voor de hand liggende morfologische gebreken die voeding kunnen belemmeren. Transfer larven tot 60 mm x 15 mm petrischaaltjes of 6 of 12-well plates, EM verminderen tot een minimum, en vervangen door 5 ml van de bereide liposoomoplossing.
- Indien nodig overbrengen unfed controle larven tot 5 ml EM en / of 5 ml 5% eiwit in EM en te behandelen in parallel.
- Schud de larven in een bebroede rocker (29-31 ° C bij 30 rpm) in het diervoeder de voedselinname te stimuleren en tegelijkertijd te beschermen tegen het licht als fluorescerende lipide-analogen aanwezig zijn. Als larven moeten worden blootgesteld aan licht, minimaliseren de belichting met een gekleurd glas incubator deksel.
- Aan het eind van de voedingsperiode, spoel de vrij zwemmende larven EM 3 keer.
Opmerking: Larven kan beginnen consumeren liposomen op enig moment tijdens de voeding. Als het essentieel dat larven beginnen toevoeren tegelijkertijd, scherm voedselinname (zie 3.4) na 1 h voeding en alleen terugkeren larven die begonnen toevoer aan het eigeel emulsie aan het voer voltooien. - Zeef de larven op dit punt voor de voedselinname als een klein aantal mag niet eat (algemeen ~ 0-5%). Onderzoek de ingewanden van de larven die werden verdoofd of licht afgekoeld op een metalen blok op ijs te bepalen of zij gevoed: larven die verbruikt liposomen een verduisterde darm (Figuur 1) hebben.
- Afbeelding of proces larven voor voedselinname onmiddellijk. Afwisselend plaats larven in verse EM en incubeer bij 28 ° C om metabolische verwerking plaatsvindt.
4. Montage Larven voor Live Imaging
- Bereid de Mounting Media.
- 3% methylcellulose: voeg 0,75 g méthylcellulose 25 ml kokende buurt EM, vortex, rots bij kamertemperatuur 2-3 dagen tot volledig opgelost en bewaar bij 4 ° C gedurende jaren bij -20 ° C. Herhaalde cycli van bevriezen en ontdooien bij 4 ° C zullen luchtbellen te verwijderen. Bewaar 3% methylcellulose op het ijs tijdens het monteren larven.
- Voor 1,2% low-mount agarose: voeg 0,3 g lage-smelt agarose tot 25 ml EM en oplossen door te brengen aan de kook, monster in 2 ml tUbes en te handhaven op 26-28 ° C op een warmte-blok. Ongebruikte porties kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur of -20 ° C gekookt en opnieuw op het moment van gebruik. Zorg ervoor dat agarose koel genoeg is om te handelen voordat bloot te stellen aan larven of zij kunnen oververhit.
- Voor lage-vergroting, medium-throughput live-imaging, plaats een glasplaatje op een weefsel op een metalen blok op ijs en wacht tot de glijbaan af te koelen. Breng een ruime hoeveelheid van 3% methylcellulose op de dia (die bij 4 ° C op ijs gehandhaafd), breng een larve op de 3% methylcellulose, met behulp van een visserij-line poker (0,41 mm diameter vislijn vastgelijmd aan de uiteinde van een glazen capillaire buis) een trouw om overtollig EM afvoer (zodat methyl cellulose niet zal worden verdund) en plaats de larven zoals gewenst.
- Voor de korte termijn (<20 min), high-vergroting live-imaging met een rechte olie emersion objectieve, monteren larven met het dekglaasje lean-to-methode.
- Gebruik cyanoacrylaat lijm op (Superlijm) naarattach aa 22 mm x 30 mm dekglaasje aan één uiteinde van een glasplaatje. Gebruik een poker om een dunne lijn van 3% methylcellulose op de dia naast het dekglaasje te zetten en over te dragen larven aan de dia met een brede boring Pasteur pipet. Verwijder overtollig EM, zodat het de methylcellulose niet verdunnen.
- Met behulp van een poker voorzichtig positioneren larven in de methylcellulose op hun kant (linkerkant tot beeld meer van de lever, rechtop op beeld de galblaas) met hun hoofden naast het dekglaasje.
- Spot superlijm in de hoeken van een tweede dekglaasje en plaats voorzichtig een rand van het dekglaasje over het dekglaasje geplaatst en de andere op de dia overbruggen van de larven. Zorg dat u niet teveel druk uit te oefenen tijdens deze stap of met het doel, terwijl beeldvorming, zodat de larven blijven ongedeerd.
- Voor de lange termijn, high-vergroting beeldvorming met een rechtopstaande immersie objectief, zet larven in agarose. Voeg een larve van een kleine hoeveelheid van 1,2% low melt agarose vervolgens over delarve in een klein volume van agarose een petrischaal.
- Snel de positie van de larven met een poker voordat de agarose stolt. Laat de agarose drogen 2-3 min en dek de agarose volledig met verse EM om te voorkomen dat het drogen.
- Voor de lange termijn, high-vergroting beeldvorming met een omgekeerde doel, monteren larven op een glazen bodem schaal in agarose.
- Cool een metalen blok op het ijs. Plaats de schaal op het metalen blok gescheiden door een weefsel om overmatige koeling en larvale bevriezing te voorkomen. Transfer een larve aan het gerecht en verwijder de EM door wicking met een tissue.
- Plaats een druppel van 28 ° C laag smeltpunt agarose (1,2%) op de top van de larve en meteen te positioneren met een poker (links naar beneden om het beste imago van de lever, recht naar beneden om het beeld van de galblaas). Verwijder schotel uit de koude blok, laten drogen 2-3 min en voeg een voldoende hoeveelheid verse EM de agarose bedekken (~ 2-5 ml).
5. voedselinnameanalyse
- Aan het einde van een eidooier liposoom diervoeders die 6,4 uM BODIPY C 16, zwembad een minimum van 10 gewassen larven in een plastic 1,5 of 2 ml tube, verwijder EM, en snap bevriezen. De monsters worden bewaard bij -80 ° C beschermd tegen licht gedurende enkele maanden.
Opmerking: Indien mogelijk, verzamel meerdere herhalingen. Het is belangrijk om unfed larven verzamelen in deze stap te normaliseren voor achtergrond fluorescentie lipide (bij voorkeur larven van dezelfde koppeling worden gebruikt). - Voer een aangepaste Bligh-Dyer vetextractie 3,21.
- Voeg 100 ul homogenisatiebuffer (20 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA) om het monster op ijs (alternatief gezuiverd H 2 O kan worden gebruikt). Homogeniseren op ijs met een micropunt ultrasoonapparaat (5 sec totaal: 1 sec op 1 sec uit). Controleer of de larven zijn geheel gehomogeniseerd; zo niet, herhalen. Over te dragen aan een 13 ml wegwerp glascultuur buis (andere glazen buizen kunnen worden gebruikt).
Let op: Chloroform is gevaarlijk; voeren alle daaropvolgende lipide extractie stappen bij kamertemperatuur in een chemische kap. - Voor elke 100 gl homogenisatiebuffer gebruikt, voeg 375 pl van 1: 2 (chloroform: methanol). Vortex 30-60 sec, incubeer 10 min, voeg 125 pl chloroform per 100 gl homogenisatiebuffer gebruikt en vortex 30 sec.
- Voeg 125 ul van 200 mM Tris pH 7,5 per 100 gl homogenisatiebuffer gebruikt, 30 sec vortex en gecentrifugeerd (2000 x g, 5 min, kamertemperatuur, beschermd tegen licht). Haal de monsters uit de centrifuge. Ze worden gescheiden in twee fasen: een bovenste waterige fase, een interface van larvale puin, en een onderste organische fase (bevat lipiden).
- Met een schone glazen pipet het verzamelen van de bodem, organische fase en over te dragen in een schone 13 ml glazen buis.
Let op: Zorg ervoor dat de waterfase en larvale puin op het grensvlak te voorkomen; indien besmetting optreedt, herhaal centrifugeren stap en Recollect. Gooi de bovenste, waterige fase; kan het nuttig zijn om te verwijderen en gooi dezefase voor het verzamelen van de organische fase. Het monster kan maximaal 1 maand bewaard bij -80 ° C. - Droog de organische fase onder vacuüm (0,12 atm), terwijl de bescherming tegen licht. Niet verder de monsters drogen na het vocht verdampt als het lipide oplosbaarheid vermindert. Resuspendeer de lipiden in 2: 1 (chloroform: methanol) en bewaar op ijs. De optimale omvang van de chloroform: methanoloplossing afhankelijk van de gebruikte detectiemethode; start lage en verder verdund zoals nodig. Een algemene richtlijn dat 10 gl gebruiken 10 pooled larven.
- Voeg 100 ul homogenisatiebuffer (20 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA) om het monster op ijs (alternatief gezuiverd H 2 O kan worden gebruikt). Homogeniseren op ijs met een micropunt ultrasoonapparaat (5 sec totaal: 1 sec op 1 sec uit). Controleer of de larven zijn geheel gehomogeniseerd; zo niet, herhalen. Over te dragen aan een 13 ml wegwerp glascultuur buis (andere glazen buizen kunnen worden gebruikt).
- Spot de gehele monster volumes in gelijkmatig tussenpozen op een gekanaliseerd TLC-plaat en scan de plaat met een laserscanner routinematig gebruikt voor biomoleculaire imaging (bijvoorbeeld een fluorescerende plaat lezer). Voor de fluorescerende lipide analogen opgenomen in de lijst van materialen die een excitatiemaxima 500-650 nm en emissie maxima hebben 510-665 nm, gebruikt een 488 nm laser en emissie bij 520 nm collectie.
- Kwantificeren van de totale fluorescentie van elke plek met imaging software.
Let op: Correct voor de natuur voorkomende achtergrond lipide fluorescentie door het aftrekken van de fluorescentie van gepaarde, unfed larvale monsters.
- Kwantificeren van de totale fluorescentie van elke plek met imaging software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bij toediening op een rocker bij 29-31 ° C, zal de meerderheid van gezonde larven (≥95%) eten op 1 uur. Na het nuttigen van het eigeel emulsie, de larvale darm donkerder van kleur. Zeer donkere darmen kan worden waargenomen bij 2 uur (figuur 1). Als larven zijn unfed of niet te voeden, de darm blijft duidelijk. Larven gevoed eiwit vertonen een opgezwollen darmlumen die niet donkerder van kleur.
Figuur 1:. Screening Larven voor Intake Eten Wild type 6-DPF larven werden gevoed 5% eigeel in EM gedurende 2 uur of parallel behandeld EM te unfed controles te verkrijgen. Unfed larven hebben duidelijke darmen terwijl gevoed larven die eidooier hebben verbruikt hebben donkere darmen wanneer afgebeeld op 10X op een stereoscoop. Schaalbalken vertegenwoordigen 0,1 mm.Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het voeden met fluorescerende lipide analogen maakt visualisatie van systemische transport en de subcellulaire accumulatie van voedingskundige lipiden. Het fluorescentiesignaal is gedurende de spijsverteringsorganen (darm, lever en pancreas) van larven gevoed 5% eidooier aanwezig met 6,4 uM fluorescerende C 16 analoog voor 8 uur gemonteerd het dekglaasje aangebouwd werkwijze en afgebeeld met een opstaande objectief (Fig 2) 3.
Figuur 2:. Fluorescent Lipid analogen Visualiseer Dietary Lipid Transport vertegenwoordiger samengesteld beeld van een 6-DPF larve (hoofd naar rechts) gevoed 5% eigeel in EM met 6,4 uM BODIPY FL C 16 voor 8 uur. De larven werd in 3% methylcellulose bevestigd door het dekglaasje aangebouwd werkwijze en afgebeeld met een opstaande 63x olie-immersie objectief op een enkel foton confocale microscoop met een argon laser. Schaalbalken vertegenwoordigen 20 urn. Lever, L; darm, I; pancreas, P, galblaas, GB; herdrukt met toestemming van Dev Bio 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Verschillende lipide analogen mogelijk maken visualisatie van unieke reeksen celstructuren aangezien differentieel gemetaboliseerd tot complexe lipiden (dwz, triglyceriden, cholesterol esters, fosfolipiden). Na 4-8 uur feeds, TL C 16 en C 12-analogen label vetdruppels, fluorescerende FL C 5 labels vetdruppels, lever en pancreas kabelgoten, celmembranen, en arteriële netwerken, en tl-C 2 analoge labels lever en pancreas kabelgoten en cellulaire membranen (Figuur 3) 3.
ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figuur 3:. Verschillende Fluorescent Lipid analogen Label Unique Cellular Organs Vertegenwoordiger samengestelde beelden van larven gevoed 5% eigeel in EM met 6,4 uM BODIPY FL C 16, C 12, C 5 of C 2 voor 4-8 uur (6 dpf) . C 16 analoge waargenomen in lipidedruppels (LD) van enterocyten, C 12 en C 5 analogen enterocyten LD en het darmlumen, en C 2 analoge in het darmlumen. Larven werden in 3% methylcellulose gemonteerd door de dekglaasje lean-methode en afgebeeld met een rechte 63x olie-immersie objectief op een enkel foton confocale microscoop met een argon laser. Schaalbalken vertegenwoordigen 20 urn. Overgenomen met toestemming van Drug Discov Vandaag Dis Models 22._blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het larvale voedselinname assay werd ontwikkeld om te onderzoeken hoe genetische mutaties, transgene overexpressie en / of exogene behandeling beïnvloeden larvale voedselinname. Larven worden gevoed een vetrijke maaltijd verrijkt met een fluorescerende lipide analoog aan de hoeveelheid geconsumeerd voedsel te geven. Unfed larven verzameld parallel te normaliseren voor de hoeveelheid achtergrondfluorescentie die in larven, waardoor de gevoeligheid waarbij de fluorescerende lipide analoge kan worden gedetecteerd. Deze test werd gebruikt om dat overexpressie van apolipoproteïne A-IVb.1 (apoA-IVb.1) vermindert voedselinname tonen. Eerder unfed Tg (hsp70: apoA-IVb.1: mCherry) larven gevoed 10% eidooier met 6,4 uM fluorescerende C 16 analoog voor 4 uur bij 7 dpf verbruikt ongeveer 30% minder lipiden dan wildtype larven (figuur 4) 20.
Figuur 4:. Vertegenwoordiger voedselinname Assay Wild type (WT) en Tg (hsp70: apoA-IVb.1: mCherry) (Tg) larven werden gevoed 10% kip eigeel met 6,4 uM BODIPY FL C16 gedurende 4 uur (Fed) of behandeld in parallel in EM (Unfed). (A) Larven werden samengevoegd (n = 10) werden lipiden geëxtraheerd, en de extracten werden gespot op een TLC-plaat. (B) Totaal fluorescentie werd gekwantificeerd, uitgedrukt in arbitraire fluorescentie-eenheden (AFU), genormaliseerd voor achtergrond fluorescentie in unfed broers en zussen door aftrekken, en uitgedrukt ten opzichte van WT. Tg larven overexpressie ApoA-IVb.1 inslikken minder fluorescent gelabeld lipide analogen zoals getoond in vergelijking met WT (gepaarde t-toets, p <0,001; n = 9, 20 larven per experiment). De doos staat voor de 25-75 ste percentielen, en de mediaan wordt aangegeven. De snorharen tonen de 10-90 ste percentiel. herdruktmet toestemming van Dis Model Mech 20. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven technieken kunnen onderzoekers larvale zebravis behandelen met een lipide-rijke voeding, visualiseren dieet lipide verwerking in levende larven, en te kwantificeren larvale voedselinname. Om succes te garanderen, moet speciale aandacht worden besteed aan een aantal kritische stappen. Commerciële kippeneieren variëren; mogelijke variabiliteit te minimaliseren voeren wij alle assays biologische eieren van kooi-kippen die niet zijn verrijkt voor omega-3 vetzuren. Lagere voeden tarieven kunnen worden waargenomen in vissen jonger dan 6 dpf met de resterende endogene dooier energievoorziening, ongezonde vis of vis met een ontwikkelingsstoornis mutaties die voedselinname (dat wil zeggen, kaak of darm misvorming, het onvermogen om goed te zwemmen) belemmeren. De Farber laboratorium voert algemeen voedingsstudies op 6-7 dagen na de bevruchting (DPF) omdat larven geen exogene eten genomen totdat hun endogene dooier winkels zijn uitgeput en eigeel depletie zorgt voor een betere visualisatie van het spijsverteringsstelsel. Voedenbij KT ook vermindert het aantal larven dat eet. Niet-screen larven voor de voedselinname en onbedoelde opname van unfed larven in de daaropvolgende experimenten kunnen de resultaten verwarren. Bovendien is het belangrijk om de fluorescerende lipide analogen en alle larvale monsters genoeg van de analogen, bescherming tegen licht als mogelijk maximale fluorescentie en derhalve testgevoeligheid handhaven. Ten slotte, als voedselinname wordt gemeten, staan geen voeder en chase (na toevoer metabolisme voorwaarde) totaal 4 uur overschrijdt, omdat de maaltijd begint te worden uitgescheiden. Momenteel is de snelheid waarmee de maaltijd en bijbehorende fluorescerende lipide analogen worden uitgescheiden is niet bekend, maar fluorescentie kunnen aanhouden gedurende de larvale lichaam minstens 2 dagen berichtfeed (JPO en SAF ongepubliceerde gegevens).
Er zijn verschillende manieren om aan te passen en het oplossen van de protocollen bij de experimentele vragen van belang te beantwoorden. De vetrijke voeding kan worden uitgevoerd gedurende verschillende tijden tijd: 1 uur een kleine maaltijd verschaffen, terwijl 4 uur de darm met een grote hoeveelheid lipiden zal vullen. Echter, het voeden van de larven langer dan 6 uur wordt niet aanbevolen als de dooier en EM zijn niet bereid in steriele omstandigheden en bacteriële overgroei in de eidooier / witte emulsie kunnen de resultaten verwarren (dat wil zeggen, verhoogde ontsteking, veranderde darmflora profiel). Larven kunnen direct worden onderzocht na de voeding om acute effecten van het voer larven geïmmobiliseerd door korte koeling of verdoving te onderzoeken snel beginnen om opnieuw gevoed na het opwarmen, maar koeling is de voorkeur methode van immobilisatie als larven kunnen braken vertonen bij anesthesie (SAF-gepubliceerde waarneming). Als alternatief chase perioden kunnen worden uitgevoerd na de voederveiligheid mogelijk te maken voor transport en het metabolisme van de voedingskundige lipiden voorafgaand aan de studie. Hoewel voedingen gewoonlijk in 5 ml liposoomoplossing worden uitgevoerd, zijn voedingen met succes uitgevoerd in volumes van 1 tot 20 ml. diverse concentraties eigeel kan worden gebruikt voor larvale feeds; de Farber laboratorium routinematig uitvoert experimenten met 5% eidooier (1 ml eidooier toegevoegd aan 19 ml EM), 0,5% eidooier en 10% eierdooier.
Er zijn mogelijke beperkingen van fluorescerende lipide analogen die moeten worden overwogen. Bij het kiezen van een fluorescerende lipide analoge is het belangrijk na te gaan hoe de lipide fysiologisch verwerkt en waarbij de fluorescerende groep op de chemische structuur van de lipide bij het interpreteren van de resultaten. Zo zijn triglyceriden afgebroken tot vrije vetzuren en glycerol, esters en cholesterol in vrije cholesterol en vetzuren, in het darmlumen voorafgaand aan absorptie. Daarom, als een fluorescerende triglyceride of cholesterol ester analoog is aangebracht in de voeding de fluorescentie waargenomen in het lichaam zal het vetzuur, vrij cholesterol of glycerol dat de fluorescerende groep aan, niet de originele triglyceride of cholesterol ester gehecht volgen. verschillende fluorescent lipide analogen label unieke cellulaire structuren, en dit feit moet tijdens de selectie 3 worden beschouwd. Ook van belang in vergelijking met het metabolisme van natieve vetzuren, de toevoeging van een BODIPY rest is ongeveer gelijk aan het toevoegen -2-3 koolstofatomen vetzuur ketenlengte (SAF ongepubliceerde gegevens).
De hier beschreven technieken vertegenwoordigen aanzienlijke verbeteringen ten opzichte van eerdere tests in het veld beschreven. Voorafgaand aan de ontwikkeling van deze kip eigeel voer, twee manuscripten gedetailleerde studies waarin de larven werden gevoed aangedreven hardgekookt ei eigeel 4,23. De hier beschreven techniek heeft het voordeel dat de eidooier behoeft niet te hard gekookte en gemalen vóór gebruik en poedervormige eidooier heeft een zeer korte halfwaardetijd vanwege de snelle oxidatie. Vloeibare eidooier kan ook worden bereid zoals liposomen die gemakkelijk aanvaarden fluorescerende lipide analogen efficiënte voeding leveren. Als alternatief kunnen radioactief gemerkte lipiden worden gebruikt om investigate dieet vetstofwisseling en meten van voedselinname, maar fluorescerende lipide-analogen niet over de veiligheidsrisico's in verband met radioactiviteit te presenteren. Maar als onderzoekers willen radiolabeled lipiden gebruikt, heeft de Farber laboratoriumstudies uitgevoerd om te controleren of radioactief gelabelde lipiden in kan worden opgenomen, en met succes gevoed met liposomen 19. De fluorescerende lipide analogen die hier beschreven werden gekozen omdat ze zeer vergelijkbaar metabolisme tot endogene en radioactief gelabelde lipiden laten zien, en waren voldoende helder voor laag- en high-power imaging.
Voorafgaand aan het ontstaan van deze techniek fluorescerende lipide analogen voeden larven geen andere methoden beschikbaar waren voor voeding lipidetransport en accumulatie in vivo visualiseren. Directe visualisatie van fluorescerende lipide analogen kan een voordeel bieden boven het gebruik van indirecte maatregelen van de fysiologie, zoals serum lipiden. Nauwkeurige meting van larvale zebravis voedselinname was ook een lange-standing uitdaging in het veld. Het enige alternatief was om cultuur paramecia, label ze met de fluorescerende lipofiele tracer 4- (4- (didecylamino) styryl) - N -methylpyridinium jodide (4-Di-10-ASP), laat larven te voeden, en het meten van de fluorescentie van de intra-abdominale gebied met een plaatlezer 24. Tenslotte, deze technieken hebben het voordeel dat die zowel voor middellange throughput screens (dwz voorwaartse genetische screens van dieet lipide verwerking) en geconcentreerd sterk vergrotende imaging studies (bijv reverse genetische, hypothesegedreven studies). In de toekomst kunnen deze technieken worden toegepast om te screenen fenotype en verschillende modellen van metabole en gastro-intestinale ziekten in zebravis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt) | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Anesthesia for larval zebrafish |
| Chicken eggs | N/A | N/A | Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids |
| Ultrasonic processor 3000 sonicator | Misonix, Inc. | S-3000 | To make egg yolk liposomes |
| Sonabox acoustic enclosure | Misonix, Inc. | 432B | To make egg yolk liposomes |
| 1/8” tapered microtip | Misonix, Inc. | 419 | To make egg yolk liposomes |
| Amber vials (4 ml, glass) | National Scientific | 13-425 | Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa |
| Incu-Shaker Mini | Benchmark | 1222U12 | Incubated shaker for feeds |
| BODIPY FL C16 | Thermo Fisher Scientific | D3821 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid) |
| BODIPY FL C12 | Thermo Fisher Scientific | D3822 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D3834 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D2183 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid) |
| TopFluor cholesterol | Avanti Polar Lipids Inc. | 810255 | Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol |
| Fatty acid-free BSA | Sigma-Aldrich | A0281-1G | For TopFluor cholesterol solubilization |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm |
| Low melt agarose | Thermo Fisher Scientific | BP165-25 | Mounting media for live larval imaging; 22 x 30 |
| VWR microscope slides | VWR | 16004-422 | Mounting larvae for live imaging |
| Coverslips | Cover Glass | 12-544A | Mounting larvae for live imaging |
| Super glue | Loctite | LOC01-30379 | Mounting larvae for live imaging |
| FluoroDish (glass bottom dish) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness |
| Confocal microscope | Leica Microsytems | SP-2, SP-5 | Microscope for high magnification live imaging |
| Stereoscope | Nikon | SM21500 | Microscope for low magnification live imaging |
| Glass culture tubes | Kimble | 73500-13100 | Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml) |
| Savant SpeedVac Plus | ThermoQuest | SC210A | Lipid extraction |
| Channeled TLC plates | Whatman Scientific | WC4855-821 | Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued |
| Channeled TLC plates | Analtech, Inc. | 66911 | Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | GE Healthcare | 9410 | Fluorescent plate reader for food intake assay |
| ImageQuant software | GE Healthcare | 29000605 | Analysis of food intake assay |
| 5 3/4’ Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets | Kimble | 63A53WT | Transfering larvae |
References
- Carten, J. D., Farber, S. A. A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo. Clin Lipidol. 4 (4), 501 (2009).
- Babin, P. J., Vernier, J. M.
- Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish. Dev Biol. 360 (2), 276-285 (2011).
- Marza, E., et al. Developmental expression and nutritional regulation of a zebrafish gene homologous to mammalian microsomal triglyceride transfer protein large subunit. Dev Dyn. 232 (2), 506-518 (2005).
- Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).
- Fang, L., et al. Programming effects of high-carbohydrate feeding of larvae on adult glucose metabolism in zebrafish, Danio rerio. Br J Nutr. 111 (5), 808-818 (2014).
- Wang, Z., Mao, Y., Cui, T., Tang, D., Wang, X. L. Impact of a combined high cholesterol diet and high glucose environment on vasculature. PLoS One. 8 (12), 81485 (2013).
- Fang, L., et al. In vivo visualization and attenuation of oxidized lipid accumulation in hypercholesterolemic zebrafish. J Clin Invest. 121 (12), 4861-4869 (2011).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).
- Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136 (5), 865-875 (2009).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, 21 (2010).
- Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7 (5), 36474 (2012).
- Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21 (9), 2042-2049 (2007).
- Watts, S. A., Powell, M., D'Abramo, L. R. Fundamental approaches to the study of zebrafish nutrition. ILAR J. 53 (2), 144-160 (2012).
- Farber, S. A., et al. Genetic analysis of digestive physiology using fluorescent phospholipid reporters. Science. 292 (5520), 1385-1388 (2001).
- Miyares, R. L., de Rezende, V. B., Farber, S. A. Zebrafish yolk lipid processing: a tractable tool for the study of vertebrate lipid transport and metabolism. Dis Model Mech. 7 (7), 915-927 (2014).
- Otis, J. P., et al. Zebrafish as a model for apolipoprotein biology: comprehensive expression analysis and a role for ApoA-IV in regulating food intake. Dis Model Mech. 8 (3), 295-309 (2015).
- Bligh, E., Dyer, W. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-918 (1959).
- Otis, J. P., Farber, S. A. Imaging vertebrate digestive function and lipid metabolism. Drug Discov Today Dis Models. 10 (1), (2013).
- Andre, M., et al. Intestinal fatty acid binding protein gene expression reveals the cephalocaudal patterning during zebrafish gut morphogenesis. Int J Dev Biol. 44 (2), 249-252 (2000).
- Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PLoS One. 7 (12), 52549 (2012).
