Introduction
Hjertesvigt er et komplekst klinisk syndrom, hvor symptomerne omfatter træthed, dyspnø, motion intolerance, og væskeretention i perifere væv. Det er den hyppigste dødsårsag i de udviklede lande 1. Bortset fra nedarvet kardiomyopati forårsaget af mutationer i sarkomeret proteiner eller ionkanaler 2, kan myokardiedysfunktion være forårsaget af en række medicinske tilstande, herunder hypertension, valvulær hjertesygdomme, fedme og diabetes 3. Ændringer i myokardie struktur, elektrisk ledning, og energi stofskifte fører til utilstrækkelig hjertefunktion pumpekapacitet for at imødekomme kredsløbssygdomme krav, hvilket i sidste ende resulterer i hjertesvigt 3,4. Undersøge mekanismerne bag hjertesvigt, derfor er kritisk inden for kardiovaskulær forskning. Identifikation molekylære mekanismer, der fører til hjertesvigt progression kan i sidste ende hjælpe med opdagelsen af nye terapeutiske mål eller nyttige biomarkører
Hjertehypertrofi og remodellering spiller en kritisk rolle i udviklingen af hjertesvigt. Hypertensive hjertesygdomme er den vigtigste medvirkende faktor af hjertehypertrofi og utilpasset remodeling ses i humane patienter 1. For at efterligne disse menneskelige betingelser, er dyremodeller ofte etableret gennem kirurgiske procedurer. Navnlig kan den tværgående eller abdominale aorta indsnævres til at øge modstanden mod den venstre ventrikel, hvilket i sidste ende fører til en trykoverbelastning i hjertet. Dette fænomen resulterer sædvanligvis i hjertehypertrofi, til en fysiologisk erstatning af cardiomyocytter opfylde den funktionelle efterspørgsel af det kardiovaskulære system. tilsidesætter dog den funktionelle efterspørgsel de normale fysiologiske kompenserende mekanismer, der fører til hjerte-fibrose og entrepflise værdiforringelse. Tværgående pulsåresammensnøring (TAC) kirurgi indebærer ofte komplicerede procedurer, herunder torakotomi, mekanisk ventilation, og adskillelse af thymus og fedtvæv fra aortabuen. I modsætning hertil abdominale aorta indsnævring kræver enklere eksperimentelle teknikker 6-8. Den abdominale aorta, mellem venstre og højre renale arterier, er indsnævret under operationen. Hjertehypertrofi og remodellering kan iagttages adskillige uger efter den abdominale aorta indsnævring kirurgi 6-8; de producerer robust hypertensiv hjertesygdom svarende til den, der genereres af den tværgående pulsåresammensnøring kirurgi 9,10. Her beskriver vi en protokol til at udføre abdominal aorta indsnævring i rotter under anvendelse af en effektiv, højt reproducerbar, og minimalt invasiv metode. Den abdominale aorta støder op til de renale arterier er indsnævret af en 0,72 mm løkke dannet af en 4-0 silketråd. Ti uger efter operationen, hjertehypertrofi og remodeling kan observeres. Rottemodellen af abdominal aorta konstriktion-induceret hjertehypertrofi tilvejebringer en platform for at studere sygdomsmekanismer og patofysiologi samt udviklingen af potentielle lægemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr, udgivet af det amerikanske National Institutes of Health (NIH publikation nr. 85-23, revideret 1996). Protokollen blev godkendt af og i overensstemmelse med de retningslinjer, der er fremsat af Institutional Animal Care og brug Udvalg på National Taiwan University.
1. Animalske Kirurgi
- Forbered en 22 G kanyle ved afstumpning spidsen af nålen på en honing sten. Ved hjælp af en tang, liggør nålen til en ret vinkel.
- Før operationen, forberede de nødvendige kirurgiske instrumenter og materialer, samt et opsving bur. Autoklavér alle instrumenter og kirurgiske forsyninger før brug.
- Vedligehold rotterne omkring 200 g og holde dem under 12 timer lys / mørke cyklus ved en kontrolleret temperatur (21 ± 2 ° C) med fri adgang til mad og vand. Omfatte mindst 6 rotter i hver gruppe. Bedøver rotterne med pentobarbital(75 mg / kg i 0,5 ml, ip) eller en anden passende narkosemiddel. Bekræft anæstesidybden ved at teste halen refleks.
BEMÆRK: Fraværet af halen refleks er en indikator for tilstrækkelig anæstesi. - Placer en rotte i rygleje på en operation platform med en varmepude til at opretholde legemstemperatur. Barbere det abdominale område af rotte med et dyr hårklipper og hår remover lotion at undgå kirurgiske forureninger. Skrub rent-barberede maven med betadin eller en anden udrensning reagens før operation.
BEMÆRK: Det er vigtigt at opretholde et sterilt område under hele proceduren. - Foretag en 2 cm indsnit langs midterlinjen af maven med en skalpel. Brug af normalt saltvand, holde den abdominale orgel fugtig under operationen. Fortrænge fordøjelsesorganerne omhyggeligt til side ved hjælp vatkugler at blotlægge vena cava inferior, der ligger i den bageste peritoneal region. Identificere den abdominale aorta, der ligger side om side med og normalt påtilbage af den nedre vena cava.
BEMÆRK: Den abdominale aorta er det fartøj, der pulserer i takt med pulsen. - Gennembore bughinden med et par pincet til at afdække skibene under. isolere forsigtigt abdominale aorta støder op til de renale arterier og bestå en 8 cm lange 4-0 silke sutur under den abdominale aorta mellem oprindelsen af højre og venstre renale arterier.
- Lav en løs dobbelt knude med sutur; efterlade en løkke diameter 3 mm, og placer afstumpet og bøjet 22 G nål inde i sløjfen. Stram knuden omkring aorta og nålen, og derefter fjernes kanylen straks at opnå en indsnævring diameter 0,7 mm.
- Luk bughulen med 6-0 absorberbar sutur materiale. Sutur musklen eller snit i huden med enkle afbrudte suturer. For at forebygge infektion, krat operationsstedet med en jod tinktur.
- Observere dyret forsigtigt, indtil det genvinder tilstrækkelig bevidsthed, som angivet ved fri bevægelighedog fødeindtagelse. Lad ikke et dyr uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje. At forhindre post-kirurgi smerte, behandle rotter med acetaminophen (300 mg / kg i 0,5 ml, ip).
BEMÆRK: Brugere skal administrere analgetika som godkendt af institutionelle politikker.
2. Tissue og blodprøvetagning
- Ved 10 uger efter kirurgi, vejes rotten og bedøver det med pentobarbital (75 mg / kg i 0,5 ml, ip). Før indgrebet, bekræfter anæstesidybden ved at teste dens hale refleks. Placer rotte på en metalbakke.
- Foretag en 2 cm indsnit langs midterlinien af halsen ved anvendelse af en skalpel. Forskyde muskler omhyggeligt med en pincet for at blotlægge trachea. Observere omhyggeligt at identificere halspulsårer, som er parallelle med luftrør og pulserer i takt med hjertefrekvensen.
- Opsaml blod fra halspulsåren i en blod indsamling rør overtrukket med EDTA. Umiddelbart centrifugeblodet i 15 min ved 2000 xg og indsamle plasmaet. Opbevar blodplasmaet ved -80 ° C indtil brug.
- Fremstilling af en 5 cm indsnit ved bryst regionen, omkring midterlinjen af xyphoid proces. Gennembore membranen med skarpe pincet. Ved hjælp af en saks, klippe og fjern brystkassen langs midt-clavicula linjer på begge sider til at eksponere hjertet. Forbrugsafgifter hjertet forsigtigt langs de hjerte- og kar-grænser. Fjern hjertet forsigtigt uden opsigtsvækkende vævet.
- Monter hjerte på en modificeret Langendorff perfusion apparat ved at binde den aorta stammen til perfusion nål. Perfundere hjertet med Krebs-puffer (indeholdende 110 mM NaCl, 2,6 mM KCI, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO4, 25 mM NaHCO3, og 11 mM glucose [pH 7,4]) for at udvaske blodet. Afvej hjertet og beregne hjerte-vægt-til-krop-vægtforhold. Fastgør hjerte med 4% paraformaldehyd på isen. Husk at bære en maske, da paraformaldehyd damp er toxic.
3. Tissue fibrose Kvantificering
- Placer paraformaldehyd-fikserede hjerte væv på et væv sektionering enhed og skæres 2 mm tykke snit. Placer vævssnit i en indlejring kassette. Dehydrere væv gennem en serie af graduerede alkohol bade (50%, 75%, 95% og 100% i 1 time hver).
- Infiltrere vævet med xylen i 1 time og endelig i voks i 1 time. Placer infiltreret væv i en indlejring kassette og integrere med paraffin. de indlejrede væv i paraffinblokke ved stuetemperatur opbevares indtil microtoming.
- Skær den indlejrede væv i 4 um tykke snit. Placer sektionerne i en 45 ° C vandbad. Dyp et objektglas i vandbadet i en vinkel og gradvist nærmer paraffin afsnittet kanter tillader delvis fastgørelse til objektglasset.
- Flyt dias ind og ud af badet for at fjerne potentielle luftlommer under sektionen væv og for at lette en bedre vedhæftning. tør than glider ved 37 * C i 1 time og opbevare dem ved stuetemperatur i histologisk farvning.
- Sæt dias i en tank. Afparaffiniser objektglasset med xylen i 30 minutter og rehydrere det i rækkefølge fortyndet alkohol (95%, 75% og 50% i 3 min hver) og endelig i destilleret vand. Brug tilstrækkelig PicroSirius rød opløsning til helt at dække de vævssnit i 1 time. Skyl dias i en 0,5% eddikesyre til to ændringer, og derefter udføre to skylninger i absolut alkohol.
- Air-tørre dias og montere dias i syntetisk harpiks med et dækglas. Fotografere dias i en synligt lys felt.
BEMÆRK: Den røde område i fotografiet viser en PicroSirius rød positiv zone under et mikroskop ved 200X forstørrelse. Procentdelen af PicroSirius røde positive zone over den samlede areal, som angiver graden af fibrose 11.
4. Blood troponin Kvantificering
- Kvantificere plasma troponin niveaueranvendelse af et enzymbundet immunosorbentassay (ELISA). Analysere hver prøve in duplo. Load 50 pi blodplasma og 50 pi af et antistof cocktail i de passende brønde. Forsegl pladen og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur på en pladeryster ved 400 rpm.
BEMÆRK: Cardiac troponin i plasmaet er en markør for kardiel skade. - Aspirere væsken og vask hver brønd med 250 pi vaskebuffer tre gange. Efter den sidste vask vendes pladen og duppes den mod rene papirservietter til at fjerne overdreven væske.
- Tilsæt 100 pi tetramethylbenzidinsubstrat til hver brønd og inkuberes i 10 minutter i mørke på en pladeryster ved 400 rpm. Tilsæt 100 ul stop-løsning til hver brønd. Ryst pladen på en pladeryster i 1 minut for at blande. Optag den optiske densitet (OD) ved 450 nm.
BEMÆRK: Koncentrationen af troponin er proportional med OD-værdien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
10 uger efter den abdominale aorta konstriktion kirurgi blev den resulterende kardial patologi analyseret. Den kardielle histologi blev målt ved at beregne forholdet mellem hjertevægt til legemsvægt og ved at detektere mængden af collagen i hjertet. Cardiac skade blev bekræftet ved måling af plasma kardial troponin koncentration.
Som vist i figur 1A, blev hjertets størrelse forstørres efter abdominal aorta konstriktion kirurgi, hvilket fremgår af en højere hjerte-vægt-til-krop-vægtforhold (figur 1B), en indikator af hjertehypertrofi. Ved at bruge PicroSirius rød farvning, kan fibrotisk myokardium farvet med et forøget kollagen (rød) skelnes fra normale områder (gul, figur 2). Cardiac fibrose blev forøget efter abdominal aorta konstriktion kirurgi (figur 2B) sammenlignet med c ONTROL (figur 2A). Resultaterne korrelerer med plasma troponin koncentrationer (figur 3). En øget troponin koncentration viser, at hjerte-remodellering og skade i pres overbelastning har fundet sted. Tilsammen abdominale pulsåresammensnøring resulterer i tydelig kardiel skade, mærket hjertehypertrofi, og vævsremodellering.
Figur 1:. Hjertehypertrofi under Pressure Overload (A) Repræsentant hjerte og (B) hjerte-vægt-til-krop-vægt-forhold er vist 10 uger efter abdominal aorta konstriktion kirurgi. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SEM af seks uafhængige forsøg udført. Forskelle mellem grupper blev bedømt ved t-test. * P <0,05 i forhold til kontrol. 8fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Cardiac Fibrose under Pressure Overload.
PicroSirius rød farvning afslørede forøget kollagen-ekspression. (A) repræsentant PicroSirius rød farvning (Scale bar = 200 um) og (B) procentdel af fibrotisk område 10 uger efter abdominal aorta konstriktion kirurgi. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SEM af seks uafhængige forsøg udført. Forskelle mellem grupper blev bedømt ved t-test. * p <0,05 versus kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.
s / ftp_upload / 54.818 / 54818fig3.jpg "/>
Figur 3: Cardiac Skade under Pressure Overload.
Blodplasma troponin koncentrationer blev målt 10 uger efter abdominal aorta konstriktion kirurgi. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SEM af seks uafhængige forsøg udført. Forskelle mellem grupper blev bedømt ved t-test. * p <0,05 versus kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G syringe needle | BD Biosciences | 309572 | |
| EDTA Blood Collection Tubes | BD Biosciences | REF365974 | |
| 4-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2515N | |
| 6-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2150N | |
| Pentobarbital | Sigma Aldrich | 1507002 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 441244 | |
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | |
| Picrosirius red solution | Abcam | ab150681 | |
| Cardiac troponin kit | Abcam | ab200016 | |
| Imagequant | Molecular Dynamics | ||
| Langendorff | ADInstruments | ML870B2 |
References
- Houser, S. R., et al. Animal models of heart failure: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 111, 131-150 (2012).
- Towbin, J. A.
- Breckenridge, R. Heart failure and mouse models. Dis Model Mech. 3, 138-143 (2010).
- van Bilsen, M., van Nieuwenhoven, F. A., van der Vusse, G. J. Metabolic remodelling of the failing heart: beneficial or detrimental? Cardiovasc Res. 81, 420-428 (2009).
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2, 138-144 (2009).
- Gu, W. L., Chen, C. X., Huang, X. Y., Gao, J. P. The effect of angoroside C on pressure overload-induced ventricular remodeling in rats. Phytomedicine. 22, 705-712 (2015).
- Zhang, Y., et al. Alteration of cardiac ACE2/Mas expression and cardiac remodelling in rats with aortic constriction. Chin J Physiol. 57, 335-342 (2014).
- Tardif, K., et al. Nestin upregulation characterizes vascular remodeling secondary to hypertension in the rat. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1265-H1274 (2015).
- Li, C., et al. Myeloid mineralocorticoid receptor deficiency inhibits aortic constriction-induced cardiac hypertrophy in mice. PLoS One. 9, e110950 (2014).
- Ku, H. C., Su, M. J. DPP4 deficiency preserved cardiac function in abdominal aortic banding rats. PLoS One. 9, e85634 (2014).
- Lee, S. Y., et al. Caffeic acid ethanolamide prevents cardiac dysfunction through sirtuin dependent cardiac bioenergetics preservation. J Biomed Sci. 22, 80 (2015).
- Gs, A. K., Raj, B., Santhosh, K. S., Sanjay, G., Kartha, C. C. Ascending aortic constriction in rats for creation of pressure overload cardiac hypertrophy model. J Vis Exp. , e50983 (2014).
- deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H.
- Schaefer, A., et al. A New Animal Model for Investigation of Mechanical Unloading in Hypertrophic and Failing Hearts: Combination of Transverse Aortic Constriction and Heterotopic Heart Transplantation. PLoS One. 11, e0148259 (2016).
- Rodriguez-Iturbe, B., Quiroz, Y., Kim, C. H., Vaziri, N. D. Hypertension induced by aortic coarctation above the renal arteries is associated with immune cell infiltration of the kidneys. Am J Hypertens. 18, 1449-1456 (2005).
- Ku, H. C., Lee, S. Y., Yang, K. C., Kuo, Y. H., Su, M. J. Modification of Caffeic Acid with Pyrrolidine Enhances Antioxidant Ability by Activating AKT/HO-1 Pathway in Heart. PLoS One. 11, e0148545 (2016).
- Bovill, J. G. Intravenous anesthesia for the patient with left ventricular dysfunction. Semin Cardiothorac Vasc Anesth. 10, 43-48 (2006).
- Inoko, M., Kihara, Y., Morii, I., Fujiwara, H., Sasayama, S. Transition from compensatory hypertrophy to dilated, failing left ventricles in Dahl salt-sensitive rats. Am J Physiol. 267, H2471-H2482 (1994).
- Heyen, J. R., et al. Structural, functional, and molecular characterization of the SHHF model of heart failure. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H1775-H1784 (2002).
