Abstract
タンパク質の異種発現系としてアフリカツメガエル卵母細胞は、第一のガードンらによって記載されました。 1、広くその発見以来使用されている（文献2から3、およびその中の参考文献）。外国のチャンネル発現のための卵母細胞は、魅力的な特徴は、内因性イオンチャネル4の貧しい豊富です。この発現系は、それらのリガンド依存性イオンチャネルの中で、多くのタンパク質の特徴付けのために有用であることが証明されました。
アフリカツメガエル卵母細胞におけるGABA A受容体の発現およびそれらの機能的特徴付けは、卵母細胞、cRNAを、濾胞細胞層を除去しながら、微量注入、および電気生理学的実験で高速なソリューションの変化の分離を含め、ここに記載されています。手順は、この研究室5,6で最適化し、日常的に7-9を使用したものから逸脱しました。伝統的に、露出した卵母細胞を調製しますRTで卵巣ローブの長期のコラゲナーゼ処理、およびこれらの裸化卵母細胞にmRNAをマイクロインジェクションしています。最適化された方法を使用して、多様な膜タンパク質が発現されており、そのような組換えGABA A受容体10-12、ヒト組換えクロライドチャネル13、トリパノソーマカリウムチャネル14、及びミオの -イノシトールトランス15、16のように、このシステムを研究しました。
ここに詳述した方法は、 アフリカツメガエル卵母細胞における選択の任意のタンパク質の発現に適用することができ、迅速な溶液交換は、他のリガンド依存性イオンチャネルを研究するために使用することができます。
Introduction
アフリカツメガエル卵母細胞は、広く（ - 3、およびその中の参考文献参考文献2）発現系として使用されます。彼らは、適切に組み立て、それらの形質膜に機能的に活性な多サブユニットタンパク質を組み込むことができます。このシステムを使用して、機能的に変異した、キメラ、または連結されたタンパク質の特性を研究するため、および潜在的な薬物をスクリーニングするために、単独で、または他のタンパク質と組み合わせて膜タンパク質を調査することが可能です。
他の異種発現システムより卵母細胞を使用する利点は、巨細胞の簡単な取り扱い、外来遺伝情報を発現する細胞の高い割合、浴灌流によって、卵母細胞の環境の簡単な制御、および膜電位の制御を含みます。
この発現系の欠点は、多くの研究室17〜20において観察された季節変動です。この変化の理由明確にはほど遠いです。さらに、卵母細胞の質は、多くの場合、強く変化することが観察されます。伝統的な方法7-9は卵巣ローブの分離、いくつかの時間のためのコラゲナーゼに卵巣ローブの露出、裸に卵母細胞の選択、および卵母細胞のマイクロインジェクションが含まれています。ここで、代替、高速手順の数は、私たちは、卵母細胞の品質の無い季節変動や変化の少ない、30年以上にわたってこの発現システムで動作することが許可されていることが報告されています。
改変及び改良された卵母細胞の単離のためにここに記載された方法、cRNAをマイクロインジェクションし、及び濾胞細胞層の除去は、 アフリカツメガエル卵母細胞における選択の任意のタンパク質の発現のために使用することができます。卵母細胞の周囲の培地の高速解の変化のための非常に簡単な方法は、任意のリガンド依存性イオンチャネルのキャリアの研究に適用することができます。
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Protocol
動物実験は、ベルン州Kantonstierarztの地方委員会、KantonalerVeterinärdienstベルン（BE85 / 15）によって承認されています。
アフリカツメガエル卵母細胞の調製
- 厳密に20°Cに維持され、水に12時間/ 12時間の明/暗サイクルでカエル（ アフリカツメガエル）を維持します 。
- 女性のカエル9から卵巣のローブを削除します。
注：ローブの除去は、再生のための刺激である、と多くの場合、卵母細胞の品質は手術で改善されます。卵母細胞は、卵黄膜、毛包細胞の層、および血管21を含む結合組織で覆われています。全体の構造は、「毛包」と呼ばれます。 - ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充した密滅菌バース生理食塩水7（MBS）に卵母細胞を含む卵胞が充てんされてい卵巣のローブを置きます（88のNaCl、1 mMの塩化カリウム、2.4 mMのNaHCO 3、0.82ミリモルのMgSO 4、0.41ミリモルのCaCl 2、0.33ミリモルのCa（NO 3）2、10mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸; HEPES（pHは7.5、NaOHで）、100μg/ mLのペニシリン、および100μg/ mLのストレプトマイシン）。
- シングルアウトステージV-VI 21包。ピンセットで卵巣葉を持ちます。卵胞の上に白金耳（ 図1）を下げ、静かに卵巣組織から卵胞を含む結合組織を破壊するためにループを撤回。
注：（ -直径1.2ミリメートル1.0）と暗い色素性動物半球と黄色がかった植物半球間の良好なコントラストによりステージV-VI 21包は、その大きさによって特徴付けられます。 - プラスチック製パスツールピペットを用いて直径35mmのペトリ皿（1.5ミリメートルの開口径に背をカット）に（ すなわち、完全な球形と無傷の色素沈着を持つ）のみ健康そうな卵胞を転送します。
注：ここで説明するマイクロインジェクションシステムはKressmannとBirnstiel 22によって報告されたことに由来します。
- in vitro転写による受容体、ポリ（A +）尾部、およびRNA定量の添加は、ゲル電気泳動23によってα4β2δGABAのサブユニットをコードするそれぞれのcDNAからcRNAをを準備します。
- マイクロピペットプラーを使用してホウケイ酸ガラスキャピラリー（1.0ミリメートル、外径（OD）、0.58ミリメートル、内径（ID）、長さ100mm）からマイクロインジェクションピペットを準備します。ベベルチップで15ミクロン - 12の先端径を作成するために、マイクロマニピュレーターとミクロフィラメントを使用して、顕微鏡下でガラスキャピラリーの先端を折り。
- 10 mLシリンジを使用して、パラフィンオイルとマイクロインジェクションピペットを埋め戻し、その後、手製のMICR上にマイクロインジェクションピペットをマウントoinjection装置（ 図2）。
注：手製油油圧式射出装置は、フットペダルスイッチによって制御グリルモーターで構成されています。追加のスイッチは、モータの回転モードを変更します。このモーターは、10μLのガラスシリンジのプランジャーを前進または後退させるマイクロメータねじ（0.5ミリメートル/ターン）を駆動します。注射は約3回転の速度であり、0.5ターンは卵胞に50 nLの注入に対応しています。注射器の先端は、それ自体がタイゴンチューブの非常に短い一片によって注射針に接続されている厚肉ポリテトラフルオロエチレンチューブに接続されています。注射キャピラリーをマイクロマニピュレーターによって制御されるドリルチャックによって保持されています。システム全体は、パラフィン油で満たされています。それらは、注入システムが損なわれるように、気泡は、避けるべきです。セットアップは、冷光源で点灯されます。実体顕微鏡は、光制御のために必要とされます。卵胞はstereomicrで冷光下で可視化されていますOSCOPE（40X倍率）。注射セットアップのパフォーマンスは、 アフリカツメガエル卵母細胞への放射性トレーサーの注入によってテストされています。 45の容積 - 55 nLのは、1回の注射送達されるべきです。 - 滅菌プラスチックチップでピペットを用いて、耐湿性の熱可塑性（2×2センチ）のクリーン内側に滅菌水の液滴を配置することによって、セットアップをテストします。この液滴への注入ピペットの先端を浸し、その後、プランジャー（注入用ピペット内の負圧）を後退させるモーターを回します。
注：水はピペットを入力して、油で目に見えるインタフェースを形成すべきです。 - 液滴からのピペットの先端を撤回し、注入ピペットの内側に正の圧力を加えます。水滴は、注入用ピペットの先端に形成すべきです。
- 植物極はナイロンメッシュ（G：0.8ミリメートル）の隙間に上向きでそれらを並べることにより、卵胞の注入の準備をPeとの底に接着MBSで覆われたトライディッシュ（60ミリメートル）。
- 熱可塑性のクリーン内側に滅菌プラスチックチップでピペットを用いて、mRNAの2μLを分注します。注入ピペットの内部に負圧を印加することによって、注入ピペットへのmRNAを取ります。
- マイクロマニピュレーターを用いて、個々の卵胞の上に注入ピペットを置きます。
- 植物極の中心に注射針を挿入し、ピペットの内側に正の圧力を加えることによって0.6μL/分の流速でのmRNAの50 nLのを注入します。 mRNAのエスケープを避けるために、卵胞から注入ピペットチップを取り外す前に、10秒 - 5待ちます。
注：mRNAは動物半球に位置する核への注入を避けるために、植物（黄色っぽい）極に注入する必要があります。 - MBSの2 mLを満たした新しいペトリ皿（35ミリメートル）に注入された卵胞を転送します。 18℃に設定したワインクーラーに皿を置きます。 1のために注入された卵胞を培養します -7日記録する前に、新たに発現したタンパク質の同一性に応じて。
3.卵胞のストリップ（図3）
注：上記のように、血管24を含んでいる卵黄層、卵胞細胞、および結合組織で覆わ卵母細胞として知られている「毛包」。細胞表面へのソリューションのアクセスを妨げることなく、機械的安定性を提供卵黄層を除く全ての層は、電気生理学的実験の前に除去しなければなりません。周囲の細胞層なしの卵胞は、以前「剥皮」卵母細胞25と呼ばれています。この工程は、通常の電気生理学的実験と同じ日に行われます。
- トランスファー10は、MBS 0.5mLの、1mg / mlのコラゲナーゼ、および0.1mg / mLのトリプシンインヒビターを含むホウケイ酸ガラス管に卵胞を注入しました。 36℃に維持した水浴中でチューブを浸します。インキュベート20分間の卵胞と時折チューブを振ります。
- RTでMBSの1 mLを含む第二の管にそれらを転送することにより卵胞をすすぎます。約10秒間チューブでそれらを残します。
- 4mMのエチレングリコールビス（2-アミノエチルエーテル）を含む二重濃縮MBS 0.5 mLを含む第3チューブに卵胞を転送- Nは、N、N '、N'-四酢酸（EGTA）、及び4分のためにそれらをインキュベートRT。時折チューブを振ります。
注：高張液（二重濃縮MBS）は、それにより卵母細胞の卵胞細胞層を剥離、卵胞細胞層内で卵母細胞の収縮を誘導するために使用されます。 EGTAは、コラゲナーゼ活性を阻害するために添加されます。 - RTでMBSの1 mLを含む第二の管にそれらを転送することにより卵胞をすすぎます。約10秒間チューブでそれらを残します。
- MBSの2 mLを含むペトリ皿（直径35mm）に卵母細胞を転送します。実体顕微鏡下で、によって卵胞から外封筒を分離単純に白金耳を用いて、離れて裸の卵母細胞をプッシュ。
注：卵母細胞の外側エンベロープは、培養皿にしっかりと付着し、容易に卵母細胞から分離することができます。いくつかの卵母細胞は自発的にそれらの外側エンベロープを失い、裸化卵母細胞として回収されます。この手順では、卵母細胞の球状の外観を保持し、比較的安定した準備になります。
卵母細胞の周り4.高速解法の変更
- 9,26を説明したように、電圧クランプ実験を行います。
- 実験で必要とされる灌流スイッチを回して重力供給灌流システムのソリューションを変更します。
- 6 mLの1.35ミリメートルの内径を有するガラスキャピラリーを通して/分、卵母細胞の周りのアゴニスト濃度の急速な変化を可能にするために、卵母細胞の表面から約0.4mmに配置された河口に灌流液を適用します。
注：変化率は以前に推定されています0.5未満の27で70％D。
- 6 mLの1.35ミリメートルの内径を有するガラスキャピラリーを通して/分、卵母細胞の周りのアゴニスト濃度の急速な変化を可能にするために、卵母細胞の表面から約0.4mmに配置された河口に灌流液を適用します。
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Representative Results
アフリカツメガエル卵母細胞は、機械的に白金耳（ 図1）を使用して選び出しました。 0.5：2.5のfmol /卵母細胞（ 図2）卵母細胞は、mRNAは、受容体サブユニットは4、β2、δ、0.5をαGABAをコードをマイクロインジェクションしました。 4日後、卵胞細胞層（ 図3）を除去しました。電圧は、卵母細胞を-80mVでクランプし、1μM3α、21ジヒドロキシ5α-プレグナン-20-1（THDOC）、の強力な正のアロステリックモジュレーターの存在下で、γアミノ酪酸（GABA）の増加する濃度にさらされましたGABA A受容体。 図4Aは、このような実験で記録されたオリジナルの電流トレースを示します。 図4Bは、GABAの濃度に応じて誘発された電流振幅を示しています。これは、GABAに向けて、このサブユニットの組み合わせの感度の決意を可能にします。個々の曲線がありました取り付け、I MAXに標準化し、続いて平均しました。使用される式は、半分を誘発する（1μMのTHDOCの存在下で）、cは GABAの濃度であり、I（C）= I MAX /（1+（EC 50 / C）N）、EC 50 GABAの濃度でした-maximal電流振幅、I maxは最大電流振幅である、 私は現在の振幅であり、nはヒル係数です。 α4β2δGABAのEC 50は、受容体は、0.41±0.12μMに達し、nは0.76±0.04でした。
図1：プラチナループ。白金線ループは、プロトコルのステップ1.4で述べました。白金は、破片を生じることなく曲げることができる金属であり、そしてそれが付着しません生物学的材料に。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：自作マイクロインジェクション装置。装置は、プロトコルのステップ2、グリルモーターに記載されています。 B、マイクロメータねじ; C、シリンジとプランジャとの間に春。 D、10μLのガラスシリンジ。 電子 、肉厚のポリテトラフルオロエチレンチューブ。 F、ハンドドリルチャック。 グラム 、注入用ピペット。 時間 、実体顕微鏡。そして、 私 、モータ制御。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
卵母細胞のDefolliculationを表示図3.スキーム。卵母細胞は最初の20分間、36℃の水浴中でコラゲナーゼ溶液中でインキュベートします。卵母細胞は、その後修正されたバース培地中で洗浄します。最終インキュベーション段階は、4分間のRTで高張EGTA溶液中にあります。その結果、結合組織と卵胞細胞が裸化卵母細胞に道を譲るために除去されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
二電極電圧クランプ実験から図4.電流トレース。 、 PRES中のGABA濃度応答曲線からの電流トレースα4β2δGABAに受容体を発現するアフリカツメガエル卵母細胞から得られた1μMのTHDOCのレンス。バーは、GABA / 1μMTHDOC灌流の期間を示しています。 GABAの増加する濃度は、卵母細胞に適用し、そして対応する電流振幅を測定しました。 GABA濃度は、バーの上に示されています。 B、 α4β2δGABA受容体の平均濃度反応曲線。個々の曲線が当てはめられた最大電流振幅への最初の正規化し、続いて平均しました。データは、平均±SDとして示されているのn = 3 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
この資料に記載された方法は、伝統的に7-9使用されるものから外れます。 1〜2時間コラゲナーゼ処理8に卵巣のローブを露出するための規格です。損傷を受けていない、裸に卵母細胞を分離します。およびmRNAは、市販の注入装置を使用してそれらを注入します。卵母細胞は、コラゲナーゼの高濃度に長時間暴露によって損傷される可能性が高い1）：これは古典的な手順は以下の欠点を有します。 2）不安定な裸化卵母細胞は、実験まで保存しておく必要があります。 3）裸化卵母細胞は卵胞よりマイクロインジェクションの間に苦しむ可能性が高くなります。商用の注入装置は、損傷の比較的高い速度をもたらす可能性が大径（約20μm）注射針を使用します。裸化卵母細胞を格納する必要がない、コラゲナーゼへの曝露は、20分に制限され、ピペットの小さな先端径（約12から15μm）はmicroinjectiに使用：次のようにここで説明する改良された手順の利点は、mRNAを注入するための包の前に「defolliculation」を必要としません。単一の重要なステップは、コラゲナーゼ溶液中の卵胞のインキュベーション温度は慎重に36℃に調整されるべきであり、それを超えてはならないということです。
電気生理学実験において、溶液の変化のため、非常に多くの場合、測定チャンバ内の溶液は、チャンバの大きさ及び血流速度に応じて、かなりの時間を要しており、変更されます。これを回避灌流毛細管を使用。
アフリカツメガエル卵母細胞におけるイオンチャネルの発現の主要な欠点は、それらの巨大なサイズです。電圧制御が速く、約2ミリ秒は困難であり、非常に高速であるよりも、（<0.5秒）ソリューションの変更は、精巧な手続きが必要です。さらに、疎水性の強い物質がほとんど卵母細胞の卵黄に不可逆的に結合することができます。
ここで説明する方法は、私たちが調査することができました時間節約の方法で組換えGABA A受容体の機能特性、合成化合物および植物物質によるそれらの調節、そのサブユニットの配置、および異なるサブユニット組成の受容体中の薬物結合部位の位置。ここで説明する方法は、 アフリカツメガエル卵母細胞で選択した任意のタンパク質の発現に適しています。卵母細胞の周囲の培地の高速解の変化のための非常に簡単な方法は、任意のリガンド依存性イオンチャネルまたはキャリアの研究に適用することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | 71380 | |
| KCl | Sigma | P-9541 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| MgSO4 | Sigma | M-1880 | |
| CaCl2 | Sigma | 223560 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma | C1396 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Penicilin/streptomycin | Gibco | 15140-148 | 100 μg penicillin/mL and 100 μg streptomycin/mL |
| Platinum wire loop | home-made | ||
| Micropipette puller | Zeitz-Instruments GmBH | DMZ | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80300 | 10 μL, Type 701N |
| Thick walled polytetrafluoroethylene tubing | Labmarket GmBH | 1.0 mm OD | |
| Paraffin oil | Sigma | 18512 | |
| Nylon net, G: 0.8 mm | ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG | ||
| Borosilicate glass tube | Corning | 99445-12 | PYREX |
| Collagenase NB Standard Grade | SERVA | 17454 | |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma | T-9003 | |
| EGTA | Sigma | E3389 | |
| Glass capillary | Jencons (Scientific ) LTD. | H15/10 | 1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0019 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 Length mm (for microinjection) |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0044 | 1.2 OD x 0.69 ID x 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp) |
| γ-Aminobutyric acid (GABA) | Sigma | A2129 | |
| 3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC) | Sigma | P2016 | |
| grill motor | Faulhaber | DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2 | |
| micrometer screw | Kiener-Wittlin | 10400 | TESA, AR 02.11201 |
| Sterile plastic transfer pipettes | Saint-Amand Mfg. | 222-20S |
References
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