Summary
Mise en oeuvre d'un modèle orthotopique de carcinome rénal chez les souris immunocompétentes donne le chercheur un système cliniquement pertinente définie par la présence d'une tumeur rénale et des métastases pulmonaires primaires dans le même animal. Ce système peut être utilisé pour tester précliniquement une variété de traitements in vivo.
Abstract
carcinome à cellules rénales (RCC) affecte> 60.000 personnes aux Etats-Unis chaque année, et environ 30% des patients RCC ont de multiples métastases au moment du diagnostic. RCC métastasique (CRm) est incurable, avec un temps de survie médian de 18 mois. Interventions à base immunitaire (par exemple, l' interféron (IFN) et l' interleukine (IL) -2) induire des réponses durables dans une fraction des patients CRCR et les inhibiteurs de kinases multiples (par exemple, sunitinib ou sorafenib) ou anti-récepteur de VEGF anticorps monoclonaux (mAb) sont en grande partie palliatives, comme rémissions complètes sont rares. De telles lacunes dans les thérapies actuelles pour les patients MRCC fournissent la justification de l'élaboration de protocoles de traitement nouveaux. Un élément clé dans le test pré-clinique de nouvelles thérapies de MRCC est un modèle animal approprié. caractéristiques bénéfiques qui récapitulent la condition humaine comprennent une tumeur rénale primaire, métastases tumorales rénales, et un système immunitaire intact d'enquêter sur toute effecto immunitaire axée sur la thérapieRéponses r et la formation de facteurs immunosuppresseurs induite par une tumeur. Ce rapport décrit un modèle de souris orthotopique mRCC qui a toutes ces caractéristiques. Nous décrivons une technique d'implantation intrarénal en utilisant la lignée cellulaire rénale de la souris adénocarcinomes Renca, suivi par l'évaluation de la croissance tumorale dans le rein (site principal) et les poumons (site métastatique).
Introduction
Carcinome à cellules rénales (RCC) représente la majorité des tumeurs malignes du rein et environ 3% de toutes les tumeurs malignes des adultes dans le monde entier 1, 2. En raison de l' absence de symptômes, diagnostics erronés, et des outils de dépistage insuffisantes pour RCC, près de 30% des patients présentent un cancer du rein métastatique (MRCC) au moment du diagnostic, avec un 20-30% supplémentaire des patients évoluant vers un stade métastatique 2. Ces cas donnent lieu à ~ 13.500 décès par an 1, 3. Bien que la détection précoce et le traitement du RCC primaire a amélioré, le taux de décès liés à la RCC continue d'augmenter, ce qui suggère que la maladie métastatique est en grande partie responsable de la mortalité 3. le développement de la thérapie pour RCC a progressé au cours de la dernière décennie avec la découverte et la mise en œuvre des thérapies ciblées et immunothérapies. Malheureusement, SURVIV sans progressional et la survie globale des cas avancés sont encore bien moins de 2 ans pour la majorité des patients 4, 5, 6. Ces statistiques justifient la nécessité de poursuivre la recherche sur l'identification et le développement de traitements efficaces pour RCC. Pour faire avancer de manière adéquate les interventions thérapeutiques de MRCC, traductionnelle pertinents modèles pré-cliniques de la maladie sont d'abord nécessaires.
Développement d'un modèle pertinent et cohérent pour récapituler la condition humaine du RCC avancé devrait répondre à plusieurs questions clés: 1) Le modèle est anatomiquement pertinent; 2) Est-ce que les progrès de la tumeur de façon similaire à la pathologie humaine; 3) Est-ce métastases proviennent de la tumeur primitive; et 4) peut progression de la tumeur primaire et métastatique surveiller au fil du temps? Selon le type de traitement à l'étude, les lignées cellulaires de souris de tumeurs RCC, des lignées de cellules tumorales RCC humaines et xenog patient humain dérivé RCCradeaux peuvent être utilisés dans des souris immunocompétentes ou immunodéprimées. Un hôte avec un système immunitaire intact et fonctionnel est requis pour ces études évaluant un aspect de l' immunothérapie, ce qui nécessite l'utilisation de la lignée de cellules Renca bien décrit dérivée d'un adénocarcinome rénal spontanée des souris Balb / c 7. La plupart des études injectent cellules RENCA sous - cutanée (sc), qui forme une tumeur locale facile à mesurer, ou par voie intraveineuse (iv) à des souris Balb / c pour produire des "métastases" pulmonaires expérimentales 8, 9, 10, 11, 12. Utilisation d'une tumeur Renca implanté sc-RCC au modèle humain a un certain nombre de limitations, y compris innervation inexacte de vascularisation 13, les différences de microenvironnement 14, 15, et l'absence d'organe / tumeur cellulaire Communication 13, 16. En outre, de nombreuses tumeurs sc ( en particulier Renca) ne métastasent pas aux organes distaux, l' inhibition de l'étude d'un événement qui est une caractéristique clinique commune 17. Pour étudier CRm, cellules RENCA peuvent être injectées par voie iv à établir la charge tumorale dans les poumons, l'emplacement principal de métastases chez des patients atteints de RCC. La méthode d'injection par voie intraveineuse d'initier des tumeurs métastatiques, cependant, ne permet pas l'étude de la manière dont, quand, ou pourquoi les cellules ont migré de l'organe primaire ( par exemple, le rein) vers le site distant. Un modèle à la fois la maladie primaire et métastatique évidente dans le même animal est cruciale pour étudier la progression et le traitement de la maladie avancée, d'autant plus que les métastases sont généralement la cause de mortalité chez ces patients.
Notre laboratoire a mis au point un modèle murin de mRCC qui intègre toutes les fonctionnalités décrites ci-dessus. Pour établir prtumeurs imary, orthotopique, cellules RENCA sont implantés directement dans le rein de l'animal à travers le péritoine translucide. Une petite incision dans le flanc gauche permet la visualisation de la rate (en tant que point de repère), et le rein gauche. En utilisant une aiguille de petit calibre, les cellules tumorales Renca sont injectés directement dans le rein à travers le péritoine pour une implantation orthotopique. Par rapport à d' autres méthodes d'implantation de cellules Renca sous la capsule du rein 18, cette méthode d'implantation permet un débit plus élevé, car il est assez non invasive, ne nécessite pas suturer, est d'une classe faible de la douleur, et le temps efficace lorsque exercé.
Ces résultats du modèle bien caractérisé en charge de la tumeur primaire reproductible (~ de taux d'utilisation de 99%) dans le rein injecté ainsi que la charge de la tumeur métastatique dans les poumons. Les avantages significatifs de ce modèle sont sa nature syngéniques, ce qui permet des enquêtes d'immunothérapie; ses métastases spontanées, pour étudier unemaladie VANCÉES; et son implantation orthotopique, pour modéliser l'impact anatomique sur la progression et le traitement des maladies. Les thérapies visant à cibler RCC bénéficieraient grandement de l'utilisation de ce modèle au cours du développement pré-clinique.
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Protocol
Le protocole suivant décrit une procédure expérimentale pour induire et surveiller la croissance des tumeurs rénales orthotopique expérimentales et des métastases spontanées potentielles. Toutes les procédures suivantes sont effectuées conformément aux politiques et procédures approuvées institutionnelles concernant l'utilisation humaine des animaux de laboratoire.
1. Entretien de lignées cellulaires
- Maintenir la lignée cellulaire d'adénocarcinome rénal murin, Renca, dans Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 additionné de 10% de sérum de veau foetal (FCS), 1% de pénicilline-streptomycine et 1 mM de chacun des acides aminés non essentiels, de L-glutamine , et du pyruvate de sodium (appelé RPMI complet). Des cellules de culture dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2.
NOTE: Comme pour toute lignée cellulaire établie, il est recommandé d'utiliser à faible nombre de cellules RENCA passage pour la transfection et l'implantation ultérieure afin de minimiser les changements phénotypiques ou génétiques qui pourraient se produire après le culte à long termeure.- Utiliser un système de transposon à l'ingénieur cellules RENCA pour exprimer de manière stable la protéine fluorescente verte (GFP) et la luciférase de luciole.
- En utilisant un réactif de transfection à base de liposomes cationiques, co-transfecter des cellules Renca avec un vecteur d'expression de la transposase (pPGK-SB11) et un codage de vecteur de transposon pour l'expression de la luciférase de luciole, ainsi qu'un gène codant pour la fusion de GFP et le gène de résistance à la zéocine , à la fois sous le contrôle transcriptionnel d'un promoteur bidirectionnel (pKT2 / Lubig) 19.
- Deux jours plus tard, plaque les cellules transfectées à une dilution limite et permettent aux cellules de se développer en complété RPMI complet avec zéocine (300 pg / ml). Confirmer l'expression de la GFP dans chaque clone par cytométrie de flux. Ces cellules sont appelées Renca-GL.
REMARQUE: le clonage de limitation de la dilution permettra aux cellules sélectionnées pour être dérivées d'une seule cellule.
- Utiliser un système de transposon à l'ingénieur cellules RENCA pour exprimer de manière stable la protéine fluorescente verte (GFP) et la luciférase de luciole.
- Pour implanter les cellules Renca intrarenally, préparer des cellules Renca into une suspension à cellule unique à 2 x 10 6 cellules / ml dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS).
- Retirer cellules RENCA adhérentes à partir du flacon de culture tissulaire en utilisant 0,25% de trypsine dans du HBSS. Après environ 5 min, ajouter du RPMI complet dans le ballon pour neutraliser la trypsine et de transférer les cellules à un tube de centrifugation pour le lavage. Centrifuger les cellules à 300 g de la force centrifuge relative (RCF xg) pendant 5 min à 25 ° C.
- Décanter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans HBSS. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et ajuster le volume avec du HBSS pour obtenir 2 x 10 6 cellules / mL.
- Dessiner les cellules dans une seringue de 1 ml munie d'une aiguille de calibre 18 pour empêcher la contrainte de cisaillement sur les cellules. Remplacer l'aiguille de calibre 18 avec une aiguille de calibre 28 avant l'injection des cellules tumorales. Une injection de 0,1 ml délivre 2 x 10 5 cellules dans le rein.
2. Zone chirurgicale Préparation
- Préparer une chirurgie stérilezone dans une enceinte de sécurité biologique en plaçant un drap chirurgical stérile sur un coussin chauffant. Rassembler toutes les fournitures, y compris des pinces, scalpel, ciseaux, gouttes pour les yeux, 5% gaze povidone-iode antiseptique et stérile. Tous les instruments autoclaver avant utilisation.
- Effectuer l'opération en utilisant une technique de pointe aseptique. instruments RESTÉRILISER entre les animaux avec un stérilisateur à billes. Porter des gants stériles, une blouse de laboratoire, et un masque facial.
3. Préparation des animaux
- Anesthésier les souris avec de la kétamine / xylazine (87,5 mg / kg et 12,5 mg / kg, respectivement, ip) selon les directives institutionnelles. Déterminer la profondeur d'anesthésie en effectuant un orteil-pincement.
- Lorsque l'animal est considéré comme non réactif, préparer le site d'injection (par exemple, le flanc gauche) sur des souris Balb / c en pinçant (avec les doigts) ou le rasage ( l' aide de tondeuses) de la fourrure.
- Déplacez les souris de la zone de préparation de la chirurgie (par exemple, la cage du logement) à la zone chirurgicale et appliquer une pommade vétérinaire à lales yeux pour prévenir la sécheresse. écouvillon libéralement le site d'incision préparé avec 5% de povidone-iode antiseptique.
- Injecter chlorhydrate de bupivacaïne (0,1 mL d'une solution à 2,5 mg / mL, sc) dans la zone où l'incision est faite comme une analgésie pré-opératoire.
- Faire une seule incision (~ 1,0 - 1,5 cm) sur le flanc gauche de l'animal à l'aide d'un scalpel stérile ou des ciseaux, avec précaution afin de ne pas pénétrer dans le péritoine. Séparer le derme du péritoine avec des ciseaux stériles. Tamponnez le site d'incision avec de la gaze de coton stérile pour éliminer toute trace de sang.
- Maintenez la souris avec les deux mains, en utilisant la main gauche pour tenir la tête et la main droite pour soutenir le flanc.
- Identifier la rate à travers le péritoine et, avec un doigt de la main droite, palper la souris par le dessous; le rein doit maintenant être visible à travers le péritoine. Gardez une prise ferme de l'animal pour fournir une tension à travers le péritoine et les reins.
- Demandez à une deuxième personne injecter la tumeur célls (préparé dans la section 1.2.) à travers le péritoine intact dans le centre du rein en utilisant une seringue de 1 ml munie d'une aiguille de calibre 28. Lentement délivrer 0,1 mL (2 x 10 5) de cellules. Une fois que les cellules sont injectées, maintenir l'aiguille en place pendant 5 - 10 s pour réduire le reflux de cellules. Il est important de noter la nécessité d'une extrême prudence lors de cette étape, la personne va injecter les cellules qui porte l'aiguille à proximité immédiate des doigts de la personne qui tient la souris.
- Retirer l'aiguille et fermer l'incision avec une fine couche de colle tissulaire à base de cyanoacrylate.
- Remettre l'animal dans une cage propre avec une serviette en papier stérile. Permettre aux animaux de récupérer sur un coussin chauffant. Ne pas laisser sans surveillance les animaux pendant la période de récupération. Ne pas retourner les animaux à des conditions de logement standards jusqu'à ce qu'ils soient en position verticale et sternal. Suivez les directives institutionnelles dans toutes les procédures utilisant des animaux de laboratoire.
4. BioImagerie luminescent
- Surveiller la croissance des tumeurs par imagerie bioluminescente.
REMARQUE: Les procédures détaillées pour effectuer une imagerie bioluminescente peuvent être obtenues à partir de Lim et al. 20 Le signal de la luciférase peut être détectée dès l' âge de 24 h après l' implantation des cellules tumorales. Comme il n'y a pas de tumeur visible à l'extérieur dans ce modèle, il est essentiel de surveiller la croissance de la tumeur périodiquement. Selon l'expérience conçue, la croissance de la tumeur orthotopique peut procéder pour des durées variables. L'un des avantages de l'utilisation des cellules RENCA exprimant la luciférase est que la croissance de la tumeur peut être contrôlée de façon répétée dans le même animal à intervalles réguliers pendant toute la durée de l'expérience, et un interrogatoire spécifique portant la tumeur et les organes sans tumeur peut être fait à un point final défini.- Injecter luciférine (0,1 ml d'une solution à 15 mg / mL dans du PBS stérile) ip et lui permettre de circuler pendant 10 minutes avant de placer la souris dans le système d'imagerie par bioluminescence. Placez le mo utiliser avec sa place du côté dorsal, roulé légèrement sur le côté, afin d'avoir la face rein injecté vers le haut.
- Mesurer la charge tumorale chez les photons de lumière émis par seconde (flux de photons) dans une région définie d'intérêt (ROI) en utilisant un logiciel d'analyse d'image.
- Quantification de la charge de la tumeur dans les organes individuels.
REMARQUE: Quantification peut être effectué à des moments définis dans les organes individuels après leur retrait de souris euthanasiées.- Injecter les souris avec la luciférine, comme à l'étape 4.1.
- Après 10 min, euthanasie les souris en utilisant une procédure approuvée.
- Disséquer les organes d'intérêt (par exemple, les reins et les poumons, voir la section 5 ci - dessous). Transférer le tissu à des boîtes de Petri de 35 x 10 mm et les placer dans le système d'imagerie par bioluminescence.
- Mesurer la charge tumorale chez les photons de lumière émis par seconde (flux de photons) dans un ROI définies en utilisant le logiciel d'analyse d'image.
- A un point d' extrémité défini pour l'expérience individuelle, l' euthanasie des souris porteuses de tumeur selon les directives institutionnelles préférées (par exemple, le CO 2, la dislocation cervicale, une surdose d'anesthésie). Cependant, éviter la dislocation cervicale si les poumons doivent être collectés après l'inflation de l'encre de Chine.
- Procéder à une évaluation grossière de la croissance tumorale primaire rénale dans le rein injecté par la mesure du poids des organes par voie humide.
- Pour déterminer la masse de la tumeur (en g), isoler 21 et peser le rein portant la tumeur et le rein controlatéral de la même souris, où la différence de poids des reins définit la masse tumorale. disséquer soigneusement toute tissu conjonctif étranger par les reins excisés avant de mesurer leur poids.
- Évaluer le degré de métastases tumorales dans les poumons en gonflant les poumons à l'encre de Chine avant l'excision et la fixation immédiatement les poumons dans une solution de Feketelass = "xref"> 22. Calcul manuel des lésions métastatiques sur la surface pulmonaire peut alors être effectuée.
- Faire une incision médiane avec des ciseaux à partir de la mi-ventre, à travers la cage thoracique, et à travers les glandes du cou / salivaire. Retirez délicatement la cage thoracique à l'aide des ciseaux et des pinces, sans compromettre le tissu pulmonaire.
- La trachée Exposer en retirant le tissu conjonctif.
- Préparer une seringue de 3 ml avec une aiguille de calibre 18 rempli de solution à 10% de l'encre de Chine dans HBSS.
- En utilisant une pince, fil soigneusement une suture de soie sous la trachée. Il sera utilisé pour attacher la trachée une fois gonflé.
- Insérer avec précaution l'aiguille vers le bas de la trachée et abaisser lentement la seringue pour gonfler les poumons avec la solution d'encre de Chine. Environ 1 - 1,5 ml de solution d'encre l'Inde gonfler complètement les poumons.
- Pincer la trachée fermée en attachant plusieurs noeuds, avec le fil de suture en dessous de l'aiguille pour empêcher le reflux de l'encre.
- Remove l'aiguille et soigneusement couper le tissu conjonctif pour enlever les poumons gonflés.
- Dans une hotte chimique, placer les poumons dans un tube conique de 15 ml contenant 5 ml de la solution de Fekete (35 ml de EtOH à 95%, 15 ml de dH 2 O, 5 ml de formaldehyde et 2,5 ml d'acide acide glacial dans une bouteille en verre de 100 mL) 23.
- Laisser les poumons pour fixer / Destain pendant 24 - 48 h à température ambiante avant le comptage manuel des nodules de tumeur décoloré.
- Retirez les poumons intacts après détachage et décortiquer soigneusement les poumons fixés par lobe dans une boîte de Pétri 35 x 10 mm. Compter le nombre de nodules tumoraux (nodules blancs) sur chaque lobe sous un microscope à dissection.
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Representative Results
L'implantation réussie de cellules RENCA se traduira par le développement de la tumeur dans le rein et les métastases aux poumons des souris. Après l'excision du porteur d' une tumeur et les reins controlatéraux, des poids de tissu humide (g) ont été mesurés afin de démontrer la charge tumorale par rapport au poids accru (figure 1). Les tumeurs RENCA peuvent être identifiés par immunohistochimie par cytokératine 8 et 18 coloration (Figure 2). Pour les études longitudinales, une lignée cellulaire Renca exprimant la luciférase a été implanté. L' imagerie bioluminescente a été effectuée en utilisant pour suivre la charge tumorale et la réponse au traitement au cours du temps d' un système d'imagerie in vivo (IVIS) (Figure 3A). Métastases les poumons a été confirmée par imagerie bioluminescente (figure 3B) et de l' Inde inflation des poumons d'encre (figure 3C).
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Figure 1. implantation orthotopique de cellules tumorales Renca forme une grande masse rénale. Cellules RENCA-GL (2 x 10 5 à 0,1 ml) ont été injectés intrarenally, et les poids des en grammes (+ SEM) portant une tumeur des reins et les reins controlatéraux sans tumeur excisées ont été déterminés au jour 24. n = 15 une tumeur reins libres et porteur d'une tumeur. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. immunofluorescente l'image microscopique de controlatérales sans tumeur et les reins porteurs de tumeurs. Cellules RENCA-GL (2 x 10 5 à 0,1 ml) ont été injectés intrarenally, les reins et porteur d' une tumeur et sans tumorales ont été récoltées le jour 12. Les reins ont été encliquetage congelé et traité pour immunofImagerie luorescence de visualiser l'emplacement du collagène, de cytokératine 8 et 18, et CD31. 10x images ont été prises et cousus ensemble pour voir la totalité du rein porteur d'une tumeur. Les barres d'échelle = 1 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. implantation orthotopique de cellules tumorales Renca conduit à des métastases pulmonaires spontanées. A. cellules RENCA-GL (2 x 10 5 à 0,1 ml) ont été injectées dans des souris intrarenally Balb / c. images bioluminescentes ont été prises aux jours indiqués. B. Le jour 23, les poumons de souris porteuses de tumeur sans tumeur et ont été excisés et des images bioluminescentes ont été prises. C. ensembles parallèles de souris le jour 23 avaient leurs poumons gonflés à l' encre de Chine pour visualiser des nodules de tumeur du poumon.Les barres d'échelle = 1 cm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Nous présentons un protocole pour un modèle de souris RCC orthotopique. L'implantation de cellules tumorales d'adénocarcinome rénal de souris dans le rein de souris constitue un modèle clinique pertinente de CRm. Ce modèle se traduit par une tumeur primaire dans le rein et métastases distantes dans les poumons, qui sont tous deux caractéristiques de RCC avancé. La description présentée ici est spécifique pour la lignée de cellules immunocompétentes Renca dans des souris Balb / c. En utilisant ce modèle orthotopique, nous avons montré que les tumeurs Renca sont sensibles à l' immunothérapie, ce qui démontre l'utilité de ce modèle pour les essais thérapeutiques 17, 24, 25, 26, 27. La possibilité d'utiliser une lignée de cellules tumorales syngéniques pour l'implantation présente l'avantage d'étudier la progression de la tumeur chez un animal immunologiquement intacte. Le syngéniques, orthotopique et carac cliniquement pertinentsristiques de ce système fournissent un modèle supérieur qui permet de tester des thérapies dans un modèle pré-clinique pertinente. Cela ne peut pas être reproduit lorsque les tumeurs sont implantées sous-cutanée. Il est important de mentionner qu'un tel système de modélisation ne se limite pas à l'évaluation des réponses immunitaires anti-tumorales ou différentes approches immunothérapeutiques pour le traitement de RCC. Il serait possible d'utiliser des cellules de tumeurs humaines implantées intrarenally dans des souris immunodéficientes, en fonction du type d'expérimentation en cours. La disponibilité des lignées de cellules RCC établies qui peuvent être cultivées in vitro améliore la reproductibilité de ce modèle orthotopique in vivo, comme tous les animaux peuvent être implantés avec un nombre égal de cellules de tumeur en même temps. De plus, les cellules tumorales peuvent être manipulées in vitro avant l'implantation intrarénal offrant la possibilité de contrôler la façon dont les cellules se développent et / ou répondre aux signaux environnementaux. Une limitation avec ce (et plus) IMPLANTable des modèles de tumeur est qu'ils contournent les premiers événements responsables de la formation de la tumeur, un avantage qui est assurée en utilisant un modèle de souris transgénique pour la formation de tumeurs autochtones.
Un inconvénient du modèle orthotopique est l'incapacité générale à visualiser la croissance tumorale, une fonctionnalité qui est facilement contrôlée pour une tumeur sous-cutanée par la mesure de l'étrier. La technologie actuelle en utilisant des cellules tumorales génétiquement modifiées et de l'imagerie bioluminescente permet des mesures longitudinales de tumeurs internes. Nous avons démontré la capacité de déterminer la tumeur rénale primaire et métastatique charge à différents points dans le temps basé sur l' imagerie bioluminescente et / ou l' extraction d'organes 17, 24, 25. Une force de notre modèle est la disponibilité de la GFP et la luciférase exprimant la lignée cellulaire Renca, mais le modèle ne nécessite pas cette fonctionnalité pour le succès. Nous avons caractérisé le oumodèle RCC thotopic avec les deux parents et Renca cellules RENCA-GL. Après l'implantation de cellules RENCA-GL, les tumeurs primaires peuvent être facilement mesurés par imagerie bioluminescente. Il peut être difficile de surveiller les métastases chez l'animal entier, cependant, que la tumeur primaire peut produire un signal qui submerge les signaux inférieurs qui pourraient être émis à partir du site métastatique. Exciser et l'imagerie des différents organes de l'animal entier permet la visualisation et la quantification des métastases dans ces organes. Dans le modèle orthotopique Renca, les tumeurs rénales primaires donnent lieu à des micro-métastases spontanées dans les poumons des animaux plus tôt que 7 jours après l'implantation, comme on le voit par luminescence dans le tissu pulmonaire excisée 17.
Bien que l'utilisation d'une lignée cellulaire tumorale exprimant la luciférase dans ce système permet à l'utilisateur la possibilité de suivre la progression de la tumeur longitudinalement dans le même animal, il fournit également à l'utilisateur la possibilité de évaluate la précision de la technique d'implantation. Le rein de la souris est une petite structure anatomique, ce qui rend possible, en particulier lors de l'utilisation d'une longue aiguille, pour injecter les cellules tumorales à travers le rein et directement dans le péritoine. L'imagerie de la souris à l'intérieur de l'injection de plusieurs jours détermine la mesure dans laquelle l'implantation des cellules tumorales est localisée dans le rein. Une autre caractéristique qui peut compliquer l'injection intra-rénale est la présence d'une abondance de graisse viscérale, qui peut accumuler les âges des animaux. Le rein est facilement visible à travers le péritoine dans une souris maigre, mais le rein peut devenir obscurci sous lobes de la graisse viscérale qui peuvent se développer au fil du temps.
A la fin d'une expérience donnée, un certain nombre d'évaluations peuvent être utilisées pour déterminer la charge de la tumeur du corps entier. imagerie bioluminescente des organes excisées fournit une mesure objective de la charge tumorale. Le poids humide des tumeurs primaires étalonnée par rapport à la kidne controlatéraly comme témoin interne fournit une mesure de la masse en vrac. La charge métastatique dans les poumons peut également être déterminée en gonflant les poumons avec l' encre de Chine en bloc pour permettre la visualisation des nodules de tumeur du poumon blanc à l' aide d' un microscope à dissection. Ces peuvent établir la charge des lectures de la tumeur totale du corps, qui peut être utilisé comme base de référence pour étudier l'efficacité thérapeutique au stade pré-clinique de développement de médicaments. L'expression de la GFP par les cellules RENCA-GL se prête également à l'écoulement cytométrique analyse des tissus porteurs de tumeurs. Cependant, il faut être prudent pour toute évaluation de la cytométrie de flux du rein porteur d'une tumeur, en particulier où l'on étudie la composition et de l'ampleur d'une réponse immunologique générée à la suite du traitement. Sont des organes très Reins vasculaires, ce qui rend probable que l'évaluation de la réponse immunitaire (soit pro-tumorale ou anti-tumorale) dans les reins entiers porteurs d'une tumeur comprendra à la fois « et vasculature-tissulaire localisentd » des cellules immunitaires au moment de la récolte d'organes. Pour distinguer les tissus contre le sang des cellules immunitaires, on utilise une technique où l'anticorps monoclonal anti-CD45.2 marqué par un fluorochrome (mAb) est injectée iv avant l'euthanasie. Les reins sont ensuite préparées pour l'écoulement cytométrie, qui comprend ex vivo avec une coloration différente mAb anti-CD45.2 marqué par un fluorochrome 28, 29. coloration double CD45.2 discrimine les cellules dans le système vasculaire du tissu au moment de la récolte. Ce protocole simple permet l'identification d' une grande leucocytaire lignées contenues dans le système vasculaire qui pourraient autrement confondre l'interprétation des réponses immunitaires adaptatives et innées dans les tissus. Ce protocole élimine également la nécessité d' une perfusion, ce qui peut avoir des conséquences non intentionnelles 28, 29.
Il y a actuellement une appréciation accrue et l'utilisation de l'immunothérapiepour traiter le cancer. Le développement de futurs traitements à base immunologiquement de MRCC (et d'autres cancers) commence dans le laboratoire en utilisant un modèle clinically- et physiologiquement pertinents. Le modèle orthotopique RCC décrit ici contient un certain nombre de caractéristiques clés (par exemple, une tumeur rénale primaire, des métastases à distance, la suppression immunitaire induite par une tumeur, et des composants pour le suivi longitudinal de la croissance tumorale) pour tester l'efficacité d'une variété de modalités thérapeutiques. Il est également tentant de spéculer que ce modèle pourrait être adapté à l'avenir pour évaluer les progrès dans d'autres moyens de traitement RCC, tels que les protocoles de thérapie chirurgicale et / ou centres de coordination.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de l'Institut national du cancer (R15CA173657 à AW et R01CA109446 à TSG), l'Institut du cancer Simmons (AW) et l'Université de Minnestoa 4 Fondation Climb du cancer du rein (TSG). Nous tenons à remercier le Dr Kristin Anderson pour l'aide à l'immunofluorescence.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial tears ophthalmic ointment | Akorn | NDC 17478-162-35 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | CBGBIW011019 | |
| Betadine Solution (Povidone-iodine, 5%) | Purdue Products, L.P. | NDC 67618-155-32 | |
| 0.25% Marcaine (bupivavaine HCl injection) | Hospira | 0409-1587-50 | |
| Heating pad | Sunbeam | ||
| Syringes | BD | 309659 | |
| Gauze | Venture | 908291 | |
| Ketamine | Phoenix Pharmaceuticals | NDC 57319-609-02 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-111 | |
| Hank’s Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| IVIS | Caliper | ||
| D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | |
| India Ink | Chartpak Inc | 44201 | |
| Scissors | |||
| Forceps | |||
| Sleeping Beauty (SB) transposon system | Neuromics | SBT0200 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 |
References
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