Abstract
단백질 이종 발현 시스템으로 제노 푸스 난 모세포는 제 Gurdon 동부 등에 의해 설명되었다. 1 널리 발견부터 사용되었다 (참고 문헌 2-3 및 참조 내부). 외국 채널 식의 난자가 매력적인 만드는 특징은 내생 이온 채널 4의 가난한 풍부하다. 이 발현 시스템은 리간드 게이트 이온 채널 그들 가운데 많은 단백질의 특성에 유용 입증되었습니다.
GABA의 아프리카 손톱 개구리의 난모 세포 수용체와 기능적 특성의 발현은 난자, cRNA를, 여포 세포 층의 제거 및 전기 생리학 실험에서 빠른 솔루션 변경 microinjections의 분리를 포함하여, 여기에 설명되어 있습니다. 절차는이 실험 5,6에 최적화되어 있으며 정기적으로 7-9을 사용하는 것 이탈했다. 전통적으로, 무 결함 난자 제조RT에서 난소 로브의 연장 콜라게나 제 처리, 이러한 무 결함 난자와의 mRNA와 미세 주입된다. 최적화 된 방법을 사용하여 다양한 막 단백질은 발현되고 그러한 재조합 GABA A는 수용체 10-12 인간 재조합 클로라이드 채널 (13), 트리파노소마 칼륨 채널 (14), 및 미오의 -inositol 전달체 (15, 16),이 시스템을 연구 하였다.
여기에 설명 된 방법은 한 아프리카 손톱 개구리의 난모 세포의 선택 중의 단백질의 발현에인가 될 수 있고, 신속한 용액 변경은 다른 리간드 관문 이온 채널을 연구하는데 사용될 수있다.
Introduction
제노 푸스 난 모세포 널리 (- 3, 참조 내부 참조 2) 발현 시스템으로서 사용된다. 이들은 적절히 조합 및 세포막에 기능적 활성 multisubunit 단백질을 포함 할 수있다. 이 시스템을 사용하면, 기능적으로, 단독으로 또는 다른 단백질과 결합 막 단백질을 조사 돌연변이 키메라 또는 연접 단백질의 성질을 연구하기 위해, 잠재적 약물을 스크리닝 할 수있다.
다른 이종 발현 시스템을 통해 난자를 사용 이점은 거대 세포의 간단한 처리 외국 유전 정보, 목욕 관류에 의해 난자의 환경의 간단한 제어를 발현하는 세포의 비율이 높은, 상기 막 전위의 제어를 포함 .
이러한 발현 시스템의 단점은 많은 실험실 17-20에서 관찰 계절 변동이다. 이러한 변화의 원인분명 거리가 멀다. 또한 난자의 품질이 종종 크게 변화하는 것으로 관찰된다. 전통적인 방법 7-9 난소 로브의 분리, 몇 시간 동안 콜라게나 제에 난소 로브의 노출, 무 결함 난자의 선택, 그리고 난자의 미세 주입을 포함했다. 여기서, 대안, 빠른 절차의 수는 우리가 난자의 질에 어떤 계절의 변화와 약간의 변화와 함께 30 년 이상이 발현 시스템에서 작동하도록 허용 한 것을보고됩니다.
난 모세포의 분리, cRNA를 미세 주사로하고, 모낭 세포 층의 제거를 위해 여기에 설명 된 수정 및 개선 방법은 제노 푸스 난 모세포에서 선택한 임의의 단백질의 발현을 위해 사용될 수있다. 난자 주위 매질의 빠른 변화 용액의 아주 간단한 방법은 리간드 개폐 통로와 캐리어들의 연구에 적용될 수있다.
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Protocol
동물 실험은 광저우 베른 Kantonstierarzt의 지역위원회, Kantonaler Veterinärdienst 베른 (BE85 / 15)에 의해 승인되었습니다.
Xenopus의 난 모세포 1. 준비
- 엄격하게 20 ° C로 유지되는 물에 12 시간 / 12 시간의 광 / 암주기 개구리 (Xenopus의의 laevis의)을 유지한다.
- 여성 개구리 (9)에서 난소의 로브를 제거합니다.
참고 : 로브의 제거는 재생을위한 자극, 그리고 종종 난자의 질이 수술이 향상됩니다. 난자는 난황 막, 모낭 세포의 층과, 혈관 (21)이 포함하는 결합 조직으로 덮여있다. 전체 구조는 "난포."불린다 - 밀도가 페니실린과 스트렙토 마이신 (88 mM의 염화나트륨, 1 ㎜의 KCl, 2.4 mM의 보충 멸균 바스의 식염수 7 (MBS)의 난 모세포를 포함하는 여포로 포장 난소의 로브를 배치의 NaHCO3, 0.82 mM의 황산, 0.41 mM의 CaCl2를 0.33 mM의 칼슘 (NO 3) 2, 10 mM의 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산; HEPES (pH가 7.5, 수산화 나트륨), 100 μg의 / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신).
- 단일 아웃 스테이지 V-VI (21) 난포. 집게로 난소 로브를 잡습니다. 모공을 통해 백금 (그림 1)을 낮추고 부드럽게 난소 조직에서 뿌리를 포함하는 결합 조직을 방해하는 루프를 철회.
참고 : 스테이지 V-VI (21) 모공이 크기을 특징으로한다 (1.0 - 직경 1.2 mm)와 어두운 색소 동물 반구와 황색 식물 반구 사이의 좋은 반면. - 플라스틱 파스퇴르 피펫 (1.5 mm의 공경 뒤로 절단)에 의해 35 mm 직경의 페트리 접시 만 건강적인 모낭 (즉, 완벽한 구형 그대로 색소로)를 옮긴다.
참고 : 여기에 설명 된 미세 주입 시스템이 Kressmann과 Birnstiel (22)에 의해보고 그에서 파생됩니다.
- 시험 관내 전사에 의해 수용체, 폴리 (A +) 꼬리 및 RNA 정량의 첨가를 겔 전기 영동 (23)에 의해 α 4 β 2 δ GABA의 서브 유닛을 코딩하는 cDNA에서 각각 된 cRNA를 준비한다.
- 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 붕규산 유리 모세관 (1.0 mm 외경 (OD), 0.58 mm 내경 (ID), 100mm 길이)에서 미세 주입 피펫을 준비합니다. 경 사진 끝 15㎛ 인 - (12)의 선단부 직경을 만들기 위해 미세 조작기를 사용하고 미사 현미경 유리 모세관의 선단을 끊어.
- 10 ML의 주사기를 사용하여 파라핀 오일과 미세 주입 피펫을 백필, 다음 및 자작 MICR 상에 미세 주입 피펫을 탑재oinjection 장치 (그림 2).
주 : 및 자작 유압 사출 장치는 발 페달 스위치에 의해 제어되는 그릴 모터로 구성되어 있습니다. 추가적인 스위치는 모터의 회전 모드를 변경한다. 이 모터는 전진 또는 10 μL 유리 주사기의 플런저를 후퇴 마이크로 미터 나사 (0.5 mm / 회전)를 구동한다. 주입 약 3 rpm의 속도이며, 0.5 회전은 모낭에 50 내셔널 리그 주입에 해당합니다. 주사기 팁 자체 타이곤 튜브의 짧은 부분으로 주사 바늘에 연결되어 두꺼운 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 관에 연결된다. 주입 모세관은 미세 조작기에 의해 제어되는 드릴 척에 의해 유지된다. 전체 시스템은 파라핀 오일로 채워져있다. 그들은 주입 시스템을 저해하므로 기포는 피해야한다. 설정은 차가운 광원으로 점등됩니다. 실체 현미경은 광학 제어가 필요합니다. 여포는 stereomicr와 차가운 빛 아래 시각화oscope (40X 배율). 사출 설치의 성능은 Xenopus의 난자에 방사성 추적자의 주입에 의해 테스트됩니다. 45의 볼륨 - 55시 NL 주사 당 제공해야합니다. - 멸균 플라스틱 팁 피펫을 사용하여 내 습성 열가소성 (2 × 2cm)의 깨끗한 내부에 무균의 액체 방울을 배치하여 설치를 테스트한다. 이 물방울에 주입 피펫의 끝을 담그고, 다음 플런저 (주입 피펫 내부에 음압을) 철회 할 수있는 모터를 켭니다.
참고 : 물 피펫을 입력하고 기름 보이는 인터페이스를 형성한다. - 액적으로부터 피펫 팁을 후퇴 주입 피펫의 내부에 양압을 적용한다. 물방울이 분사 피펫의 선단에 형성한다.
- 페디큐어의 바닥에 붙어 다음 식물 극 나일론 메쉬의 간극 (0.8 mm G)에서 위쪽으로 가리키는 그들을 일렬로하여 모낭의 주입을위한 준비MBS 덮여 트리 접시 (60mm).
- 열가소성의 깨끗한 내부 상 멸균 플라스틱 팁 피펫을 사용하여 mRNA의 2 μL를 분배. 주입 피펫의 내부에 부압을인가에 의해 주입 피펫으로 mRNA를보십시오.
- 미세 조작기를 사용하여 개별 모낭을 통해 주입 피펫을 배치합니다.
- 식물성 극의 중심에 주사 바늘을 삽입하고 피펫의 내부에 정압을인가하여 0.6 μL / 분의 유속으로 50 mRNA의 거리 nL 주입. mRNA의 탈출을 방지하기 위해 난포에서 주입 피펫 팁을 제거하기 전에 10 초 - 5 기다립니다.
참고 : mRNA를 동물 반구에있는 핵에 주입을 방지하기 위해 식물 (황색) 극에 주입한다. - MBS의 2 mL로 가득 찬 새로운 배양 접시 (35mm)에 주입 된 모공을 전송합니다. 18 ° C로 설정 와인 쿨러에 접시를 놓습니다. 1 주입 된 모공을 품어 -7 일 이내 기록하기 전에, 새롭게 발현 된 단백질의 신원에 따라.
3. 모공의 스트리핑 (그림 3)
주 :으로 알려진, 상기 언급 된 혈관 (24)을 포함하는 난황 층 여포 세포 및 결합 조직에 의해 덮여 난자 같이 "모낭." 세포 표면에 용액의 접근을 방해하지 않고, 기계적 안정성을 제공 난황 층을 제외한 모든 층들은 전기 생리 학적 실험을하기 전에 제거되어야한다. 주변 세포 층이없는 여포는 이전에 "무 결함"난자 (25)라고하고있다. 이 단계는 일반적으로 전기 생리 학적 실험과 동일한 날에 수행된다.
- 열 전달은 MBS 0.5 ㎖, 1 ㎎ / ㎖의 콜라게나 제, 및 0.1 ㎎ / ㎖의 트립신 억제제를 함유하는 보로 실리케이트 유리 튜브에 모낭 주입. 36 ° C로 유지 된 수욕 튜브 빠져. 품어20 분 동안 여포와 가끔 튜브를 흔들.
- RT에서 MBS 1 ㎖를 함유하는 제 2 튜브로 전송하여 모낭을 씻어. 약 10 초 동안 튜브를 남겨주세요.
- 4 mM의 에틸렌 글리콜 비스 (2- aminoethylether)를 포함하는 이중 농축 MBS 0.5ml를 함유 제 튜브 모낭 이동 - N은, N, N ', N'- 테트라 아세트산 (EGTA) 및 4 분으로 그들을 부화 RT. 때때로 튜브를 흔들어.
주 : 고장 성 용액 (배로 농축 MBS)를하여 난자로부터 모낭 세포 층을 분리 모낭 세포 내의 난자 층의 수축을 유도하기 위해 사용된다; EGTA은 콜라게나 제 활성을 억제하기 위해 첨가된다. - RT에서 MBS 1 ㎖를 함유하는 제 2 튜브로 전송하여 모낭을 씻어. 약 10 초 동안 튜브를 남겨주세요.
- MBS 2 용액을 함유하는 페트리 접시 (직경 35mm)에 난자를 옮긴다. 실체 현미경 아래에서 모낭에서 외측 봉투 구분단순히 백금 루프를 사용하여 멀리 벌거 벗은 난자를 밀어.
주 : 난자의 외부 엔벨로프가 배양 접시에 단단히 달라 붙어 용이 난자로부터 분리 될 수있다. 일부 난자는 자발적으로 자신의 외부 봉투를 잃게됩니다 및 무 결함 난자로 복구됩니다. 이 절차는 난자의 구형 모양을 유지하는 상대적으로 안정적인 준비가 발생합니다.
난자의 주위에 4. 빠른 해결 방법 변경
- 9,26 바와 같이, 전압 클램프 실험을 수행한다.
- 실험에 의해 요구되는 관류 스위치를 켜서 중력식 관류 시스템 솔루션을 변경한다.
- 난자 주위 작용제 농도의 빠른 변화를 허용하도록, 난자의 표면으로부터 약 0.4 mm에 배치되는 입 어느 1.35 mm의 내경과 함께 유리 모세관을 6 mL / 분의 관류 액을 적용한다.
참고 : 변화의 속도는 이전에 추정하고있다0.5 미만의 27에서 70 % D 등.
- 난자 주위 작용제 농도의 빠른 변화를 허용하도록, 난자의 표면으로부터 약 0.4 mm에 배치되는 입 어느 1.35 mm의 내경과 함께 유리 모세관을 6 mL / 분의 관류 액을 적용한다.
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Representative Results
아프리카 손톱 개구리의 난모 세포의 기계적 백금 루프 (도 1)를 이용하여 선발 하였다. 0.5 : 난자는 mRNA의 2, δ, 0.5 β, 수용체의 서브 유닛 4 α GABA 코딩에 미세 주입 된 2.5 fmol / 난 모세포 (그림 2). 4 D 후, 모낭 세포 층 (도 3)을 제거 하였다. 난 모세포 전압 -80 MV에 클램프 1 μM 3α, 21- 히드 록시 5α-레그나 20 온 (THDOC)의 강력한 양성 알로 스테 릭 조절제의 존재하에 γ - 아미노 부티르산 (GABA)의 증가하는 농도에 노출 된 GABA 수용체. 도 4a는 실험에 기록 된 원래 현재의 흔적을 보여줍니다. 도 4b는 GABA의 농도에 따라 유발 된 현재의 진폭을 보여줍니다. 이는 GABA 향해이 서브 유니트 조합의 감도 측정을 허용한다. 각각의 곡선은 있었다장착 및 I 최대 표준화 및 이후 평균. 사용 된 식이었다 I (c) = I 최대 C는 반 유도 GABA, EC (50) (1 μM의 THDOC의 존재) GABA의 농도의 농도는 / (1+ (EC 50 / c) N) -maximal 현재의 진폭, I 최대 내가 현재의 진폭, 최대 전류 진폭이고, n은 힐 계수이다. , α 4 β 2 δ GABA의 EC (50)는 수용체는 0.41 ± 0.12 μM 억원, n은 0.76 ± 0.04이었다.
그림 1 : 백금 루프. 백금 와이어 루프 프로토콜 단계 1.4에서 언급. 백금 파편을 생성하지 않고 구부러 질 수있는 금속이며, 스틱 않는다생물학적 물질에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 및 자작 마이크로 인젝션 장치. 장치는 프로토콜 단계 2., 그릴 모터에 설명되어 있습니다; B, 마이크로 미터 나사; C, 주사기 플런저 사이의 스프링; D 10 μL 유리 주사기; 즉, 두꺼운 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 튜브; F, 핸드 드릴 척; g 주사 피펫; 시간, 실체 현미경; 그리고 난, 모터 제어. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
난자의 Defolliculation보기 그림 3. 계획. 난자는 처음 20 분 동안 36 ℃에서 수욕에서 콜라게나 제 용액에서 배양 하였다. 난자 후 변형 바스 배지에서 세정된다. 최종 인큐베이션 단계는 4 분 동안 RT에서 EGTA 고장 성 용액이다. 그 결과, 결합 조직 및 모낭 세포는 무 결함 난자 방법을 제공하기 위해 제거된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
두 전극 전압 클램프 실험에서 그림 4. 현재 추적. 에이, 대가에서 GABA의 농도 반응 곡선으로부터 현재 트레이스, α 4 β 2 δ GABA에게 수용체를 발현하는 Xenopus의 난자에서 얻은 1 μM의 THDOC의 줬어. 막대는 GABA / 1 μM의 THDOC 관류의 시간을 나타냅니다. GABA의 농도 증가는 난자에인가하고, 대응하는 전류 진폭을 측정 하였다. GABA 농도는 막대 위에 표시됩니다. B, , α 4 β 2 δ GABA 수용체의 평균 농도 반응 곡선. 개별 곡선은 장착되어 최대 전류 진폭으로 정규화 처음이었고 이후 평균되었다. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다 N = 3 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 문서에서 설명하는 방법은 전통적으로 7-9 사용되는 일탈. 1 내지 2 시간 콜라게나 제 처리 8 난소 로브를 노출하는 표준이다; 손상되지 않은, 무 결함 난 모세포를 분리; mRNA를 상업적 분사 장치를 사용하여 그것들을 주입. 난자게나 고농도로 긴 노출에 의해 손상 될 가능성이있다 1)이 고전 절차는 다음과 같은 단점을 갖는다. 2) 불안정 무 결함 난자가 실험까지 저장해야합니다. 3) 무 결함 난자가 난포보다 미세 주입하는 동안 고통을 가능성이 더 높습니다. 상용 분사 장치 손상의 비교적 높은 비율을 초래할 가능성이 큰 직경 (약 20 μm의) 주입 바늘을 사용한다. - microinjecti 사용 (15 μm의 12) 콜라게나 제에 대한 노출을 20 분에 한정되며, 무 결함 난자 저장할 수 있고, 피펫의 작은 팁 직경 않는다 : 여기에 기술 된 개선 된 방법의 이점은 다음과 같다에는 mRNA의 주입을위한 모공의 사전 "defolliculation"를 필요로하지 않습니다. 하나의 중요한 단계는 콜라게나 제 용액에서 모낭 배양 온도는 조심스럽게 36 ℃로 조절되어야하며,이를 초과하지 않아야한다는 것이다.
전기 생리 학적 실험에서 용액 변경 사항, 자주 측정 챔버 내의 용액 챔버의 크기 및 살포 속도에 따라 상당한 시간이 소요되며, 변경된다. 이 문제를 피할 관류 모세관을 사용.
한 아프리카 손톱 개구리의 난모 세포의 이온 채널의 발현의 주요 단점은 거대한 크기이다. 전압 제어는 빠른 약 2 밀리 어려운, 매우 빠른 것보다 (<0.5 초) 솔루션의 변경 사항은 정교한 절차가 필요합니다. 또한, 강한 소수성 물질이 거의 난자의 난황에 비가 역적으로 결합 될 수있다.
여기에 설명 된 방법을 조사하기 위해 우리를 허용 한시간을 절약하게하는 재조합 GABA A는 수용체 자신의 합성 화합물 및 식물 물질들이 단위체 배열에 의해 변조하고, 다른 서브 유닛 조성물의 약물 수용체 결합 부위의 위치의 기능적 특성. 여기에 설명 된 방법은 제노 푸스 난 모세포에서 선택한 임의의 단백질의 발현에 적합하다. 난자 주위 매질의 빠른 변화 용액의 아주 간단한 방법은 리간드 개폐 통로 또는 캐리어의 연구에 적용될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | 71380 | |
| KCl | Sigma | P-9541 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| MgSO4 | Sigma | M-1880 | |
| CaCl2 | Sigma | 223560 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma | C1396 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Penicilin/streptomycin | Gibco | 15140-148 | 100 μg penicillin/mL and 100 μg streptomycin/mL |
| Platinum wire loop | home-made | ||
| Micropipette puller | Zeitz-Instruments GmBH | DMZ | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80300 | 10 μL, Type 701N |
| Thick walled polytetrafluoroethylene tubing | Labmarket GmBH | 1.0 mm OD | |
| Paraffin oil | Sigma | 18512 | |
| Nylon net, G: 0.8 mm | ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG | ||
| Borosilicate glass tube | Corning | 99445-12 | PYREX |
| Collagenase NB Standard Grade | SERVA | 17454 | |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma | T-9003 | |
| EGTA | Sigma | E3389 | |
| Glass capillary | Jencons (Scientific ) LTD. | H15/10 | 1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0019 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 Length mm (for microinjection) |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0044 | 1.2 OD x 0.69 ID x 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp) |
| γ-Aminobutyric acid (GABA) | Sigma | A2129 | |
| 3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC) | Sigma | P2016 | |
| grill motor | Faulhaber | DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2 | |
| micrometer screw | Kiener-Wittlin | 10400 | TESA, AR 02.11201 |
| Sterile plastic transfer pipettes | Saint-Amand Mfg. | 222-20S |
References
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