Abstract
Proteinler için bir heterolog sentezleme sistemi olarak Xenopus oosit birinci Gurdon ve diğerleri tarafından tarif edilmiştir. 1 ve yaygın olarak keşfinden beri kullanılan (Referanslar 2-3, ve oradaki referanslar). Yabancı kanal ifadesi için oosit çekici kılan bir özellik endojen iyon kanalları 4 kötü bolluğu. Bu ifade sistemi ligand-kapılı iyon kanalı, aralarında çok sayıda proteinlerin karakterizasyonu için yararlı olduğu kanıtlanmıştır.
GABA A Kara kurbağası cinsi oositlerinde reseptörleri ve bunların fonksiyonel karakterizasyonu sentezleme oosit, cRNA, foliküler hücre tabakası çıkarılması ve elektrofizyolojik deneyler hızlı çözüm değişikliklerle microinjections izolasyonu da dahil olmak üzere, burada anlatılmıştır. Işlemler bu laboratuarda 5,6 optimize edilmiş ve rutin 7-9 kullanılan olanlardan sapma bulundu. Geleneksel olarak, soyulmuş oositler hazırlanırRT'de yumurtalık loblar uzun bir kollajenaz muamelesi ve bu soyulmuş oosit ile mRNA ile microinjected edilir. Optimize edilmiş yöntemler kullanılarak, çeşitli membran proteinleri olarak ifade edilmiştir ve rekombinant GABA A reseptörleri 10-12, insan rekombinant klorür kanalları 13, tripanosom potasyum kanallarının 14 ve miyo -inositol taşıyıcı 15, 16 olduğu gibi, bu sistem ile incelenmiştir.
Burada ayrıntılı yöntemler, Xenopus oositlerde seçim herhangi bir proteinin ekspresyonu tatbik edilebilir, ve hızlı bir çözüm değişikliğin diğer ligand-kapılı iyon kanallarının incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Xenopus oositleri yaygın (- 3, ve oradaki referanslar Kaynaklar 2) bir ekspresyon sistemi olarak kullanılmaktadır. Onlar düzgün montaj ve plazma zarlarının içine fonksiyonel olarak aktif birden fazla alt proteinleri dahil edebiliyoruz. Bu sistemi kullanarak, fonksiyonel olarak, tek başına ya da başka proteinlerle birlikte zar proteinleri araştırılması mutasyon, kimerik ya da birleştirilmiş proteinlerin özelliklerini incelemek için, ve potansiyel ilaçların incelenmesi için mümkündür.
başka heterolog sentezleme sistemleri üzerinden oosit kullanmanın avantajları dev hücre kolay kullanım, yabancı genetik bilgi Banyo perfüzyonu ile oositin bir ortamda kolayca kontrol eksprese eden hücrelerin yüksek oranda ve membran potansiyelinin kontrolü, .
Bu ifade sisteminin dezavantajı birçok laboratuvarda 17-20 gözlenen mevsimsel çeşididir. Bu varyasyon nedeninet olmaktan çok uzaktır. Buna ek olarak, oosit kalitesi genellikle güçlü bir değişiklik gözlenmiştir. Geleneksel yöntemler 7-9 yumurtalık loblar izolasyonunu, bazı saat kollajenaz için yumurtalık lobların pozlama, soyulmuş oosit seçimi ve oosit mikroenjeksiyon dahil ettik. Burada, alternatif, hızlı prosedürlerin bir dizi bize oosit kalitesinde mevsimsel değişimi ve küçük farklılıklar ile 30 yılı aşkın için bu ifade sistemi ile çalışmak için izin olduğunu bildirildi.
Oosit izolasyonu, mikro enjeksiyon cRNA ile ve foliküler hücre tabakası çıkarılması için anlatılan tadil edilmiş ve geliştirilmiş yöntemler, Xenopus oosit içinde tercih edilen bir proteinin ekspresyonu için kullanılabilir. oositin etrafında orta hızlı çözeltisi değişiklikleri için çok basit bir yöntem, herhangi bir ligand-kapılı iyon kanalı ve taşıyıcıların çalışmaya uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan deneyleri Bern Kantonu Kantonstierarzt yerel komite, Kantonaler Veterinärdienst Bern (BE85 / 15) tarafından onaylanmıştır.
Kara kurbağası cinsi oositlerinde hazırlanması 1.
- Katı, 20 ° C 'de muhafaza edilir, su içinde 12 saat / 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsünde kurbağa (Xenopus laevis) tutun.
- Dişi kurbağa 9'dan yumurtalıkların lobları çıkarın.
NOT: lobların kaldırma rejenerasyonu için bir uyarıcı olduğunu ve sık sık oosit kalitesi cerrahisi ile geliştirir. Oosit, bir Vitellin tabakası, folikül hücrelerinin hücre tabakası, ve kan damarları 21 ihtiva eden bağ dokusu ile kaplıdır. tüm yapı "folikülü." denir - Yoğun penisilin ve streptomisin (88 mM NaCl, 1 mM KCI, 2.4 mM ile desteklenmiş steril Barth'ın Tuzlu 7 (MBS) içinde oosit içeren folikül ile paketlenir yumurtalıkların lobları yerleştirinNaHCO 3, 0.82 mM MgSO 4, 0.41 mM CaCl2, 0.33 mM Ca (NO 3) 2, 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit; HEPES (pH 7.5, NaOH), 100 ug / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin).
- Tek çıkış aşaması V-VI 21 folikülleri. forseps ile yumurtalık lob tutun. Köklerinin üzerinde platin döngü (Şekil 1) indirin ve yavaşça yumurtalık dokusundan folikülü içeren bağ dokusu bozmaya döngü çekin.
NOT: Sahne V-VI 21 folikül kendi büyüklüğü ile karakterize edilir (1.0 - çapı 1,2 mm) ve koyu pigmente hayvan yarımkürede ve sarımsı bitkisel yarımkürede arasında iyi aksine. - Bir plastik Pasteur pipeti (1.5 mm'lik bir açıklık çapına geri kesilmiş) vasıtasıyla 35 mm çaplı Petri kabı sadece sağlıklı görünümlü folikülleri (yani mükemmel küresel ve bozulmamış pigmentasyon ile) aktarın.
Not: Burada açıklanan mikroenjeksiyon sistemi Kressmann ve Birnstiel 22 tarafından bildirilen türetilmiştir.
- In vitro transkripsiyon bir alıcı, bir poli (A +) kuyruğu ve RNA miktarının eklenmesi jel elektroforezi 23 tarafından α 4 β 2 δ GABA alt birimleri kodlayan ilgili cDNA'lardan cRNAs hazırlayın.
- Mikropipet çektirmenin kullanarak borosilikat cam kılcal damarlar (1.0 mm dış çapı (OD), 0.58 mm iç çapı (ID), 100 mm uzunluk) den mikroenjeksiyon pipetler hazırlayın. bir eğimli ucu ile 15 mikron - 12 bir ucu çapı oluşturmak için bir mikromanipülatör ve microfilament kullanarak bir mikroskop altında cam kılcal damarların ipuçları kesiyorum.
- 10 ml şırınga kullanılarak parafin yağı ile mikroenjeksiyon pipetler dolgu, ve daha sonra bir homebuilt MICR üzerine mikroenjeksiyon pipet monteoinjection cihaz (Şekil 2).
NOT: homebuilt yağ hidrolik enjeksiyon cihazı, bir ayak pedalı ile kontrol edilen bir ızgara motorundan oluşmaktadır. Ek bir anahtar motorun dönme modunu değiştirir. Bu motor, avans ya da 10 uL cam şırınga pistonu geri çekilir bir mikrometre vidası (0,5 mm / dönüş) çalıştırır. Enjeksiyon 3 rpm'lik bir hızda ve bir 0.5 dönüş folikül bir 50 nL enjeksiyon karşılık gelir. şırınga ucu kendisine Tygon hortumunun çok kısa bir parça enjeksiyon iğnesine bağlanır kalın duvarlı politetrafluoroetilen boru bağlanmıştır. Enjeksiyon kılcal bir micromanipulator tarafından denetlenen bir mandrenle tarafından düzenlenmektedir. Tüm sistem parafin yağı ile doldurulur. Onlar enjeksiyon sistemine zarar verecek herhangi bir hava kabarcıkları, kaçınılmalıdır. Kur soğuk ışık kaynağı ile aydınlatılmış. Bir stereomikroskop optik kontrol için gereklidir. Foliküllerinin bir stereomicr soğuk ışık altında görüntülenmiştirOscope (40X büyütme). Enjeksiyon kurulum Performans Xenopus oosit içine radyoaktif izleyici enjeksiyonu ile test edilir. 45 A hacim - 55 nL enjeksiyon başına teslim edilmelidir. - steril plastik uçlu bir pipet kullanılarak, neme karşı dirençli bir termoplastik (2 x 2 cm), temiz iç kısmına steril bir su damlasının yerleştirilmesi kurulumu test. Bu damlacık içine enjeksiyon pipet ucu batırın ve sonra pistonu (enjeksiyon pipet içinde negatif basınç) geri çekmek için motoru çevirin.
NOT: Su pipet girmek ve yağ ile görünür bir arayüz oluşturmalıdır. - damlacık gelen pipet ucu geri çekin ve enjeksiyon pipet içine pozitif basınç uygulayın. Bir su damlacığı enjeksiyon pipetine ucunda oluşturmalıdır.
- Bir Pe altına yapıştırılmış: bitkisel kutuplar naylon örgü boşlukları (0.8 mm G) yukarı bakacak şekilde onları sıraya folikül enjeksiyon için hazırlayınMBS ile kaplı üç çanak (60 mm).
- Bir termoplastik temiz iç kısmına steril plastik uçlu bir pipet kullanılarak mRNA 2 ul koyun. enjeksiyon pipetine içine negatif basınç uygulayarak, enjeksiyon pipetine mRNA al.
- Mikromanipülatör kullanarak bireysel folikül üzerinde enjeksiyon pipet yerleştirin.
- Bitkisel kutup merkezine iğne takın ve pipet içine pozitif basınç uygulayarak 0.6 mL / dk'lık bir akış oranında mRNA 50 nL enjekte edilir. mRNA kaçış önlemek için folikül enjeksiyon pipet çıkarmadan önce 10 sn - 5 bekleyin.
NOT: mRNA hayvan yarımkürede yer alan çekirdeğin içine enjeksiyon önlemek için bitkisel (sarımsı) kutupta enjekte edilmelidir. - MBS 2 mL dolu yeni bir petri (35 mm) enjekte folikülleri aktarın. 18 ° C'ye ayarlanmış bir şarap soğutucuya çanak yerleştirin. 1 enjekte folikülleri inkübe -7 gün Kayıttan önce, yeni Sentezlenen proteinin ne olduğu ile ilgili olarak.
3. Foliküllerinden soyma (Şekil 3)
NOT: olarak bilinen, yukarıda belirtilen kan damarları 24 içeren bir vitelline tabakası, folikül hücreleri ve bağ dokusu ile kaplıdır oosit olarak "folikül." hücre yüzeyine çözümleri erişim engellemeden, mekanik stabilite temin vitelline tabakası hariç tüm tabakalar elektrofizyolojik deneyler önce çıkarılmalıdır. Çevredeki hücre katmanları olmadan folikül önce bir "soyulmuş" oosit 25 olarak adlandırılmıştır. Bu adım genellikle elektrofizyolojik deneyler ile aynı gün yapılır.
- Aktarım on MBS 0.5 mL, 1 mg / ml kollajenaz, ve 0.1 mg / ml tripsin inhibitörü içeren bir borosilikat cam tüp köklerinin enjekte edilmiştir. 36 ° C 'de muhafaza edilen bir su banyosu içinde tüp bırakın. tasarlamak20 dakika folikülleri ve bazen tüpler sallayın.
- RT'de MBS 1 mL içeren ikinci bir tüp onlara aktararak folikülleri durulayın. yaklaşık 10 saniye süreyle tüp onları bırakın.
- 4 mM etilen glikol-bis (2-aminoetileter) ihtiva eden iki kat konsantre edilmiş MBS 0.5 mL ihtiva eden bir üçüncü tüpe köklerinin transfer - N, N, N ', N'-tetraasetik asit (EGTA) ve 4 dk için inkübe RT. bazen tüp sallayın.
Not: hipertonik çözeltisi (iki kat konsantre edildi MBS) ve böylece oositten foliküler hücre katmanları ayırma folikül hücresi tabakaları içinde oosit, bir çekme indüklemek için kullanılır; EGTA kolajenaz aktivitesini inhibe eklenir. - RT'de MBS 1 mL içeren ikinci bir tüp onlara aktararak folikülleri durulayın. yaklaşık 10 saniye süreyle tüp onları bırakın.
- MBS 2 mL içeren bir Petri kabı (35 mm çap) oosit aktarın. Bir stereomikroskop altında, tarafından köklerinin gelen dış zarfları ayrısadece platin döngü kullanarak Çıplak oosit iterek.
NOT: oosit dış zarf kültür kabı sıkıca kalan ve kolayca oosit ayrılabilir. Bazı oosit kendiliğinden dış zarfları kaybedecek ve soyulmuş oosit olarak telafi edilecektir. Bu prosedür oosit küresel görünümünü korur nispeten istikrarlı bir hazırlık olur.
Oosit etrafında 4. Hızlı Çözüm Değişikliği
- 9,26 tarif edildiği gibi, bir voltaj kelepçesi deneyi gerçekleştirmek.
- deney gereği perfüzyon anahtarları çevirerek yerçekimi beslenen perfüzyon sisteminin çözümünü değiştirin.
- oositin etrafında agonist konsantrasyonunu hızlı değişiklikler izin vermek için, oosit yüzeyinden yaklaşık 0.4 mm yerleştirilir ağzı olan 1.35 mm'lik bir iç çapa sahip bir cam kılcal yoluyla 6 mL / dakika perfüzyon çözeltisi uygulanır.
NOT: değişim hızı önceden tahmini olmuşturaz 0,5 s 27 70% olarak, d.
- oositin etrafında agonist konsantrasyonunu hızlı değişiklikler izin vermek için, oosit yüzeyinden yaklaşık 0.4 mm yerleştirilir ağzı olan 1.35 mm'lik bir iç çapa sahip bir cam kılcal yoluyla 6 mL / dakika perfüzyon çözeltisi uygulanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Xenopus oositleri mekanik bir platin döngü (Şekil 1) kullanılarak ayrılmıştı. 0.5: oosit mRNA 2, δ, 0.5 p, A reseptör alt birimleri 4 a GABA kodlayan microinjected, 2.5 fmol / oosit (Şekil 2). 4 Gün sonra, foliküler hücre tabakaları (Şekil 3) uzaklaştırılmıştır. Oositler voltaj -80 mV'de kenetlendi ve 1 uM 3a, 21-dihidroksi-5α-pregnan-20-on (THDOC), güçlü bir pozitif allosterik modülatör mevcudiyetinde γ-aminobutirik asit (GABA) artan konsantrasyonlarına maruz bırakılmıştır GABA A reseptör. Şekil 4A, böyle bir deneyde kaydedilen orijinal akım izlerini göstermektedir. Şekil 4B GABA konsantrasyonları bağlı ortaya çıkardı akım genliği gösterir. Bu GABA karşı bu alt birim kombinasyonu duyarlılığı belirlenmesini sağlar. Bireysel eğrileri vardıtakıldı ve ben max standardize ve daha sonra ortalama. Kullanılan denklem I (c) = max C yarım ortaya çıkarma GABA, EC 50 (1 uM THDOC varlığında) GABA konsantrasyonu konsantrasyonudur / (1 + (AT 50 / C) n) -maximal akım amplitüdü, Max geçerli genliği, maksimum akım genliği ve n, Hill katsayısı olan. Α 4 β 2 δ GABA EC50 bir reseptör 0.41 ± 0.12 uM tutarında ve n 0.76 ± 0.04 idi.
Şekil 1: Platin Döngü. platin tel döngü protokol aşamasında 1.4 bahsetti. Platin şimdiye üretmeden bükülebilir bir metal ve yapışmazBiyolojik malzeme. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Homebuilt Mikroenjeksiyon cihaz. Cihaz protokol 2. adımda bir, ızgara motoru tarif edilmektedir; b mikrometre vida; c şırınga ve pistonu arasındaki bahar; d 10 uL cam şırınga; E, kalın duvarlı politetrafluoroetilen boru; f, el matkabı ayna; g, enjeksiyon pipetine; H, stereomikroskop; ve ben, motor kontrol. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bir Oosit ve Defolliculation Gösterilen Şekil 3. Şema. Oositler, ilk 20 dakika boyunca 36 ° C'de bir su banyosu içinde bir kolajenaz çözeltisi içinde inkübe edilmektedir. Oositler daha sonra bir tadil edilmiş Barth ortam içinde yıkanmıştır. Son inkübasyon aşama 4 dakika boyunca oda sıcaklığında hipertonik EGTA çözelti halindedir. Bunun bir sonucu olarak, bağ dokusu ve folikül hücrelerin soyulmuş oosit yol vermek için kaldırılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bir İki elektrot Gerilim Kelepçe Deney gelen Şekil 4. Güncel izleri. A, pres bir GABA konsantrasyonu tepki eğrisinden akım izleriniα 4 β 2 δ GABA A reseptörü ifade eden bir Xenopus oosit elde edilen 1 uM THDOC ve ence. barlar GABA / 1 uM THDOC perfüzyon süreyi gösterir. GABA artan konsantrasyonları oositlere uygulandı, ve karşılık gelen akım genlikleri, belirlenmiştir. GABA konsantrasyonları barlar yukarıda belirtilmiştir. B, Α 4 β 2 δ GABA A reseptör olan ortalama konsantrasyon yanıt eğrileri. Bireysel eğrileri monte azami akımın genliği normalize ilk ve daha sonra ortalamaları alındı. Veri, ortalama ± SD olarak gösterilmiştir n = 3 , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede açıklanan yöntemler geleneksel 7-9 kullanılan sapma. 1 ila 2 saat kollajenaz muamelesi 8 yumurtalık lobları maruz standarttır; hasarsız, soyulmuş oosit izole; ve mRNA ticari enjeksiyon cihazlarını kullanarak bunları enjekte edin. Oositler, kollajenaz yüksek konsantrasyonda uzun maruz bırakılma ile zarar olması muhtemeldir 1): Klasik bir prosedür, aşağıdaki dezavantajları vardır. 2) kararsız soyulmuş oosit deney kadar saklanmalıdır. 3) Köreltilmiş oosit köklerinin daha mikroenjeksiyon sırasında zarar olasılığı daha yüksektir. Ticari enjeksiyon cihazları hasar, nispeten yüksek bir oranda yol açması muhtemel büyük çaplı (yaklaşık 20 um), enjeksiyon iğneleri kullanmak. - Microinjecti için kullanılan (15 um ila yaklaşık 12), kolajenaz maruz kalma, 20 dakika ile sınırlıdır, soyulmuş oositler depolanması gerekir ve pipetler küçük uç çapı değildir: Burada tarif edilen geliştirilmiş işlemin avantajları, aşağıdaki gibidirüzerinde mRNA enjeksiyon için köklerinin önce "defolliculation" gerektirmez. Tek kritik bir adım kollajenaz çözüm folikül inkübasyon sıcaklığı dikkatle 36 ° C'ye ayarlanmalıdır ve geçmemesi gerektiğidir.
elektrofizyolojik deneylerinde çözelti değişimi için, çoğu zaman ölçüm gözüne solüsyon haznesinin boyutu ve perfüzyon oranına bağlı olarak, bir zaman önemli miktarda alır, değiştirilir. Bu kaçınılması perfüzyon kılcal kullanma.
Kara kurbağası cinsi oositlerinde iyon kanallarının sentezlenmesi büyük dezavantajı, dev boyutudur. Gerilim kontrolü daha hızlı yaklaşık 2 ms zor ve çok hızlı daha (<0.5 sn) çözümü değişiklikleri ayrıntılı prosedürler gerektirir. Ayrıca, güçlü bir hidrofobik maddeler hemen oositin yumurtasına geri dönüşü olmayan bağlı olabilir.
Burada özetlenen yöntemler araştırmak için bize izinbir zaman tasarrufu sağlayan bir şekilde yeniden birleştirici GABA A reseptörleri, bunların sentetik bileşikler ve bitki maddeleri, kendi alt-birimi düzenlemesi ile modülasyon ve farklı alt birim bileşimin reseptörlerinin ilaç bağlanma sitelerinin yerini işlevsel özellikleri. Burada tarif edilen yöntemler, Xenopus oosit içinde tercih edilen bir proteinin ekspresyonu için uygundur. oositin etrafında orta hızlı çözeltisi değişiklikleri için çok basit bir yöntem, herhangi bir ligand-kapılı iyon kanalı veya taşıyıcı çalışmaya uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | 71380 | |
| KCl | Sigma | P-9541 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| MgSO4 | Sigma | M-1880 | |
| CaCl2 | Sigma | 223560 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma | C1396 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Penicilin/streptomycin | Gibco | 15140-148 | 100 μg penicillin/mL and 100 μg streptomycin/mL |
| Platinum wire loop | home-made | ||
| Micropipette puller | Zeitz-Instruments GmBH | DMZ | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80300 | 10 μL, Type 701N |
| Thick walled polytetrafluoroethylene tubing | Labmarket GmBH | 1.0 mm OD | |
| Paraffin oil | Sigma | 18512 | |
| Nylon net, G: 0.8 mm | ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG | ||
| Borosilicate glass tube | Corning | 99445-12 | PYREX |
| Collagenase NB Standard Grade | SERVA | 17454 | |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma | T-9003 | |
| EGTA | Sigma | E3389 | |
| Glass capillary | Jencons (Scientific ) LTD. | H15/10 | 1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0019 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 Length mm (for microinjection) |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0044 | 1.2 OD x 0.69 ID x 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp) |
| γ-Aminobutyric acid (GABA) | Sigma | A2129 | |
| 3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC) | Sigma | P2016 | |
| grill motor | Faulhaber | DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2 | |
| micrometer screw | Kiener-Wittlin | 10400 | TESA, AR 02.11201 |
| Sterile plastic transfer pipettes | Saint-Amand Mfg. | 222-20S |
References
- Gurdon, J. B., Lane, C. D., Woodland, H. R., Marbaix, G. Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells. Nature. 233 (5316), 177-182 (1971).
- Soreq, H. The biosynthesis of biologically active proteins in mRNA-microinjected Xenopus oocytes. CRC Crit Rev Biochem. 18 (3), 199-238 (1985).
- Sigel, E. Use of Xenopus oocytes for the functional expression of plasma membrane proteins. J Membr Biol. 117 (3), 201-221 (1990).
- Dascal, N. The use of Xenopus oocytes for the study of ion channels. CRC Crit Rev Biochem. 22 (4), 317-387 (1987).
- Sigel, E. Properties of single sodium channels translated by Xenopus oocytes after injection with messenger ribonucleic acid. J Physiol. 386, 73-90 (1987).
- Sigel, E., Minier, F. The Xenopus oocyte: system for the study of functional expression and modulation of proteins. Mol Nutr Food Res. 49 (3), 228-234 (2005).
- Colman, A. Expression of exogenous DNA in Xenopus oocytes. Transcription and Translation'A Practical Approach. Hames, B. D., Higgins, S. J. , IRL Press. Oxford. 49-69 (1984).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M.
- Smart, T. G., Krishek, B. J. Xenopus oocyte microinjection and ion-channel expression. Patch-Clamp Applications and Protocols. Boulton, A. A., Baker,, Wolfgang, W. alz , Humana Press. New Jersey. 259-305 (1995).
- Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Functional sites involved in modulation of the GABA receptor channel by the intravenous anesthetics propofol, etomidate and pentobarbital. Neuropharmacology. 105, 207-214 (2016).
- Maldifassi, M. C., Baur, R., Pierce, D., Nourmahnad, A., Forman, S. A., Sigel, E. Novel positive allosteric modulators of GABAA receptors with anesthetic activity. Sci Rep. 6, 25943 (2016).
- Wongsamitkul, N., Baur, R., Sigel, E. Towards understanding functional properties and subunit arrangement of α4β2δ GABAA receptors. J Biol Chem. 291 (35), 18474-18483 (2016).
- Burgunder, J. M., et al. Novel chloride channel mutations leading to mild myotonia among Chinese. Neuromuscul Disord. 18 (8), 633-640 (2008).
- Steinmann, M. E., Gonzalez-Salgado, A., Butikofer, P., Maser, P., Sigel, E. A heteromeric potassium channel involved in the modulation of the plasma membrane potential is essential for the survival of African trypanosomes. FASEB J. 29 (8), 3228-3237 (2015).
- Gonzalez-Salgado, A., et al. myo-Inositol uptake is essential for bulk inositol phospholipid but not glycosylphosphatidylinositol synthesis in Trypanosoma brucei. J Biol Chem. 287 (16), 13313-13323 (2012).
- Gonzalez-Salgado, A., et al. Trypanosoma brucei Bloodstream Forms Depend upon Uptake of myo-Inositol for Golgi Complex Phosphatidylinositol Synthesis and Normal Cell Growth. Eukaryot Cell. 14 (6), 616-624 (2015).
- Wu, M., Gerhart, J.
- Gurdon, J. B. American clawed frogs. Methods in developmental biology. Wilt, F. H., Wessels, N. K. , Thomas Y. Crowell Co. New York. 75-84 (1967).
- Elsner, H. A., Honck, H. H., Willmann, F., Kreienkamp, H. J., Iglauer, F. Poor quality of oocytes from Xenopus laevis used in laboratory experiments: prevention by use of antiseptic surgical technique and antibiotic supplementation. Comp Med. 50 (2), 206-211 (2000).
- Green, S. L. Factors affecting oogenesis in the South African clawed frog (Xenopus laevis). Comp Med. 52 (4), 307-312 (2002).
- Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals. J Morphol. 136 (2), 153-179 (1972).
- Kressmann, A. Birnstiel M.L. Surrogate genetics. Transfer of Cell Constituents into Eucaryotic Cells. Celis, J. E., Grassmann, A., Loyter, A. , Plenum Press. 388-407 (1980).
- Middendorp, S. J., Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Positive modulation of synaptic and extrasynaptic GABAA receptors by an antagonist of the high affinity benzodiazepine binding site. Neuropharmacology. 95, 459-467 (2015).
- Dumont, J. N., Brummett, A. R. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). V. Relationships between developing oocytes and their investing follicular tissues. J Morphol. 155 (1), 73-97 (1978).
- Dascal, N., Landau, E. M., Lass, Y. Xenopus oocyte resting potential, muscarinic responses and the role of calcium and guanosine 3',5'-cyclic monophosphate. J Physiol. 352, 551-574 (1984).
- Buckingham, S. D., Pym, L., Sattelle, D. B. Oocytes as an expression system for studying receptor/channel targets of drugs and pesticides. Methods Mol Biol. 322, 331-345 (2006).
- Sigel, E., Baur, R., Trube, G., Möhler, H., Malherbe, P. The effect of subunit combination of rat brain GABAA receptors on channel function. Neuron. 5, 703-711 (1990).
