Protocol
1. Preparazione dei Materiali e terreno di coltura
- Per la dissezione e la dissociazione del SCZ, avvolgere la matrice del cervello, lama a doppio taglio di rasoio, e pinze con un foglio di alluminio, e poi sterilizzare in autoclave.
- Preparare 50 ml di tampone PBS freddo per lavare l'intero cervello di topo.
- Impostare un microscopio dissezione e preparare gli strumenti chirurgici necessari per la dissezione del cervello (forbici e pinze in autoclave) e l'isolamento del (ml siringa da 1, 30 ago G, matrice del cervello, e una pinza sottile) SCZ.
- Preparazione di N2 Media:
- Preparare F-12 / DMEM (+ L-Glutamin, + bicarbonato di sodio), media con 2% B27, 1% integratori N2, e l'1% penicillina-streptomicina.
Nota: Il mezzo di crescita è costituito da N2 medie e fattori di crescita (20 ng / mL purificata fattore di crescita epidermico (EGF) e 20 ng / mL di base del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF2)).
- Preparare F-12 / DMEM (+ L-Glutamin, + bicarbonato di sodio), media con 2% B27, 1% integratori N2, e l'1% penicillina-streptomicina.
- Preparare un tampone di digestione (40 unità / ml papaina, 2,4 unità / ml dispase II, e 2% di penicillina-streptomicina in PBS) per la digestione dei tessuti.
- Preparazione del piatto del rivestimento e Coverslip:
- Preparare poli-L-ornitina (OLP; 0,01%) e laminina (10 mg / ml disciolti in DH 2 O). Per cappotto 6 pozzetti per la manutenzione del SCZ-aNSCs come un monostrato o 18 coprioggetto mm per immunocolorazione, incubare con OLP notte a 4 ° C. Poi lavare 3 volte con DH 2 O. Lasciare le piastre e coprioggetti ad asciugare dopo l'ultimo lavaggio.
- Successivamente, incubare le piastre con laminina notte a 4 ° C. Poi, lavarli 3 volte con DH 2 O.
Attenzione: Non asciugare la laminina, che interesserà l'adesione cellulare.
Nota: Le soluzioni di rivestimento possono essere riutilizzati per 3 volte.
2. Isolamento e la dissociazione della Adult SCZ
- Prima della preparazione della cultura, posizionare la matrice del cervello e rasoio a doppio taglio sul ghiaccio.
Nota: Non congelare la matrice cerebrale, perché il brain potrebbe allegare alla stessa. - Sacrifica un mouse (8 settimane) di CO 2 asfissia o dislocazione cervicale.
- Tagliare la testa con le forbici affilate dopo la spruzzatura il 70% di etanolo. Per immobilizzare la testa, tenere entrambi i lati della testa ermeticamente. Tagliare la pelle con le forbici sulla linea mediana in una direzione caudale-rostrale. Questo promuove la rimozione completa della pelle dal cranio.
- Rimuovere la parte caudale del cranio (posteriore al lambda) prima, e quindi inserire la pinza tra il cranio e il cervello in posizione dorsale linea mediana. Afferra il sinistro (o destro) osso parietale e con attenzione buccia fuori. Ripetere questa procedura per la rimozione dell'altro osso parietale.
Nota: disconnessione del nervo ottico e la rimozione delle meningi dal cervello renderlo più facile da staccare il cervello dal cranio. - Trasferire il cervello a tampone PBS freddo (25 ml) e sciacquarlo due volte per rimuovere il sangue in eccesso.
- Posizionare il cervello nella matrice cervello su ghiaccio e make tagli coronali per ottenere 1 mm fette spesse. Trasferire le fettine cerebrali (1 mm) contenenti le regioni SCZ che si trovano nella parte posteriore del cervello ad un PBS freddo in un piatto di plastica Petri da 35 mm.
Attenzione: Al fine di ottenere un piano parallelo di sezioni coronali, verificare che la fessura cervello è posizionato sulla linea mediana della matrice cerebrale; è fondamentale per evitare variazioni inutili sezioni.
Nota: Ottenere fettine di cervello a 2-3 mm posteriormente al bregma; ciò consente la separazione del SCZ dalla SVZ. - Sotto il microscopio da dissezione con un basso ingrandimento, micro-sezionare il SCZ dalla zona sostanza bianca della corteccia e ippocampo con un piegato 6,9 30G ago. Quindi, rimuovere le regioni della corteccia sopra la SCZ. Posizionare la regione SCZ sezionato dalle fette in un piatto di plastica 35 millimetri di Petri sul ghiaccio senza PBS freddo.
Nota: La contaminazione delle regioni in più contengono neuroni maturi potrebbe influenzare la vitalità delle aNSCs e neurosfere formazione Because essi subiscono la morte delle cellule in condizioni di coltura ANSC. - Utilizzando un piegato 30 ago G, tagliare immediatamente i tessuti sezionati in piccoli pezzi.
Nota: Se è necessario un tempo più lungo per sezionare il tessuto SCZ, immergere i tessuti dissezionati in PBS freddo prima di tagliare. - Risospendere il tessuto tritato con 1 ml di tampone di digestione, trasferire il tessuto ad una provetta da 15 ml contenente 2 ml di tampone di digestione, e incubare per 30 min in un bagno d'acqua a 37 ° C.
Nota: Agitare il tubo ogni 10 minuti per amalgamare bene.
3. Subcallosal Zone-derivato Cultura adulti cellule staminali neurali
- Toccare il tubo leggermente di dissociare il tessuto digerito, e poi centrifugare la provetta a 145 g per 5 min. Eliminare il surnatante, ri-sospeso il tessuto digerito con 1 ml di terreno di pre-riscaldato N2 per lavare il buffer di digestione, e pipettare delicatamente la soluzione del campione ad un massimo di 5 volte con una pipetta P1000.
Nota: Over-triturazione con una strettapipetta punta può diminuire la vitalità delle cellule e la successiva crescita. - Centrifugare la provetta a 145 xg per 5 min. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 1 ml di terreno N2.
- Preparare 1 ml di terreno N2 in un piatto non rivestito da 6 pozzetti e aggiungere 1 ml di cellule sospese per fare un volume finale di 2 ml.
- Aggiungere EGF (20 ng / ml) e bFGF (20 ng / ml) in ogni pozzetto. Agitare delicatamente il piatto cultura 6 pozzetti a mano per mescolare i fattori di crescita aggiunti con le cellule placcato. Mantenere il 6 pozzetti in un incubatore CO 2 37 ° C e 5%.
- Aggiungere EGF (20 ng / ml) e bFGF (20 ng / ml) ad ogni pozzetto ogni giorno per 8 giorni. Ogni terzo giorno, aggiungere 200 ml di mezzi di N2 per mantenere la approssimata del volume 2 ml del mezzo.
4. Passaging di NSC come Neurosfere e colture monostrato
- Raccogliere le neurosfere e trasferirli in un nuovo tubo da 15 ml.
Nota: Il numero di neurosfere (> 50 micron di diametro) per bene dalla SCZ di un singolo cervello di topo era 64,3 ± 7,31, che era inferiore a quella della SVZ (190.5 ± 6,33) 9. - Incubare le neurosfere con 0,5 ml di tampone di dissociazione per 5 min in un bagno d'acqua a 37 ° C per dissociare le neurosfere in singole cellule. neurosfere primarie possono essere dissociate in singole cellule e mantenuto per diversi passaggi come neurosfere o monostrato culture.
Nota: Espansione SCZ-aNSCs come un monostrato è superiore a neurosfere perché SCZ-aNSCs possono essere diversi passaggi> 10 volte in un formato cultura monostrato, ma <5 volte in un formato cultura neurosfere.
Attenzione: SCZ-aNSCs esporre forte aggregazione, ed è difficile per loro dissociarsi in singole cellule. Così, il formato la cultura neurosfere non è raccomandato per l'espansione delle cellule di routine. - pipettare delicatamente la soluzione campione su e giù con una pipetta P1000 inferiore a 5 volte e centrifugare la provetta a 145 xg per 5 min. Eliminare il surnatante e ri-Sutrascorrere le neurosfere con 1 ml di terreno N2.
Nota: Nel corso triturazione con una stretta punta della pipetta può diminuire la vitalità cellulare e la successiva crescita. - Per contare le cellule, fare una miscela 1: 1 di sospensione cellulare (10 microlitri) e il trypan blue soluzione 0,4%, e poi contare il numero di cellule vive in un hematocytometer. Dopo rivestimento di un 6-pozzetti con OLP / laminina, piastra le cellule a 2,5 x 10 5 cellule / ml con 2 ml di terreno N2 per ogni bene.
Nota: Le variazioni di densità delle cellule possono influenzare la loro condizione e potenziale di differenziazione. - Mantenere le SCZ-aNSCs con un trattamento giornaliero di fattori di crescita (2 ml, 20 ng / ml) per 5 giorni, e il passaggio di loro.
5. La differenziazione di Subcallosal Zone-derivati cellule staminali adulte neurali
- ANSCs piatto sulla un'OLP / laminina rivestite coprioggetto 18 mm con filetto 1 x 10 5 cellule / ml in 1 ml N2 con fattori di crescita (20 ng / ml) per la differenziazione dei SCZ-aNSCs.
- Il giorno successivo,quando le cellule sono saldamente attaccati al vetrino, scambiare il mezzo di crescita con N2 per rimuovere i fattori di crescita.
- Dopo 6 giorni, lavare le cellule differenziate con 1 ml di PBS per rimuovere i detriti cellulari e fissarle per immunocolorazione.
Nota: BrdU può essere incorporato nel DNA di nuova sintesi di cellule proliferanti. Pertanto, se desiderato, BrdU (10 ug / ml) può essere aggiunto a vivere cellule prima del fissaggio delle cellule.
6. cellule staminali neurali Immunocolorazione adulti e differenziata Progenitori
- Per immunostaining, lavare le cellule con PBS e fissarle con 4% PFA per 20 minuti a temperatura ambiente.
Attenzione: PFA è altamente tossico; evitare il contatto con la pelle e gli occhi. - Rimuovere il 4% PFA, lavare le cellule fissate con PBS 3 volte, e poi conservarli a 4 ° Cuntil sono necessari per immunocolorazione.
- Incubare le cellule sul vetrino con una soluzione bloccante (3% di albumina sierica bovina e 0,1% Triton X-100 in 1x PBS) per almeno 30 minuti a temperatura ambiente.
- Preparare gli anticorpi primari in soluzione di blocco fresco e incubare i campioni notte a 4 ° C.
- Immunocolorazione i aNSCs
- Macchiare le aNSCs utilizzando anti-Nestin e anticorpi anti-BrdU. Prima di fissazione, aggiungere 20 mg di BrdU alle aNSCs e incubare per 2 ore. Eseguire il passo denaturazione usando 2 N HCl per 20 min a 37 ° CBefore eseguire il passo di blocco.
- Immunocolorazione i progenitori differenziati:
- Usare gli anticorpi anti-proteina silicea fibrillare gliale (GFAP) anti-O4, anti-bIII-tubulina, e per etichettare i progenitori differenziati.
- Immunocolorazione i aNSCs
- Lavare i campioni con PBS 3 volte e incubare con anticorpi secondari coniugati ai coloranti fluorescenti (1: 500) in soluzione bloccante per 30 minuti a temperatura ambiente. Poi, lavare i campioni 3 volte con PBS.
Nota: utilizzare anticorpi secondari che corrispondono i padroni di casa del primarioanticorpi. Hoechest33343 (1: 2.000) è utilizzato per la colorazione nucleare. - Aggiungere la soluzione di montaggio di un vetrino e procedere con il montaggio. Osservare e immagine campione su un microscopio confocale a più lunghezze d'onda: FITC (488 nm), Cy3 (543 nm), Cy5 (647 nm), e Hoechest33343 (405 nm).
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Representative Results
Definizione del sistema di coltura per aNSCs dalla regione neurogena ignoto è essenziale per la comprensione di queste cellule e di sviluppare il loro potenziale utilizzo nella riparazione del cervello 12. È noto che le NSC a diversi stadi di sviluppo o in regioni diverse si comportano in modo diverso 3,4. Recentemente, è stato riportato che le cellule SCZ derivate presentano potenziali differenziali di differenziazione neuronale in vivo e in vitro rispetto alle cellule SVZ-derivate 7-9. Pertanto, per isolare precisamente ciascuna regione neurogenica, fette di cervello che includono il SCZ stati sezionati utilizzando una matrice cerebrale di 1 mm (Figura 1A). Dopo 8 giorni di coltura con fattori di crescita, aNSCs derivati dalla SCZ possono formare neurosfere, in cui le cellule possono essere mantenute in seguito (Figura 1B).
Dal momento che un sottoinsieme di cellule staminali neurali nelle neurosfere può essere spontaneously differenziato 13, un sistema di coltura monostrato è anche utile per il mantenimento della popolazione relativamente omogenea di SCZ-aNSCs. I fattori di crescita ed enzimi di dissociazione come la tripsina non permeano facilmente in profondità all'interno del neurosfere 14,15. colture monostrato offrono le condizioni più anche per l'espansione delle cellule staminali neurali. Da neurosfere primarie, SCZ-aNSCs erano dissociate in singole cellule da un trattamento di buffer di digestione. Un giorno dopo la semina cellulare, aNSCs erano attaccati alla piastra rivestita e la proliferazione delle cellule esposte (Figura 2A). Per confermare la loro potenza della proliferazione, BrdU è stato aggiunto nella media. Dopo l'incubazione con BrdU per 2 ore, le cellule sono state prontamente colorati con anti-BrdU (un marker di proliferazione) e anti-Nestin (un marker per le cellule staminali neurali) di anticorpi, indicando che SCZ-aNSCs sono attivamente proliferando e mantenendo le proprietà chiave di Le cellule staminali (Figura 2b). Di conseguenza, non hanno exhibit marcatori per cellule differenziate, come EGFR (espressi in cellule transientemente-amplificazione) e DCX (espressa in neuroblasti) (Figura 2C).
Per confermare il potenziale di differenziazione multiplo di SCZ-aNSCs, fattori di crescita sono stati rimossi dal terreno di coltura. Dopo 6 giorni, le cellule sono state immunostained con i vari responsabili di cellule differenziate. Per esporre le diverse progenie di aNSCs, marcatori per i neuroni (TUJ1), astrociti (GFAP), e oligodendrociti (O4) sono stati impiegati; tutti questi tipi cellulari sono stati generati dal SCZ-aNSCs (Figura 3).
Figura 1: Isolamento della regione SCZ e formazione del neurosfere. (A) Procedimento per la dissezione della regione SCZ dal cervello di topo adulto. Per la cultura SCZ-ANSC, a 8 settimane di età cerebrale mouse è posizionato su una matrice cerebrale (1 mm intervalli). Dopo sezionamento, 1 mm fettine cerebrali che comprendeva la regione SCZ (2-3 mm dal bregma) sono stati sezionato (indicata dalla linea tratteggiata rossa). Formazione (B) neurosfere. Otto giorni dopo la coltura in vitro, neurosfere primarie (passaggio 0) si sono formati e diversi passaggi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Manutenzione delle SCZ-aNSCs come cultura monostrato. (A) Un giorno dopo la semina delle cellule sezionato, SCZ-aNSCs fosse collegata ed espanso su un piatto rivestito in modo monostrato (a sinistra). Tre giorni dopo la manutenzione, è stato aumentato il numero di SCZ-aNSCs (a destra). (B) Immunocolorazione con BrdU (rosso, un marcatore per cellule proliferanti), Nestin (verde, un marker per le cellule staminali neurali), e Hoechest33343 (blu, un marker per nuclei). (C) immunocolorazione con staminali neurali / marcatori di cellule progenitrici Nestin (rosso, un marker per le cellule staminali di tipo B neurali), EGFR (verde, un marker per le cellule transitori di amplificazione di tipo C), e DCX (blu, un marker di tipo A neuroblasti). I nuclei sono stati di contrasto con Hoechest33343 (bianco). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immunocolorazione delle cellule differenziate dalle SCZ-aNSCs. Immunocolorazione con marcatori di differenziazione TUJ1 (verde, un marcatore per i neuroni immaturi), O4 (rosso, un marker per gli oligodendrociti), e GFAP (urloOW, un marker per astrociti). immagini ingrandite sono mostrati come inserti. Hoechest33343 (blu) è stato utilizzato per la contro-colorazione dei nuclei. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo documento descrive un protocollo dettagliato per generare NSCs dal SCZ topo adulto e mantenerli per varie applicazioni. Ci sono tre passi fondamentali per determinare lo vitro sistema di cultura necessaria per purificare ed espandere SCZ-NSC. In primo luogo, è importante assicurare che la regione SCZ è proprio sezionato da altri potenziali regioni neurogena (Figura 1B). Sezioni spesse e precisi contenenti le regioni SCZ sono stati ottenuti con una matrice cerebrale intervallo di 1 mm, e quindi un ago è stato utilizzato per il micro-dissezione del SCZ da altre regioni corticali (Figura 1A). Quando non NSC da tessuti adiacenti, come la corteccia cerebrale, sono messi in coltura con SCZ-aNSCs, si verifica la morte catastrofica, che lede la vitalità e la sfera-formazione di SCZ-NSC 16-18,22. Il caudale SCZ (2-3 mm posteriormente al bregma) è stato confermato come il migliore regione per la generazione di distinte SCZ-aNSCs. In secondo luogo, il approptrattamento enzimatico riate nei passaggi di raccolta e passaging è fondamentale per ottenere un alto rendimento di cellule. Dispasi II e papaina sono stati più efficaci per isolare aNSCs di tripsina. La dissociazione di cellule per passaging con tampone di dissociazione, invece di tripsina migliorato la loro vitalità 19. dissociazione meccanica e triturazione con una pipetta dovrebbe essere minimo. Terzo, un filtro cella viene generalmente utilizzato in sistemi di coltura primaria per rimuovere i detriti cellulari dopo la digestione tessutale. Tuttavia, a causa della localizzazione delle SCZ-aNSCs, queste cellule si ottengono dopo la rottura della sostanza bianca mediante digestione enzimatica e triturazione meccanica. Durante la filtrazione con un filtro di cellule, una notevole quantità di cellule sarebbe perso. Pertanto, la coltura SCZ-aNSCs senza utilizzare un colino cellula è un modo migliore per ottenere un alto rendimento di cellule.
Mentre entrambi colture di neurosfere e colture monostrato possono essere applicati al mantenimento della NSC, uno limitazione della neurocultura sfera è che i singoli NSC dissociati dopo la divisione può essere aggregato in modo casuale. I risultati di aggregazione di diverse dimensioni di neurosfere. Quando la dimensione di un neurosfere raggiunge un certo valore critico, la neurosfere cresce come una struttura eterogenea, a causa di una mancanza di nutrienti, fattori di crescita, e ossigeno al cuore 20. Inoltre, neurosfere con grandi dimensioni non sono facilmente dissociate con tampone di dissociazione e richiedono tempi di trattamento più lungo enzimatici con una vasta triturazione meccanica, con conseguente minore vitalità cellulare. Pertanto, il sistema di coltura monostrato raccomanda di mantenere SCZ-aNSCs attraverso passaggi multipli. In un sistema di coltura monostrato, aNSCs sono stabilmente mantenuti come NSC (tipo B) senza differenziazione spontanea in cellule specifici, quali progenitori (tipo C e A) (Figura 3A). SCZ-aNSCs sono stati diversi passaggi per lunghi periodi, <5 passaggi in un formato neurosfere e> 10 passaggi come un monostrato. Questo è consstente con i risultati precedenti, che suggeriscono che il sistema di coltura monostrato mantiene NSC in vitro in colture a lungo termine 21. Tuttavia, la velocità proliferanti diminuita, e la porzione di cellule morenti aumentato più di 5 passaggi. Passaging estesa colpisce il multipotenza e la differenziazione neuronale con maggiore aberrazione cromosomica 22. Pertanto, per evitare effetti passaging estese, si raccomanda di utilizzare il passaggio precoce (<passaggio 5) cellule per la proliferazione e la differenziazione analisi. Anche se il potenziale di auto-rinnovamento delle SCZ-aNSCs è simile a SVZ-aNSCs, la differenziazione neuronale meno è stato mostrato in SCZ-aNSCs 9.
I metodi per isolare aNSCs dalle regioni neurogena del cervello adulto, compreso il SVZ e giro dentato (DG), sono stati stabiliti 22. Sebbene tali protocolli hanno promosso l'isolamento e la coltura di aNSCs in vitro, esistono diverse limitazioni per ottenere un elevato numero dicellule. Molti protocolli utilizzano un chopper tessuto cerebrale che può causare la perdita di tessuto cerebrale durante la procedura di taglio. Un altro approccio per isolare aNSCs dalle regioni neurogena utilizza un taglio coronale attraverso il cervello utilizzando un bisturi. Questo è seguito dal micro-dissezione del SVZ o della DG lungo la fessura longitudinale 23. La presenza di altre regioni del cervello può causare altri tipi di cellule di contaminare la cultura ANSC, che potrebbe influenzare la vitalità delle cellule in vitro. Con il protocollo attuale, molti campioni diversi possono essere gestiti in un singolo esperimento, compresi i controlli contro una varietà di gruppi sperimentali. Inoltre, affettare utilizzando una matrice cervello è superiore ad uno strumento di taglio del cervello, in quanto consente il conseguimento di NSCs da diverse regioni del cervello con una resa elevata cellulare. Esso consente inoltre il confronto delle aNSCs provenienti da diverse regioni del cervello stesso.
Trapianti e ingegnerizzazione di NSC endogeni sono stati considered come possibili strategie per la terapia con cellule staminali. Per questo, studi in vitro sulle caratteristiche di aNSCs dovrebbero essere ampiamente esplorato. Pertanto, la creazione di un ben caratterizzato sistema di coltura in vitro sarà utile per promuovere l'applicazione di NSC. In questo sistema di coltura, le proprietà di cellule staminali di SCZ-aNSCs erano ben mantenute, come evidenziato da auto-rinnovamento e la differenziazione multi-lignaggio in condizioni appropriate. Pertanto, questo sistema di coltura può essere utilizzato per l'espansione del SCZ-aNSCs per studi biologici e applicazioni terapeutiche.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium components | |||
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | +L-glutamin, +Sodium bicarbonate |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Growth factor | |||
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| EGF | Gibco | PHG0313 | |
| Buffer | |||
| PBS (10x) | BIOSOLUTION | BP007a | 1x dilution |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| Dissociattion buffer | |||
| Dispase II | Roche | 04-942-078-001 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| Accutase | ICT | AT-104 | |
| Tool | |||
| Fine forceps | WPI | 555229F | |
| Scissors | Storz | E3321-C | |
| Brain matrix (1 mm) | RWD | 68707 | |
| Double-edged razor | DORCO | ST-300 | |
| 30 G needle | SUNGSHIM | N1300 | |
| Materials | |||
| 15 ml tubes | SPL | 50015 | |
| 50 ml tubes | SPL | 50050 | |
| 35 mm dish | SPL | 10035 | Petri dish |
| 100 mm dish | SPL | 10090 | Petri dish |
| Cover slip (18 mm) | Deckglaser | 111580 | |
| 12 well dish | SPL | 32012 | non-coating |
| 6 well dish | SPL | 32006 | non-coating |
| Coating materials | |||
| PLO | Sigma | P4957 | 0.01% |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | 10 mg/ml |
| Primary antibodies | |||
| Nestin | Millipore | MAB353 | mouse (1:1,000) |
| EGFR | Abcam | ab2430 | rabbit (1:1,000) |
| DCX | Santa Cruz | SC8066 | goat (1:500) |
| Tuj1 | Sigma | T2200 | rabbit (1:2,000) |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | rat (1:1,000) |
| O4 | Millipore | MAB345 | mouse (1:500) |
| BrdU | Abcam | ab6326 | Rat (1:500) |
| Secondary antibodies | |||
| anti-mouse 488 | Invitrogen | A21202 | 1:500 |
| anti-mouse cy3 | Jackson | 715-165-151 | |
| anti-mouse 647 | Jackson | 715-606-150 | |
| anti-rabbit 488 | Alexa | A21206 | |
| anti-rabbit cy3 | Jackson | 711-165-152 | |
| anti-rabbit 647 | Jackson | 711-605-152 | |
| anti-goat 488 | Alexa | A11055 | |
| anti-goat cy3 | Jackson | 705-165-147 | |
| anti-goat 647 | Invitrogen | A21447 | |
| anti-rat 488 | Invitrogen | A21208 | |
| anti-rat cy3 | Jackson | 712-166-150 | |
| anti-rat 647 | Jackson | 712-605-153 | |
| Immunostaining materials | |||
| BSA | Millipore | 82-100-6 | 3% BSA with 0.1% Triton X-100 in PBS |
| Triton X-100 | usb | 22686 | |
| 4% PFA | Biosesang | P2031 | |
| Hoechest33342 | Life Technology | H3570 | Dye for staining nuclei |
References
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