Abstract
L'oocita di Xenopus come un sistema di espressione eterologa di proteine, è stato descritto da Gurdon et al. 1 ed è stato ampiamente utilizzato dalla sua scoperta (Riferimenti 2 - 3, e riferimenti ivi). Una caratteristica che rende l'ovocita attraente per l'espressione canale estero è la scarsa abbondanza di canali ionici endogeni 4. Questo sistema di espressione è dimostrato utile per la caratterizzazione di molte proteine, tra i quali canali ionici ligando-dipendenti.
L'espressione dei recettori GABA in oociti di Xenopus e la loro caratterizzazione funzionale è descritto qui, compreso l'isolamento degli ovociti, microiniezioni con cRNA, la rimozione di strati di cellule follicolari e soluzione cambia veloci esperimenti elettrofisiologici. Le procedure sono state ottimizzate in questo laboratorio 5,6 e si discostano da quelli utilizzati di routine 7-9. Tradizionalmente, gli ovociti denudati vengono preparaticon un trattamento prolungato collagenasi di lobi ovariche a temperatura ambiente, e questi ovociti denudati sono microiniezione con mRNA. Utilizzando i metodi ottimizzati, diverse proteine di membrana sono state espresse e studiato con questo sistema, come ricombinanti recettori GABA A 10-12, canali del cloro ricombinanti umani 13, canali di potassio trypanosome 14, e un trasportatore myo-inositolo 15, 16.
I metodi qui descritti possono essere applicati alla espressione di qualsiasi proteina di scelta in oociti di Xenopus, e la variazione rapida soluzione possono essere utilizzati per studiare altri canali ionici ligando-dipendenti.
Introduction
Ovociti di Xenopus sono ampiamente utilizzati come un sistema di espressione (Riferimenti 2 - 3, e riferimenti ivi). Essi sono in grado di assemblare correttamente e integrare proteine multisubunit funzionalmente attivi nelle loro membrane plasmatiche. Utilizzando questo sistema, è possibile indagare funzionalmente proteine di membrana da solo o in combinazione con altre proteine, per studiare le proprietà dei mutanti, chimerici, o proteine concatenati, e allo schermo potenziali farmaci.
Vantaggi di usare ovociti rispetto ad altri sistemi di espressione eterologhi includono la semplice manipolazione delle cellule giganti, l'alta percentuale di cellule che esprimono informazioni genetiche estranee, il semplice controllo dell'ambiente dell'ovocita mediante bagno di perfusione, e il controllo del potenziale di membrana .
L'inconveniente di questo sistema di espressione è la variazione stagionale osservato in molti laboratori 17-20. La ragione di questa variazioneè tutt'altro che chiaro. Inoltre, la qualità degli ovociti è spesso osservato variare fortemente. I metodi tradizionali 7-9 hanno incluso l'isolamento di lobi dell'ovaia, l'esposizione dei lobi ovariche di collagenasi per alcune ore, la selezione di ovociti denudati, e la microiniezione ovocita. Qui, una serie di alternative, procedure veloci sono riferito che ci hanno permesso di lavorare con questo sistema di espressione per più di 30 anni senza variazioni stagionali e piccole variazioni nella qualità degli ovociti.
I metodi modificati e migliorati qui descritte per l'isolamento di ovociti, microiniezione con cRNA, e la rimozione di strati di cellule follicolari possono essere usate per l'espressione di qualsiasi proteina di scelta nel oocita di Xenopus. Il metodo molto semplice per modifiche soluzione veloce del mezzo intorno l'ovocita può essere applicato allo studio di qualsiasi recettore ionotropico e dei vettori.
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Protocol
Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato locale del cantone di Berna Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst Berna (BE85 / 15).
1. Preparazione di Xenopus ovociti
- Mantenere rane (Xenopus laevis) su un 12 h / 12 h luce / buio ciclo in acqua che viene rigorosamente mantenuta a 20 ° C.
- Rimuovere i lobi delle ovaie da rane femmina 9.
NOTA: La rimozione dei lobi è uno stimolo per la rigenerazione, e spesso la qualità degli ovociti migliora con la chirurgia. L'oocita è coperto da uno strato vitellina, uno strato di cellule del follicolo, e tessuto connettivo contiene i vasi sanguigni 21. L'intera struttura è denominata "follicolo." - Posizionare i lobi delle ovaie che sono densamente imballati con i follicoli che contengono gli ovociti in sterili di Barth Saline 7 (MBS) integrato con la penicillina e la streptomicina (88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mmNaHCO 3, 0,82 mM MgSO 4, 0.41 mM CaCl 2, 0,33 mM Ca (NO 3) 2, 10 mM 4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic; HEPES (pH 7,5, NaOH), 100 mg / ml di penicillina, e 100 mg / ml di streptomicina).
- Single-out fase V-VI 21 follicoli. Tenere il lobo dell'ovaio con una pinza. Abbassare l'anello di platino (figura 1) nei follicoli e prelevare delicatamente il ciclo per distruggere il tessuto connettivo contenente il follicolo dal tessuto ovarico.
NOTA: Fase V-VI 21 follicoli sono caratterizzati dalla loro dimensione (1.0 - 1,2 mm di diametro) e per il buon contrasto tra il pigmentata nell'emisfero animale scuro e l'emisfero vegetale giallastro. - Trasferire solo follicoli sani aspetto (cioè perfettamente sferiche e pigmentati intatta) ad un diametro Petri piastra da 35 mm con una pipetta di plastica Pasteur (intercettato torna ad un diametro di 1,5 mm di apertura).
Nota: Il sistema di microiniezione qui descritto è derivato da quello riportato da Kressmann e Birnstiel 22.
- Preparare CRNAs dai rispettivi cDNA codificanti per le subunità della α 4 β 2 δ GABA A recettori mediante trascrizione in vitro, l'aggiunta di una poli (A +) della coda, e RNA quantificazione mediante gel elettroforesi 23.
- Preparare pipette microiniezione da capillari di vetro borosilicato (1,0 mm di diametro esterno (OD), diametro interno 0,58 mm (ID), 100 mm di lunghezza) con un estrattore micropipetta. Rompere le punte dei capillari di vetro sotto un microscopio con un micromanipolatore e microfilamenti per creare un diametro della punta di 12 - 15 micron con una punta smussata.
- Backfill le pipette microiniezione con olio di paraffina con una siringa da 10 ml, e poi montare la pipetta microiniezione su un MICR autocostruitoApparecchiatura oinjection (Figura 2).
NOTA: L'apparato di iniezione oleodinamico homebuilt costituito da un motore griglia controllata da un interruttore a pedale. Un ulteriore interruttore cambia la modalità di rotazione del motore. Questo motore aziona una vite micrometrica (0,5 mm / giro) che avanza o si ritrae lo stantuffo di una siringa di vetro 10 ml. L'iniezione è ad una velocità di circa 3 giri al minuto, 0,5 giro corrisponde ad una iniezione di 50 nL in un follicolo. La punta della siringa è collegato al tubo di politetrafluoroetilene parete spessa che è a sua volta collegato all'ago iniezione tramite un brevissimo pezzo di tubo Tygon. Il capillare iniezione è mantenuto da un mandrino che è controllato da un micromanipolatore. L'intero sistema è riempito con olio di paraffina. Eventuali bolle d'aria devono essere evitati, in quanto saranno compromettere il sistema di iniezione. Il setup è illuminato con una sorgente di luce fredda. Un stereomicroscopio è necessario per il controllo ottico. I follicoli vengono visualizzati sotto la luce fredda con un stereomicroscope (40X di ingrandimento). Prestazioni del setup di iniezione è verificata l'iniezione di tracciante radioattivo in ovociti di Xenopus. Un volume di 45 - 55 nL deve essere consegnato per iniezione. - Usando una pipetta con una punta di plastica sterili, verificare l'installazione posizionando una goccia di acqua sterile sulla parte interna pulita di una termoplastico resistente all'umidità (2 x 2 cm). Immergere la punta della pipetta iniezione in questo gocciolina, e poi girare il motore per ritrarre lo stantuffo (pressione negativa all'interno della pipetta di iniezione).
NOTA: acqua deve entrare nella pipetta e formare un'interfaccia visibile con l'olio. - Ritrarre la punta della pipetta dalla gocciolina e applicare una pressione positiva all'interno della pipetta di iniezione. Una goccia d'acqua dovrebbe formare sulla punta della pipetta di iniezione.
- Preparare per l'iniezione dei follicoli rivestendoli con i poli vegetali rivolto verso l'alto negli interstizi di una maglia di nylon (G: 0,8 mm) incollati al fondo di un Pepiatto tri (60 mm) coperto di MBS.
- Dispensare 2 ml di mRNA usando una pipetta con una punta di plastica sterile sulla parte interna pulita di un materiale termoplastico. Prendere l'mRNA up nella pipetta di iniezione applicando pressione negativa all'interno della pipetta di iniezione.
- Posizionare la pipetta di iniezione su un follicolo individuo che usa il micromanipolatore.
- Inserire l'ago iniezione nel centro del polo vegetale e iniettare 50 nL di mRNA ad una portata di 0,6 ml / min applicando una pressione positiva all'interno della pipetta. Attendere 5 - 10 s prima di rimuovere la punta della pipetta di iniezione dal follicolo per evitare mRNA fuga.
NOTA: L'mRNA deve essere iniettato nel polo vegetale (giallo) per evitare l'iniezione nel nucleo, che si trova nell'emisfero animale. - Trasferire i follicoli iniettati in un piatto Petri (35 mm) riempita con 2 mL di MBS. Porre la capsula in un dispositivo di raffreddamento di vino impostato a 18 ° C. Incubare i follicoli iniettati per 1 -7 d prima della registrazione, a seconda dell'identità della nuova proteina espressa.
3. Spogliarello dei follicoli (Figura 3)
NOTA: Come menzionato sopra, l'ovocita ricoperta da uno strato vitellina, cellule follicolari e tessuto connettivo, che contiene i vasi sanguigni 24, è noto come un "follicolo." Tutti i livelli tranne lo strato vitellina, che fornisce stabilità meccanica senza impedire l'accesso delle soluzioni alla superficie cellulare, devono essere rimossi prima esperimenti elettrofisiologici. Il follicolo senza gli strati di cellule circostanti è già stato definito un ovocita "dissodata" 25. Questa operazione viene generalmente eseguita nello stesso giorno come gli esperimenti elettrofisiologici.
- Trasferimento dieci iniettato follicoli in una provetta di vetro borosilicato contenente 0,5 mL di MBS, 1 mg / ml di collagenasi, e 0,1 mg / mL inibitore della tripsina. Immergere il tubo in un bagno d'acqua mantenuto a 36 ° C. incubare ilfollicoli per 20 minuti e agitare i tubi di tanto in tanto.
- Sciacquare i follicoli trasferendoli ad un secondo tubo contenente 1 ml di MBS a temperatura ambiente. Lasciarli nel tubo per circa 10 s.
- Trasferire i follicoli ad un terzo tubo contenente 0,5 mL di MBS doppiamente concentrati contenenti 4 mM etilenglicol-bis (2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetraacetico (EGTA), e incubare per 4 min a RT. Agitare il tubo di tanto in tanto.
NOTA: La soluzione ipertonica (MBS concentrati doppiamente) viene utilizzato per indurre il restringimento degli ovociti all'interno di strati di cellule del follicolo, staccando così strati di cellule follicolari dalla ovocita; EGTA viene aggiunto per inibire l'attività collagenasi. - Sciacquare i follicoli trasferendoli ad un secondo tubo contenente 1 ml di MBS a temperatura ambiente. Lasciarli nel tubo per circa 10 s.
- Trasferire gli ovociti ad una piastra di Petri (35 mm di diametro) contenente 2 mL di MBS. Sotto uno stereomicroscopio, separare le buste esterno dal follicoli dasemplicemente spingendo l'ovocita nuda distanza utilizzando l'anello di platino.
NOTA: Le buste esterne degli ovociti bastone saldamente al piatto di coltura e possono essere facilmente separati dai ovociti. Alcuni ovociti spontaneamente perdere le loro buste esterne e saranno recuperati come ovociti denudati. Questa procedura comporta una preparazione relativamente stabile che mantiene l'aspetto sferico degli ovociti.
4. Soluzione cambiano velocemente in tutto il ovociti
- Eseguire un esperimento morsetto di tensione, come descritto 9,26.
- Cambiare la soluzione del sistema di perfusione gravità alimentata ruotando gli interruttori perfusione come richiesto dall'esperimento.
- Applicare la soluzione di perfusione a 6 ml / min attraverso un capillare di vetro con diametro interno di 1,35 mm, la cui imboccatura è posto circa 0,4 mm dalla superficie del ovocita, per consentire rapidi cambiamenti nella concentrazione di agonista intorno ovocita.
NOTA: Il tasso di cambiamento è stato in precedenza stimad come 70% in meno di 0,5 s 27.
- Applicare la soluzione di perfusione a 6 ml / min attraverso un capillare di vetro con diametro interno di 1,35 mm, la cui imboccatura è posto circa 0,4 mm dalla superficie del ovocita, per consentire rapidi cambiamenti nella concentrazione di agonista intorno ovocita.
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Representative Results
Oociti di Xenopus sono stati individuati meccanicamente utilizzando un'ansa di platino (Figura 1). Gli ovociti sono stati microiniettati con mRNA codificante per il GABA A subunità alfa 4, ß 2, δ, 0.5: 0.5: 2.5 fmol / ovocita (Figura 2). Dopo 4 d, strati di cellule follicolari sono stati rimossi (figura 3). Gli oociti sono stati bloccati tensione a -80 mV e esposte a concentrazioni crescenti di acido γ-aminobutirrico (GABA) in presenza di 1 pM 3α, 21-diidrossi-5α-pregnan-20-one (THDOC), un potente modulatore allosterico positivo il recettore GABA A. La figura 4A mostra tracce attuali originali registrati in un simile esperimento. La figura 4B mostra ampiezza della corrente suscitato a seconda delle concentrazioni di GABA. Questo permette di determinare la sensibilità di questa combinazione di subunità verso GABA. Le singole curve sono statemontato e standardizzato per I max e successivamente media. L'equazione utilizzata era I (c) = I max / (n 1+ (EC 50 / c)), dove c è la concentrazione di GABA, EC 50 la concentrazione di GABA (in presenza di 1 pM THDOC) suscitare mezzo ampiezza della corrente -maximal, I max è l'ampiezza massima corrente, I è l'ampiezza della corrente, ed n è il coefficiente di Hill. La CE 50 della α 4 β 2 δ GABA un recettore è stato pari a 0,41 ± 0,12 micron, e n è stato 0,76 ± 0,04.
Figura 1: Platinum Loop. Il ciclo filo di platino menzionato nel passaggio protocollo 1.4. Il platino è un metallo che può essere piegato senza produrre schegge, e non si attaccaal materiale biologico. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Homebuilt microiniezione Apparatus. L'apparecchiatura è descritta nel passaggio protocollo 2. un motore griglia; B, vite micrometrica; C, molla tra la siringa e pistone; d, 10 microlitri siringa di vetro; e, pareti spesse tubo di politetrafluoroetilene; f, mano mandrino; g, iniezione pipetta; h, stereomicroscopio; ed io, di controllo del motore. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Schema che mostra la Defolliculation di un ovocita. Gli ovociti vengono prima incubate in una soluzione di collagenasi in un bagno di acqua a 36 ° C per 20 min. Gli ovociti vengono poi lavate in un mezzo Barth modificata. Il passaggio di incubazione finale è una soluzione ipertonica EGTA a temperatura ambiente per 4 min. Come risultato, il tessuto connettivo e le cellule follicolari vengono rimossi per dare modo al ovocita denudato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Tracce corrente da una a due elettrodi di tensione morsetto esperimento. UN, tracce attuali di una curva di concentrazione-risposta GABA nel presza di 1 micron THDOC ottenuto da un oocita di Xenopus che esprime il GABA α 4 β 2 δ un recettore. Le barre indicano il periodo di tempo di GABA / 1 micron THDOC perfusione. Concentrazioni crescenti di GABA sono stati applicati al oociti, e corrispondenti ampiezze delle correnti sono state determinate. Le concentrazioni di GABA sono indicati sopra le barre. B, Curve concentrazione-risposta medio della rispettiva α 4 β 2 δ GABA un recettore. curve individuali erano prima normalizzata alla ampiezza massima corrente a muro e sono stati successivamente mediati. I dati sono mostrati come media ± DS, n = 3. Fate clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I metodi descritti in questo articolo si discostano da quelli utilizzati tradizionalmente 7-9. È standard per esporre i lobi delle ovaie ad un 1 a 2 h trattamento collagenasi 8; isolare intatti, ovociti denudati; e li inietta con mRNA utilizzando dispositivi di iniezione commerciali. Questa procedura classica presenta i seguenti inconvenienti: 1) Gli oociti sono suscettibili di essere danneggiato dalla lunga esposizione ad alte concentrazioni di collagenasi. 2) Gli ovociti denudati instabili devono essere conservati fino a quando l'esperimento. 3) ovociti denudato hanno maggiori probabilità di soffrire durante microiniezione di follicoli. dispositivi di iniezione commerciali usano di grande diametro (circa 20 micron) aghi da iniezione, suscettibile di provocare un tasso relativamente alto di danni. I vantaggi del procedimento perfezionato qui descritto sono i seguenti: esposizione a collagenasi è limitato a 20 min, ovociti denudati non devono essere memorizzati, e il piccolo diametro della punta delle pipette (circa 12 - 15 micron) utilizzato per microinjectiil non prescrive la previa "defolliculation" dei follicoli per l'iniezione di mRNA. Il singolo passo fondamentale è che la temperatura del follicolo incubazione in soluzione di collagenasi deve essere attentamente regolata a 36 ° C e non deve superare esso.
Per soluzione cambia in esperimenti elettrofisiologici, molto spesso la soluzione nella camera di misura viene modificata, che richiede una notevole quantità di tempo, a seconda delle dimensioni della camera e la velocità di perfusione. Utilizzando la perfusione capillare evitato questo.
Il principale inconveniente della espressione dei canali ionici in oociti di Xenopus è la loro dimensione gigante. controllo tensione più veloce di circa 2 ms è difficile, e molto veloce (<0,5 s) soluzione cambia richiedono procedure complesse. Inoltre, fortemente sostanze idrofobiche possono essere quasi irreversibilmente legato al tuorlo d'uovo dell'ovocita.
I metodi descritti qui ci hanno permesso di indagarein un modo per risparmiare tempo le proprietà funzionali di un recettori GABA ricombinante, la loro modulazione da composti sintetici e sostanze vegetali, la loro disposizione subunità, e la localizzazione dei siti di legame di droga a recettori di diversa composizione subunità. I metodi qui descritti sono adatti per l'espressione di qualsiasi proteina di scelta nel oocita di Xenopus. Il metodo molto semplice per modifiche soluzione veloce del mezzo intorno l'ovocita può essere applicato allo studio di qualsiasi recettore ionotropico o corriere.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | 71380 | |
| KCl | Sigma | P-9541 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| MgSO4 | Sigma | M-1880 | |
| CaCl2 | Sigma | 223560 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma | C1396 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Penicilin/streptomycin | Gibco | 15140-148 | 100 μg penicillin/mL and 100 μg streptomycin/mL |
| Platinum wire loop | home-made | ||
| Micropipette puller | Zeitz-Instruments GmBH | DMZ | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80300 | 10 μL, Type 701N |
| Thick walled polytetrafluoroethylene tubing | Labmarket GmBH | 1.0 mm OD | |
| Paraffin oil | Sigma | 18512 | |
| Nylon net, G: 0.8 mm | ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG | ||
| Borosilicate glass tube | Corning | 99445-12 | PYREX |
| Collagenase NB Standard Grade | SERVA | 17454 | |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma | T-9003 | |
| EGTA | Sigma | E3389 | |
| Glass capillary | Jencons (Scientific ) LTD. | H15/10 | 1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0019 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 Length mm (for microinjection) |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0044 | 1.2 OD x 0.69 ID x 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp) |
| γ-Aminobutyric acid (GABA) | Sigma | A2129 | |
| 3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC) | Sigma | P2016 | |
| grill motor | Faulhaber | DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2 | |
| micrometer screw | Kiener-Wittlin | 10400 | TESA, AR 02.11201 |
| Sterile plastic transfer pipettes | Saint-Amand Mfg. | 222-20S |
References
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