Xenopus ovociti: Metodi ottimizzate per microiniezione, la rimozione di strati di cellule follicolari e cambiamenti soluzione veloce in esperimenti di elettrofisiologia

Sommario

Vengono descritte procedure ottimizzate per l'isolamento di singoli follicoli, microiniezioni di RNA citoplasmatico, rimozione degli strati cellulari circostanti ed espressione proteica negli ovociti di Xenopus. Inoltre, viene presentato un metodo semplice per cambi rapidi di soluzione in esperimenti elettrofisiologici con canali ionici ligando-dipendenti.

Abstract

L'oocita di Xenopus come un sistema di espressione eterologa di proteine, è stato descritto da Gurdon et al. ¹ ed è stato ampiamente utilizzato dalla sua scoperta (Riferimenti 2 - 3, e riferimenti ivi). Una caratteristica che rende l'ovocita attraente per l'espressione canale estero è la scarsa abbondanza di canali ionici endogeni ^4. Questo sistema di espressione è dimostrato utile per la caratterizzazione di molte proteine, tra i quali canali ionici ligando-dipendenti.

L'espressione dei _recettori GABA in oociti di Xenopus e la loro caratterizzazione funzionale è descritto qui, compreso l'isolamento degli ovociti, microiniezioni con cRNA, la rimozione di strati di cellule follicolari e soluzione cambia veloci esperimenti elettrofisiologici. Le procedure sono state ottimizzate in questo laboratorio ^5,6 e si discostano da quelli utilizzati di routine ^7-9. Tradizionalmente, gli ovociti denudati vengono preparaticon un trattamento prolungato collagenasi di lobi ovariche a temperatura ambiente, e questi ovociti denudati sono microiniezione con mRNA. Utilizzando i metodi ottimizzati, diverse proteine di membrana sono state espresse e studiato con questo sistema, come ricombinanti recettori GABA _A ^10-12, canali del cloro ricombinanti umani ^13, canali di potassio trypanosome ^14, e un trasportatore myo-inositolo ^{15, 16.}

I metodi qui descritti possono essere applicati alla espressione di qualsiasi proteina di scelta in oociti di Xenopus, e la variazione rapida soluzione possono essere utilizzati per studiare altri canali ionici ligando-dipendenti.

Introduzione

Ovociti di Xenopus sono ampiamente utilizzati come un sistema di espressione (Riferimenti 2 - 3, e riferimenti ivi). Essi sono in grado di assemblare correttamente e integrare proteine ​​multisubunit funzionalmente attivi nelle loro membrane plasmatiche. Utilizzando questo sistema, è possibile indagare funzionalmente proteine ​​di membrana da solo o in combinazione con altre proteine, per studiare le proprietà dei mutanti, chimerici, o proteine ​​concatenati, e allo schermo potenziali farmaci.

Vantaggi di usare ovociti rispetto ad altri sistemi di espressione eterologhi includono la semplice manipolazione delle cellule giganti, l....

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato locale del cantone di Berna Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst Berna (BE85 / 15).

1. Preparazione di Xenopus ovociti

1. Mantenere rane (Xenopus laevis) su un 12 h / 12 h luce / buio ciclo in acqua che viene rigorosamente mantenuta a 20 ° C.
2. Rimuovere i lobi delle ovaie da rane femmina ^9.
   NOTA: La rimozione dei lobi è uno stimolo per la rigenerazione, e spesso la qualità degli ovociti migliora con la chirurgia. L'oocita è coperto da uno strato vitellina, uno strato di cellule del follicolo, e tessuto connettivo....

Risultati

Oociti di Xenopus sono stati individuati meccanicamente utilizzando un'ansa di platino (Figura 1). Gli ovociti sono stati microiniettati con mRNA codificante per il GABA _A subunità alfa _4, ß _2, δ, 0.5: 0.5: 2.5 fmol / ovocita (Figura 2). Dopo 4 d, strati di cellule follicolari sono stati rimossi (figura 3). Gli oociti sono stati bloccati tensione a -80 mV e esposte a concentrazioni crescenti .......

Discussione

I metodi descritti in questo articolo si discostano da quelli utilizzati tradizionalmente ^7-9. È standard per esporre i lobi delle ovaie ad un 1 a 2 h trattamento collagenasi ^8; isolare intatti, ovociti denudati; e li inietta con mRNA utilizzando dispositivi di iniezione commerciali. Questa procedura classica presenta i seguenti inconvenienti: 1) Gli oociti sono suscettibili di essere danneggiato dalla lunga esposizione ad alte concentrazioni di collagenasi. 2) Gli ovociti denudati instabili devono.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
NaCl	Sigma	71380
KCl	Sigma	P-9541
NaHCO3	Sigma	S6014
MgSO4	Sigma	M-1880
CaCl2	Sigma	223560
Ca(NO3)2	Sigma	C1396
HEPES	Sigma	H3375
Penicilina/streptomicina	Gibco	15140-148	100 μ g penicillina/mL e 100 μ g streptomicina/mL
Anello di filo di platino	fatto
Estrattore per micropipette	Zeitz-Instruments GmBH	DMZ
Siringa Hamilton	Hamilton	80300	10 μ L, tipo 701N
Tubo in politetrafluoroetilene a parete spessa	Labmarket GmBH		1,0 mm OD
Olio di paraffina	Sigma	18512
Rete in nylon, G: 0,8 mm	ZBF Zü più ricco Beuteltuchfabrik AG Tubo
in vetro borosilicato	Corning	99445-12	PYREX
Collagenase NB Grado standard	SERVA	17454
Inibitore della tripsina di tipo I-S	Sigma	T-9003
EGTA	Sigma	E3389
Capillare in vetro	Jencons (Scientific) LTD.	H15/10	1.35 ID mm (per perfusione), azienda alternativa: Harvard Apparatus Limited
Capillare in vetro borosilicato	Harvard Apparatus Limited	30-0019	1.0 OD x  0.58 ID x 100 Lunghezza mm (per microiniezione)
Capillare in vetro borosilicato	Harvard Apparatus Limited	30-0044	1,2 OD x 0,69 ID x 100 Lunghezza mm (per pinza di tensione a due elettrodi)
γ-Acido amminobutirrico (GABA)	Sigma	A2129
3&alfa;,21-Diidrossi-5&alfa;-gravido-20-one (THDOC)	Motore grill Sigma	P2016
	Faulhaber		Micromotore DC Tipo 2230 con ingranaggio Tipo 22/2
vite micrometrica	Kiener-Wittlin	10400	TESA, AR 02.11201
Pipette sterili per il trasferimento di plastica	Saint-Amand  Mfg.	222-20S

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