Protocol
1. Voorbereiding van Materialen en Cultuur Medium
- Voor de dissectie en dissociatie van de SCZ, wikkel de hersenen matrix, tweesnijdend scheermesje en pincet met aluminiumfolie, en vervolgens steriliseren ze in de autoclaaf.
- Bereid 50 ml koude PBS buffer om de gehele muizenhersenen wassen.
- Het opzetten van een dissectie microscoop en de voorbereiding van de chirurgische instrumenten die nodig zijn voor de dissectie van de hersenen (geautoclaveerd schaar en pincet) en de isolatie van de SCZ (1 ml spuit, 30 G naald, hersenen matrix, en fijne tang).
- Bereiding van N2 Medium:
- Bereid F-12 / DMEM (+ L-glutamine, natriumbicarbonaat +) medium met 2% B27, 1% N2 supplementen, en 1% penicilline-streptomycine.
Noot: Het groeimedium bestaat uit N2 medium en groeifactoren (20 ng / ml gezuiverd epidermale groeifactor (EGF) en 20 ng / ml basische fibroblastgroeifactor (bFGF2)).
- Bereid F-12 / DMEM (+ L-glutamine, natriumbicarbonaat +) medium met 2% B27, 1% N2 supplementen, en 1% penicilline-streptomycine.
- Bereid een spijsvertering buffer (40 eenheden / ml papaïne, 2,4 eenheid / ml Dispase II en 2% penicilline-streptomycine in PBS) voor weefsel spijsvertering.
- Voorbereiding van de Coating Plate en Coverslip:
- Bereid poly-L-ornithine (PLO; 0,01%) en laminine (10 ug / ml opgelost in DH 2 O). Het coaten 6-well platen voor het onderhoud van SCZ-aNSCs als een monolaag of 18 mm dekglaasjes voor immunokleuring, incubeer ze met PLO nacht bij 4 ° C. Was ze vervolgens 3 maal met DH 2 O. Laat de platen en dekglaasjes te drogen na de laatste wassen.
- Vervolgens incuberen van de platen met laminine overnacht bij 4 ° C. Vervolgens was ze 3 keer met DH 2 O.
Let op: de laminine niet droog, welke cel beslag zal beïnvloeden.
Opmerking: De coating oplossingen kunnen 3 keer worden hergebruikt.
2. Isolatie en dissociatie van de Adult SCZ
- Voorafgaand aan de cultuur voorbereiding, plaatst de hersenen matrix en tweesnijdend scheermes op ijs.
Opmerking: Niet in de vriezer van de hersenen matrix, omdat de brain kon hechten aan het. - Offer een muis (8 weken oud) door CO 2 stikken of cervicale dislocatie.
- Snijd het hoofd met een scherpe schaar na het spuiten 70% ethanol. Om het hoofd te immobiliseren, houdt beide zijkanten van het hoofd stevig vast. Snijd de huid met een schaar op de middellijn in een caudale-rostrale richting. Dit bevordert de volledige verwijdering van de huid van de schedel.
- Verwijder het caudale deel van de schedel (posterior naar lambda), en dan steek de tang tussen de schedel en de hersenen bij de dorsale middellijn positie. Pak de links (of rechts) pariëtale bot en zorgvuldig afschilferen. Herhaal deze procedure voor het verwijderen van de andere pariëtale botten.
Opmerking: Verbreking van de optische zenuw en verwijdering van de hersenvliezen van de hersenen het gemakkelijker maken om de hersenen losmaken van de schedel. - Breng de hersenen koude PBS buffer (25 ml) en spoel tweemaal om overtollig bloed te verwijderen.
- Plaats de hersenen in de hersenen matrix op ijs en make coronale bezuinigingen op 1 mm dikke plakken te verkrijgen. Breng de hersenen plakjes (1 mm) die de SCZ gebieden die zich in het achterste deel van de hersenen om een koude PBS in een 35 mm plastic petrischaal.
Let op: Met het oog op een parallelle vlak van coronale secties te verkrijgen, ervoor zorgen dat de hersenen spleet wordt geplaatst in de middellijn van de hersenen matrix; is het essentieel om onnodige variaties in de mijden.
Let op: Verkrijg hersenen plakjes op 2-3 mm achter bregma; Hierdoor kan de scheiding van de SCZ de SVZ. - Onder de microscoop ontleden met een lage vergroting, micro-ontleden de SCZ van de witte stof gebied van de cortex en de hippocampus met een gebogen 30G naald 6,9. Verwijder vervolgens de cortex regio's boven de SCZ. Plaats de ontleed regio SCZ van de plakjes in een 35 mm plastic petrischaal op ijs zonder koude PBS.
NB: Besmetting van extra gebieden met volwassen neuronen kunnen hebben voor de levensvatbaarheid van aNSCs en neurosphere vorming bmdat ze ondergaan celdood in ANSC kweekomstandigheden. - Met behulp van een gebogen 30 G naald, onmiddellijk Hak de ontleed weefsel in kleine stukjes.
Opmerking: Als er een langere tijd nodig is voor het ontleden van de SCZ weefsel, dompel de ontleed weefsels in koude PBS voor het hakken. - Resuspendeer de gesneden weefsel met 1 ml digestiebuffer, breng het weefsel naar een 15 ml buis met 2 ml digestiebuffer en incubeer gedurende 30 minuten in een 37 ° C waterbad.
Let op: Schud de buis om de 10 min goed te mengen.
3. Subcallosal Zone-afgeleide volwassen neurale stamcel Cultuur
- Tik de buis licht tot het gedigereerde weefsel dissociëren en centrifugeer de buis bij 145 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant, geresuspendeerd het gedigereerde weefsel met 1 ml voorverwarmd medium N2 uitwasbaar de digestiebuffer en voorzichtig pipet de monsteroplossing maximaal 5 keer met een pipet P1000.
Opmerking: Over-tritureren met een smallepipet tip kan levensvatbaarheid van de cellen en de daaropvolgende groei verminderen. - Centrifugeer de buis bij 145 xg gedurende 5 minuten. Na het weggooien van het supernatant, resuspendeer de cel pellet in 1 ml N2 medium.
- Bereid 1 ml N2 medium in een niet-beklede 6-well plaat en voeg 1 ml van de gesuspendeerde cellen op een eindvolume van 2 ml te maken.
- Voeg EGF (20 ng / ml) en bFGF (20 ng / ml) in elk putje. Schud de 6-well cultuur schotel met de hand om de toegevoegde groeifactoren mengen met de vergulde cellen. Houd de 6-well plaat in een 37 ° C en 5% CO2 incubator.
- Voeg EGF (20 ng / ml) en bFGF (20 ng / ml) aan elk putje elke dag gedurende 8 dagen. Elke derde dag, voeg 200 pl media N2 bij benadering volume 2 ml van het medium te handhaven.
4. Passage van NSCs als Neurosferen en monolaag culturen
- Verzamel de neurospheres en overbrengen naar een nieuwe 15 ml conische buis.
Let op: het aantal neurosferen (> 50 micrometer diameter) per en de SCZ van één muizenhersenen was 64,3 ± 7,31, die lager is dan die van de SVZ was (190,5 ± 6,33) 9. - Incubeer de neurosferen met 0,5 ml dissociatie buffer gedurende 5 minuten in een 37 ° C waterbad voor de neurosferen dissociëren in enkele cellen. Primaire neurospheres los kan worden gezien in enkele cellen en onderhouden over meerdere passages als neurosphere of monolaag culturen.
Opmerking: Uitbreiding SCZ-aNSCs als een monolaag is superieur aan neurospheres omdat SCZ-aNSCs kan worden gepasseerd> 10 keer in een monolaag cultuur formaat, maar <5 keer in een neurosphere cultuur formaat.
Voorzichtig: SCZ-aNSCs vertonen sterke aggregatie, en het is moeilijk om ze dissociëren in enkele cellen. Aldus wordt de neurosfeercultuur formaat niet geschikt voor routinematige celexpansie. - Voorzichtig pipet de monsteroplossing op en neer met een P1000 pipet minder dan 5 maal en centrifugeer de buis bij 145 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en re-subrengen de neurospheres met 1 ml N2 medium.
Opmerking: Over tritureren met een smalle pipet tip kan levensvatbaarheid van de cellen en de daaropvolgende groei verminderen. - Om de cellen te tellen, maak een 1: 1 mengsel van de celsuspensie (10 ui) en 0,4% trypan blauwe oplossing, en tel het aantal levende cellen op een hematocytometer. Na het bekleden van een 6-wells plaat met PLO / laminine, plaat de cellen bij 2,5 x 10 5 cellen / ml met 2 ml N2 medium voor elk putje.
Opmerking: wijzigingen in cel dichtheid kan hun conditie en differentiatie potentieel beïnvloeden. - Handhaaf de SCZ-aNSCs met een dagelijkse behandeling van groeifactoren (2 ml, 20 ng / ml) gedurende 5 dagen, en deze passage hen.
5. Differentiatie van Subcallosal Zone-afgeleide adulte neurale stamcellen
- ANSCs plaat op een PLO / laminine beklede 18 mm dekglaasje met 1 x 10 5 cellen / ml in 1 ml N2 met groeifactoren (20 ng / ml) voor differentiatie van de SCZ-aNSCs.
- De volgende dag,wanneer de cellen stevig aan de dekglaasje, wisselen het groeimedium met N2 tot de groeifactoren te verwijderen.
- Na 6 dagen was de gedifferentieerde cellen met 1 ml PBS om celresten te verwijderen en ze op te lossen voor immunokleuring.
Opmerking: BrdU kan in het nieuw gesynthetiseerde DNA van prolifererende cellen worden opgenomen. Derhalve desgewenst BrdU (10 ug / ml) worden toegevoegd aan cellen leven voor de fixatie van cellen.
6. Immunokleuring adulte neurale stamcellen en gedifferentieerde Progenitors
- Voor immunokleuring, was de cellen met PBS en bevestig ze met 4% PFA gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
Let op: PFA is zeer giftig; Aanraking met de huid en ogen te vermijden. - Verwijder de 4% PFA, spoel de gefixeerde cellen met PBS 3 keer, en bewaar ze bij 4 ° Cuntil ze nodig zijn voor immunokleuring.
- Incubeer de cellen op het dekglaasje met blokkeeroplossing (3% runderserumalbumine en 0,1% Triton X-100 in 1 x PBS) gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Bereid de primaire antilichamen in verse blokkerende oplossing en incubeer de monsters gedurende de nacht bij 4 ° C.
- Immunokleuring de aNSCs
- Vlekken aNSCs het gebruik van anti-Nestin en anti-BrdU-antilichamen. Vóór fixatie, voeg 20 ug BrdU de aNSCs en incubeer ze gedurende 2 uur. Voer de denatureringsstap middels 2 N HCl gedurende 20 minuten bij 37 ° Cbefore uitvoeren van de blokkeringsstap.
- Immunokleuring de gedifferentieerde voorlopers:
- Met anti-O4, anti-BIII-tubuline en anti-gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) antilichamen tegen de gedifferentieerde voorlopercellen labelen.
- Immunokleuring de aNSCs
- Was de monsters met PBS 3 keer en incubeer ze met secundaire antilichamen geconjugeerd aan fluorescente kleurstoffen (1: 500) in blokkeeroplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens was de monsters 3 maal met PBS.
Opmerking: Gebruik secundaire antilichamen die overeenkomen met de gastheren van de primaireantilichamen. Hoechest33343 (1: 2000) wordt gebruikt voor kleuring van kernen. - Voeg montage oplossing voor een dia glas en ga verder met de montage. Observeren en beeld het monster op een confocale microscoop op verschillende golflengten: FITC (488 nm), Cy3 (543 nm), Cy5 (647 nm), en Hoechest33343 (405 nm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Definieert het kweeksysteem voor aNSCs van de onbekende neurogene regio essentieel voor het begrijpen van deze cellen en het ontwikkelen van hun potentieel gebruik in de hersenen reparatie 12. Het is bekend dat NSC's op verschillende ontwikkelingsstadia en in verschillende gebieden zich anders gedragen 3,4. Onlangs werd bericht dat SCZ-afgeleide cellen vertonen differentiële potentieel voor neuronale differentiatie in vivo en in vitro vergeleken met SVZ-afgeleide cellen 7-9. Daarom nauwkeurig elke neurogene isolering werden hersenplakjes de SCZ ontleed onder toepassing van een 1 mm hersenen matrix (Figuur 1A). Na 8 dagen kweken met groeifactoren, kan aNSCs afgeleid van SCZ neurosferen, waarbij de cellen vervolgens kan worden gehandhaafd (figuur 1B) te vormen.
Aangezien een deel van NSC in de neurosferen spo kanntaneously gedifferentieerd 13, een monolaag kweeksysteem is ook nuttig voor het behoud van de relatief homogene populatie van SCZ-aNSCs. Groeifactoren en dissociatie enzymen zoals trypsine niet gemakkelijk doordringen diep in de neurosphere 14,15. Monolaagculturen bieden meer zelfs voorwaarden voor de uitbreiding van de NSC. Van primaire neurospheres werden SCZ-aNSCs in enkele cellen gescheiden door een spijsvertering buffer behandeling. Een dag na cel uitzetten werden aNSCs aan de gecoate plaat en vertoonden celproliferatie (figuur 2A). Hun vermogen proliferatie te bevestigen, werd BrdU toegevoegd aan de media. Na incubatie met BrdU gedurende 2 uur werden cellen direct gekleurd met anti-BrdU (een merker voor proliferatie) en anti-Nestin (een marker voor neurale stamcellen) antilichamen, wat aangeeft dat SCZ-aNSCs actief prolifererende en behoud van de belangrijkste eigenschappen van stamcellen (Figuur 2B). Daarom deden ze niet exhibit merkers voor gedifferentieerde cellen, zoals EGFR (uitgedrukt in transiënt amplificeren cellen) en DCX (uitgedrukt in neuroblasts) (figuur 2C).
Om de meervoudige differentiatie potentieel van SCZ-aNSCs te bevestigen, werden groeifactoren verwijderd uit het kweekmedium. Na 6 dagen werden de cellen immunogekleurd met verschillende fabrikanten van gedifferentieerde cellen. Om de verschillende nakomelingen van aNSCs, markers voor neuronen (Tuj1), astrocyten (GFAP), en oligodendrocyten (O4) toegepast vertonen; al deze celtypen werden gegenereerd uit de SCZ-aNSCs (figuur 3).
Figuur 1: Isolatie van de regio SCZ en de vorming van de neurosphere. (A) Procedure voor de dissectie van de regio SCZ van de volwassen hersenen van muizen. Om de cultuur van de SCZ-AnSC, een 8 weken oude muis hersenen wordt geplaatst op een brein matrix (1 mm intervallen). Na het snijden, 1 mm hersenplakjes de SCZ gebied (2-3 mm van bregma) werden uitgesneden (aangegeven door de rode stippellijn) inbegrepen. (B) Neurosfeer formatie. Acht dagen na de in vitro cultuur, primaire neurospheres (passage 0) werden gevormd en gepasseerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Onderhoud van de SCZ-aNSCs als een monolaag cultuur. (A) Een dag na het zaaien van de cellen ontleed, SCZ-aNSCs werden bevestigd en uitgebreid op een gecoate schaal in een monolaag wijze (links). Drie dagen na het onderhoud, werd het aantal SCZ-aNSCs toegenomen (rechts). (B) Immunokleuring met BrdU (rood, een marker voor prolifererende cellen), Nestin (groen, een marker voor neurale stamcellen), en Hoechest33343 (blauw, een marker voor kernen). (C) Immunokleuring met neurale stamcellen / voorlopercellen cel markers Nestin (rood, een marker voor type B neurale stamcellen), EGFR (groen, een marker voor het type C-transient versterken cellen), en DCX (blauw, een marker voor type A neuroblasts). Kernen werden tegengekleurd met Hoechest33343 (wit). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Immunokleuring van de gedifferentieerde cellen van de SCZ-aNSCs. Immunokleuring met differentiatie markers Tuj1 (groen, een marker voor immature neuronen), O4 (rood, een marker voor oligodendrocyten) en GFAP (schreeuwenow, een marker voor astrocyten). Vergrote afbeeldingen worden getoond als inzetstukken. Hoechest33343 (blauw) werd gebruikt voor tegenkleuring de kernen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol om NSC's te genereren uit de volwassen muis SCZ en te handhaven voor diverse toepassingen. Er zijn drie cruciale stappen voor het vaststellen van de in vitro kweeksysteem die nodig zijn om te zuiveren en uit te breiden SCZ-NSC. Ten eerste is het belangrijk dat de regio SCZ precies wordt doorsneden van andere potentiële neurogene regio's (Figuur 1B). Dik en nauwkeurige gedeelten met de SCZ gebieden werden verkregen met een 1 mm interval hersenen matrix en vervolgens werd een fijne naald gebruikt voor de micro-ontleding van de SCZ uit andere corticale gebieden (figuur 1A). Bij non-NSC's van naburige weefsels, zoals de cerebrale cortex, zijn gekweekt met SCZ-aNSCs, katastrofisch overlijden, die de levensvatbaarheid en bol vorming van SCZ-NSC 16-18,22 negatief beïnvloedt. De staartvin SCZ (2-3 mm achter bregma) werd bevestigd als de beste regio voor het genereren van verschillende SCZ-aNSCs. Ten tweede, de appropriate enzymatische behandeling in het oogsten en passage stappen is van cruciaal belang voor het bereiken van een hoog rendement van de cellen. Dispase II en papaïne effectiever waren voor het isoleren aNSCs dan trypsine. Dissociatie van cellen voor passage met dissociatie buffer in plaats van trypsine verder verbeterde levensvatbaarheid 19. Mechanische dissociatie en wrijven met een pipet moet minimaal zijn. Ten derde wordt een cel zeef het algemeen gebruikt in primaire kweeksystemen om cellulaire vuil te verwijderen na weefsel spijsvertering. Vanwege de lokalisatie van SCZ-aNSCs deze cellen worden na het breken van witte stof van enzymdigestie en mechanische trituratie. Tijdens filtratie met een zeef cel, zou een aanzienlijke hoeveelheid cellen verloren. Daarom is het kweken van SCZ-aNSCs zonder gebruik van een cel zeef is een betere manier om een hoge opbrengst van cellen te krijgen.
Terwijl zowel neurosfeerculturen en monolaag culturen worden toegepast op het behoud van NSC, een beperking van de neurobol cultuur is dat enkele NSCs los na het splitsen willekeurig kunnen worden samengevoegd. De aggregatie resultaten in verschillende maten van neurospheres. Wanneer de grootte van een neurosfeer een bepaalde kritische waarde bereikt, de neurosphere groeit als een heterogene structuur, vanwege een gebrek aan voedingsstoffen, groeifactoren, en zuurstof bij de kern 20. Bovendien neurospheres met grote maten zijn niet gemakkelijk gescheiden in dissociatie buffer en vereisen een langere enzymatische behandeling tijden met uitgebreide mechanische trituratie, wat leidt tot lagere levensvatbaarheid van de cellen. Daarom wordt de monolaag cultuur systeem aan te raden om SCZ-aNSCs handhaven door middel van meerdere passages. In een monolaag kweeksysteem worden aNSCs stabiel gehandhaafd als NSC (type B) zonder spontane differentiatie tot cellen bedoeld, zoals progenitors (type C en A) (Figuur 3A). SCZ-aNSCs werden gepasseerd voor langere tijd, <5 passages in een neurosphere formaat en> 10 passages als een monolaag. Dit is tegensistent met eerdere resultaten, die suggereren dat de monolaagkweek systeem houdt NSC in vitro langdurige kweken 21. De prolifererende snelheid verlaagd, en het gedeelte van stervende cellen toegenomen 5 passages. Extended passage van invloed op de multipotentie en neuronale differentiatie met een verhoogde chromosoomafwijking 22. Derhalve tot uitgebreide passage effecten te vermijden, wordt aanbevolen vroege passage (<passage 5) cellen gebruiken voor proliferatie en differentiatie analyse. Hoewel de mogelijkheden voor zelf-vernieuwing van SCZ-aNSCs is vergelijkbaar met SVZ-aNSCs, werd minder neuronale differentiatie getoond in SCZ-aNSCs 9.
Werkwijzen voor het isoleren van aNSCs neurogene gebieden van de volwassen hersenen, waaronder de SVZ en dentate gyrus (DG), zijn vastgesteld 22. Hoewel dergelijke protocollen de isolatie en kweek van aNSCs in vitro gestimuleerd, zijn er verscheidene beperkingen op het verkrijgen van een groot aantalcellen. Veel protocollen maken gebruik van een hersenweefsel chopper dat het verlies van hersenweefsel tijdens de snij procedure kan veroorzaken. Een andere benadering voor aNSCs isoleren van neurogene regio's maakt gebruik van een coronale snede door de hersenen met behulp van een scalpel. Dit wordt gevolgd door het micro-dissectie van de SVZ of DG langs de longitudinale spleet 23. De aanwezigheid van andere hersengebieden ook het andere celtypen de ANSC cultuur, die de levensvatbaarheid van de cellen in vitro invloed kunnen besmetten. Met het huidige protocol kunnen vele monsters worden beheerd in een enkel experiment, waaronder controles versus verschillende experimentele groepen. Ook het snijden met behulp van een brein matrix is superieur aan een brein hakken hulpmiddel, moet het mogelijk worden voor het bereiken van NSCs uit verschillende gebieden van de hersenen met een hoge opbrengst cel. Het maakt ook de vergelijking van aNSCs uit verschillende gebieden van de hersenen dezelfde.
Transplantatie en engineering van endogene NSC hebben considere geweestd als mogelijke strategieën voor stamceltherapie. Hiervoor in vitro studies over de kenmerken van aNSCs moet worden uitvoerig onderzocht. Daarom zal het opzetten van een goed gekarakteriseerd in vitro kweeksysteem nuttig voor het bevorderen van de toepassing van NSC zijn. In deze cultuur systeem, de stamcellen eigenschappen van SCZ-aNSCs werden goed onderhouden, zoals blijkt uit zelf-vernieuwing en multiple-lineage differentiatie onder de juiste omstandigheden. Daarom kan dit kweeksysteem worden gebruikt voor de uitbreiding van SCZ-aNSCs voor biologisch onderzoek en therapeutische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium components | |||
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | +L-glutamin, +Sodium bicarbonate |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Growth factor | |||
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| EGF | Gibco | PHG0313 | |
| Buffer | |||
| PBS (10x) | BIOSOLUTION | BP007a | 1x dilution |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| Dissociattion buffer | |||
| Dispase II | Roche | 04-942-078-001 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| Accutase | ICT | AT-104 | |
| Tool | |||
| Fine forceps | WPI | 555229F | |
| Scissors | Storz | E3321-C | |
| Brain matrix (1 mm) | RWD | 68707 | |
| Double-edged razor | DORCO | ST-300 | |
| 30 G needle | SUNGSHIM | N1300 | |
| Materials | |||
| 15 ml tubes | SPL | 50015 | |
| 50 ml tubes | SPL | 50050 | |
| 35 mm dish | SPL | 10035 | Petri dish |
| 100 mm dish | SPL | 10090 | Petri dish |
| Cover slip (18 mm) | Deckglaser | 111580 | |
| 12 well dish | SPL | 32012 | non-coating |
| 6 well dish | SPL | 32006 | non-coating |
| Coating materials | |||
| PLO | Sigma | P4957 | 0.01% |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | 10 mg/ml |
| Primary antibodies | |||
| Nestin | Millipore | MAB353 | mouse (1:1,000) |
| EGFR | Abcam | ab2430 | rabbit (1:1,000) |
| DCX | Santa Cruz | SC8066 | goat (1:500) |
| Tuj1 | Sigma | T2200 | rabbit (1:2,000) |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | rat (1:1,000) |
| O4 | Millipore | MAB345 | mouse (1:500) |
| BrdU | Abcam | ab6326 | Rat (1:500) |
| Secondary antibodies | |||
| anti-mouse 488 | Invitrogen | A21202 | 1:500 |
| anti-mouse cy3 | Jackson | 715-165-151 | |
| anti-mouse 647 | Jackson | 715-606-150 | |
| anti-rabbit 488 | Alexa | A21206 | |
| anti-rabbit cy3 | Jackson | 711-165-152 | |
| anti-rabbit 647 | Jackson | 711-605-152 | |
| anti-goat 488 | Alexa | A11055 | |
| anti-goat cy3 | Jackson | 705-165-147 | |
| anti-goat 647 | Invitrogen | A21447 | |
| anti-rat 488 | Invitrogen | A21208 | |
| anti-rat cy3 | Jackson | 712-166-150 | |
| anti-rat 647 | Jackson | 712-605-153 | |
| Immunostaining materials | |||
| BSA | Millipore | 82-100-6 | 3% BSA with 0.1% Triton X-100 in PBS |
| Triton X-100 | usb | 22686 | |
| 4% PFA | Biosesang | P2031 | |
| Hoechest33342 | Life Technology | H3570 | Dye for staining nuclei |
References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Developmental biology. 175, 1-3 (1996).
- Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons. PloS one. 2, e388 (2007).
- Alvarez-Buylla, A., Garcia-Verdugo, J. M.
- Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Hippocampus. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7, a018812 (2015).
- Gage, F. H.
- Seri, B., et al. Composition and organization of the SCZ: a large germinal layer containing neural stem cells in the adult mammalian brain. Cereb Cortex. 16 Suppl 1, i103-i111 (2006).
- Kim, W. R., et al. Evidence for the spontaneous production but massive programmed cell death of new neurons in the subcallosal zone of the postnatal mouse brain. The European journal of neuroscience. 33, 599-611 (2011).
- Kim, H. J., Kim, J. Y., Sun, W. Age-dependent changes in the subcallosal zone neurogenesis of mice. Neurochemistry international. 61, 879-884 (2012).
- Kim, J. Y., et al. Promotion of Cortical Neurogenesis from the Neural Stem Cells in the Adult Mouse Subcallosal Zone. Stem Cells. , (2015).
- Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature medicine. 9, 439-447 (2003).
- Gould, E. How widespread is adult neurogenesis in mammals? Nature reviews. Neuroscience. 8, 481-488 (2007).
- Gage, F. H., Temple, S. Neural stem cells: generating and regenerating the brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
- Shaker, M. R., Kim, J. Y., Kim, H., Sun, W. Identification and characterization of secondary neural tube-derived embryonic neural stem cells in vitro. Stem cells and development. 24, 1171-1181 (2015).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular neurobiology. 34, 153-161 (2006).
- Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14506-14511 (2002).
- Richards, L. J., Kilpatrick, T. J., Bartlett, P. F. De novo generation of neuronal cells from the adult mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 8591-8595 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Epidermal and fibroblast growth factors behave as mitogenic regulators for a single multipotent stem cell-like population from the subventricular region of the adult mouse forebrain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 3287-3297 (1999).
- Wachs, F. P., et al. High efficacy of clonal growth and expansion of adult neural stem cells. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 949-962 (2003).
- Xiong, F., et al. Optimal time for passaging neurospheres based on primary neural stem cell cultures. Cytotechnology. 63, 621-631 (2011).
- Lee, S. W., et al. Optimization of Matrigel-based culture for expansion of neural stem cells. Animal Cells and Systems. 19, 175-180 (2015).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature protocols. 7, 2005-2012 (2012).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. JoVE (Journal of Visualized Experiments). , e51225 (2014).
