Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En syngene mus modell av metastatisk nyrecellekarsinom for Kvantitativ og Langsgående vurdering av Prekliniske terapier

Published: April 12, 2017 doi: 10.3791/55080
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 4,5, 1,2,3
1Department of Urology, University of Minnesota, 2Masonic Cancer Center, University of Minnesota, 3Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, University of Minnesota, 4Department of Medical Microbiology, Immunology and Cell Biology, Southern Illinois University School of Medicine, 5Simmons Cancer Institute
* These authors contributed equally

Summary

Gjennomføring av en ortotopisk modell av nyrecellekarsinom i immunokompetente mus gir utprøver en klinisk relevant system definert ved nærværet av en primær nyretumor og lungemetastaser i det samme dyr. Dette systemet kan brukes til å teste preklinisk en rekke behandlinger in vivo.

Abstract

Nyrecellekarsinom (RCC) påvirker> 60.000 mennesker i USA hvert år, og ~ 30% av RCC pasienter har flere metastaser på diagnosetidspunktet. Metastatisk RCC (mRCC) er uhelbredelig, med en median overlevelsestid på kun 18 måneder. Immun-basert behandling (f.eks, interferon (IFN) og interleukin (IL) -2) induserer vedvarende responser i en brøkdel av mRCC pasienter, og multikinasehemmer inhibitorer (f.eks sunitinib eller sorafenib) eller anti-VEGF-reseptor, monoklonale antistoffer (mAb) er i stor grad palliativ, som komplette remisjoner er sjeldne. Slike mangler ved eksisterende terapier for mRCC pasienter gi begrunnelsen for utviklingen av nye behandlingsprotokoller. En nøkkelkomponent i den prekliniske testing av nye terapier for mRCC er en egnet dyremodell. Fordelaktige trekk at rekapitulere den menneskelige tilstand inkluderer en primær nyretumor, nyretumormetastaser, og et intakt immunsystem for å undersøke enhver terapi-drevet immun Effector reaksjoner og dannelsen av tumor-indusert immunsuppressive faktorer. Denne rapporten beskriver en orthotopic mRCC mus modell som har alle disse funksjonene. Vi beskriver en intrarenal implantering teknikk ved å bruke musen renal adenocarcinoma cellelinje Renca, etterfulgt av vurdering av tumorvekst i nyrene (primær-området), og lungene (metastatisk site).

Introduction

Nyrecellekarsinom (RCC) står for majoriteten av ondartede nyre svulster og omtrent 3% av alle voksne maligniteter verdensomspennende 1, 2. På grunn av mangel av symptomer, feildiagnoser og utilstrekkelig screening verktøy for RCC, vil nesten 30% av pasienter med metastatisk RCC frem (mRCC) på diagnosetidspunktet, med en ytterligere 20-30% av pasientene utvikler seg til en metastatisk trinn 2. Disse tilfellene føre til ~ 13.500 dødsfall årlig en, 3. Selv om tidligere oppdagelse og behandling av primær RCC har blitt bedre, frekvensen av RCC-dødsfall fortsetter å øke, noe som tyder på at metastatisk sykdom er i stor grad ansvarlig for dødelighet tre. Terapi utvikling for RCC har kommet i løpet av det siste tiåret med oppdagelsen og gjennomføring av målrettet terapi og immunterapi. Dessverre, progresjonsfri survival og total overlevelse av fremskredne tilfeller fremdeles er godt under 2 år for de fleste pasientene 4, 5, 6. Denne statistikken tilsier behov for videre forskning på identifisering og utvikling av effektive behandlinger for RCC. For å fremme adekvat terapeutisk intervensjon for mRCC, er translatorisk-relevante prekliniske modeller av sykdommen først nødvendig.

Utvikling av en relevant og konsistent modell for å rekapitulere den menneskelige tilstand av avansert RCC bør ta flere viktige spørsmål: 1) Er modellen anatomisk relevant; 2) gjør svulsten fremskritt på samme måte som den menneskelige patologi; 3) Gjør metastaser oppstår fra den primære svulsten; og 4) kan primær og metastatisk tumorprogresjon overvåkes over tid? Avhengig av hvilken type behandling som skal undersøkes, mus RCC tumorcellelinjer, humane RCC-tumorcellelinjer og humane RCC pasient-avledet xenogflåter kan anvendes i immunundertrykte eller immunmang mus. En vert med en intakt og funksjonelt immunsystem er nødvendig for de studier som evaluerte noen aspekter av immunterapi, nødvendiggjør bruk av den vel beskrevne Renca cellelinje avledet fra en spontan renal adenocarcinoma fra Balb / c-mus 7. De fleste studier injisere Renca celler subkutant (SC), som danner en lett-å-måle lokal tumor eller intravenøst (iv) i Balb / c-mus for å fremstille eksperimentell lungemetastaser "" 8, 9, 10, 11, 12. Anvendelse av en sc-implantert Renca tumor for å modellere human RCC har en rekke begrensninger, blant annet unøyaktig innervasjon av vaskulatur 13, forskjeller i mikromiljøet 14, 15, og en manglende organ / tumor cellulær kommunikasjon;asjon 13, 16. I tillegg er det mange sc-tumorer (spesielt Renca) ikke metastasere til fjerntliggende organer, inhibering studiet av en hendelse som er et vanlig klinisk karakteristisk 17. For å studere mRCC kan Renca celler injiseres iv å etablere tumorbelastning i lungene-den primære lokaliseringen av metastaser i RCC-pasienter. Den iv injeksjon metode for initiering av metastatiske tumorer, men ikke tillater undersøkelse av hvordan, når, eller hvorfor cellene har migrert fra den primære organ (dvs. nyren) til den fjerntliggende sted. En modell med både primær og metastatisk sykdom tydelig i det samme dyr er avgjørende for å studere utviklingen og behandling av fremskreden sykdom, spesielt med tanke på at metastaser er vanligvis årsak til dødelighet i disse pasientene.

Vårt laboratorium har utviklet en musemodell for mRCC som inkorporerer alle de funksjonene som er skissert ovenfor. Å etablere primary, ortotopiske tumorer, blir Renca celler implantert rett inn i nyrene av dyret gjennom den gjennomskinnelige peritoneum. Et lite snitt i den venstre flanke tillater visualisering av milt (som et fjell), og den venstre nyre. Ved hjelp av en liten nål, blir Renca tumorceller injisert direkte inn i nyrene inn i peritoneum til ortotopisk implantasjon. Sammenlignet med andre fremgangsmåter for implantering av Renca celler under nyrekapselen 18, denne metoden for implantasjon tillater en større gjennomstrømning, slik det er ganske ikke-invasiv, krever ikke suturering, er av en lav smerte klasse, og er tidsbesparende når praktiseres.

Dette velkarakteriserte modell gir reproduserbare primær tumorbyrden (~ 99% foretar rate) i den injiserte nyrene, så vel som metastatisk tumorbelastning i lungene. De viktigste fordelene med denne modellen inkluderer dens syngen natur, noe som åpner for immunterapi undersøkelser; sine spontane metastaser, for å studere ene avansert sykdom; og dens ortotopisk implantasjon, for å modellere den anatomiske innvirkning på sykdomsprogresjon og behandling. Behandlinger som tar sikte på å målrette RCC vil ha stor nytte av utnyttelse av denne modellen under preklinisk utvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Følgende protokoll beskrives en eksperimentell prosedyre for å indusere og overvåke veksten av eksperimentelle ortotopiske renale tumorer og eventuelle spontane metastaser. Alle de følgende prosedyrene er gjort i henhold til institusjonelle retningslinjer og godkjente prosedyrer vedrørende human bruk av forsøksdyr.

1. Vedlikehold av cellelinjer

  1. Oppretthold murine renal adenocarcinoma cellelinje, Renca, i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS), 1% penicillin-streptomycin, og 1 mM hver av ikke-essensielle aminosyrer, L-glutamin og natriumpyruvat (referert til som fullstendig RPMI). Kulturcellene i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
    MERK: Som med en hvilken som helst etablert cellelinje, er det anbefalt å bruke lav passasje-nummer Renca celler for transfeksjon og påfølgende implantasjon for å minimere eventuelle fenotypiske eller genetiske endringer som kan oppstå etter langvarig kulture.
    1. Bruke et transposon system for å konstruere Renca celler til å stabilt uttrykke grønt fluorescerende protein (GFP) og ildflueluciferase.
      1. Ved hjelp av et kationisk liposom-baserte transfeksjon reagens, ko-transfektere Renca celler med en transposase ekspresjonsvektor (pPGK-SB11) og et transposon vektor som koder for ekspresjon av ildflueluciferase, så vel som et fusjons gen som koder for GFP og zeocin resistensgenet , både under transkripsjonen kontroll av en toveis-promoter (pKT2 / LuBiG) 19.
      2. To dager senere porsjon de transfekterte celler ved en begrenset fortynning og tillate cellene å vokse i fullstendig RPMI supplert med zeocin (300 ug / ml). Bekrefte GFP-ekspresjon i hver klon ved flow-cytometri. Disse cellene er betegnet Renca-GL.
        MERK: Begrensning-fortynningskloning vil tillate de valgte cellene for å være avledet fra en enkelt celle.
  2. For å implantere Renca celler intrarenally, forberede Renca celler into en enkeltcellesuspensjon ved 2 x 10 6 celler / ml i Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS).
    1. Fjerne adherente Renca celler fra vevkultur flaske ved bruk av 0,25% trypsin i HBSS. Etter ~ 5 minutter, tilsett fullstendig RPMI til kolben for å nøytralisere trypsin og overføre cellene til et sentrifugerør for vask. Sentrifuger cellene ved 300 relativ sentrifugalkraft g kraft (RCF xg) i 5 minutter ved 25 ° C.
    2. Dekanter supernatanten og resuspender cellene i HBSS. Tell cellene ved bruk av et hemocytometer og justere volumet med HBSS for å gi 2 x 10 6 celler / ml.
    3. Tegn cellene i en 1 ml sprøyte utstyrt med en 18 gauge nål for å forhindre skjærbelastning på cellene. Sett på 18-gauge nål med en 28-gauge nål før injeksjon av tumorcellene. En injeksjon av 0,1 ml leverer 2 x 10 5 celler inn i nyrene.

2. Kirurgisk området Forberedelse

  1. Fremstill en steril kirurgiskOmrådet i en biosikkerhet kabinett ved å anbringe en steril operasjonsduk i løpet av en varmepute. Samle alle forsyninger, inkludert tang, skalpell, saks, øyedråper, 5% povidon-jod antiseptisk, og steril kompress. Autoklav alle instrumenter før bruk.
  2. Utføre operasjonen ved hjelp av en aseptisk tips teknikk. Steriliseres instrumenter mellom dyr med en vulst sterilisator. Bruk sterile hansker, laboratoriefrakk og munnbind.

3. Klargjøring av dyr

  1. Bedøve mus med ketamin / xylazin (87,5 mg / kg og 12,5 mg / kg, ip) i henhold til institusjonens retningslinjer. Bestemme bedøvelse dybde ved å utføre en tå-klemme.
  2. Når dyret er ansett som ikke-responsive, forberede injeksjonsstedet (for eksempel, til venstre flanke) på Balb / c-mus ved plukking (med fingrene) eller barber (ved bruk av klippemaskiner) pelsen.
  3. Flytt mus fra operasjonen prep området (f.eks huset bur) til det kirurgiske område og gjelder veterinær salve til denøynene for å hindre tørrhet. Rikelig vattpinne fremstilte snittstedet med 5% povidon-jod antiseptisk.
  4. Injiser bupivakainhydroklorid (0,1 ml av en 2,5 mg / ml oppløsning, sc) inn i området hvor snittet skal gjøres som en pre-operativ analgesi.
  5. Foreta en enkelt innsnitt (~ 1,0 - 1,5 cm) på den venstre flanke av dyret ved hjelp av en steril skalpell eller saks, forsiktig for ikke å trenge inn i peritoneum. Separer dermis fra peritoneum med steril saks. DAB innsnitt området med steril bomull gasbind for å fjerne blod.
  6. Hold musen med begge hender, bruke venstre hånd å holde hodet og høyre hånd til å støtte flanke.
  7. Identifisere milten gjennom peritoneum, og med en finger på høyre hånd, palpate musen fra undersiden; nyren skal nå være synlig gjennom bukhinnen. Hold et fast grep på dyret for å gi spenning over bukhinnen og nyre.
  8. Har en annen person injisere tumoren cells (fremstilt i avsnitt 1.2.) gjennom intakt peritoneum inn i sentrum av nyrene ved hjelp av en 1-ml sprøyte utstyrt med en 28-gauge nål. Sakte levere 0,1 ml (2 x 10 5) av celler. Når cellene blir injisert, holde nålen på plass i 5 - 10 s for å redusere tilbakestrømning av cellene. Det er viktig å være oppmerksom på behovet for ekstrem forsiktighet under dette trinn, da den person injisere cellene vil bringe nålen til tett nærhet til fingrene til personen holde musen.
  9. Fjern nålen og lukke såret med et tynt lag av cyanoakrylat-adhesiv vev.
  10. Plasser dyret tilbake til et rent bur med en steril papirhåndkle. At dyrene for å gjenvinne på en varmepute. Ikke la dyrene uten tilsyn under utvinning perioden. Ikke returnere dyr til standard boforhold før de er oppreist og sternal. Følg institusjonelle retningslinjer i alle prosedyrer ved hjelp av forsøksdyr.

4. Biolysende Imaging

  1. Overvåk tumorvekst med selvlysende avbildning.
    MERK: Saksbehandling detaljer for å utføre bioluminescent bildebehandling kan fås fra Lim et al. 20 Luciferaseaktiviteten signal kan oppdages så tidlig som 24 timer etter tumorcelle implantasjon. Siden det ikke er eksternt synlig tumor i denne modellen, er det viktig å overvåke tumorvekst med jevne mellomrom. Avhengig av designet eksperiment, kan orthotopic tumorvekst fortsetter for kortere eller lengre tid. En fordel med å bruke luciferase-uttrykkende Renca celler er at tumorvekst gjentatte ganger kan overvåkes i det samme dyr med jevne mellomrom i løpet av forsøket, og en spesiell utspørring av tumorbærende og tumorfrie organer kan gjøres på en definert endepunkt.
    1. Injiser luciferin (0,1 ml av en 15 mg / ml oppløsning i sterilt PBS) ip og la den sirkulere i 10 minutter før plassering av musen inn i Bioluminescens avbildningssystem. Plasser mo bruk med sin dorsale side opp, rulles litt på sin side, for å få den injiserte nyre vender opp.
    2. Måle tumorbelastning i fotoner emittert lys per sekund (foton flux) innenfor et definert område av interesse (ROI) ved hjelp av programvare for bildeanalyse.
  2. Kvantifisering av tumorbyrden i enkelte organer.
    MERK: Kvantifisering kan utføres ved definerte tidspunkter i de enkelte organer etter at de er fjernet fra avlives musene.
    1. Injisere musene med luciferin, som i trinn 4.1.
    2. Etter 10 minutter ble avlive musene ved hjelp av en godkjent prosedyre.
    3. Skjær ut organer av interesse (f.eks, nyrer og lunger; se seksjon 5 nedenfor). Overfør vevet til 35 x 10 mm petriskåler og plassere dem i Bioluminescens avbildningssystem.
    4. Måle tumorbelastning i fotoner emittert lys per sekund (foton fluksen) i et definert roi ved hjelp av programvare for bildeanalyse.
e_title "> 5. Organ Harvest-

  1. Ved en definert endepunktet for den enkelte forsøk avlive tumorbærende mus ifølge foretrukne institusjonens retningslinjer (f.eks, CO 2, cervical dislokasjon, anestesi dosering). Men unngå halshugging hvis lungene skal samles etter tusj inflasjon.
  2. Utføre en grov vurdering av primære nyretumorvekst i den injiserte nyre ved måling av den våte vekt av organer.
    1. For å bestemme i tumormassen (i g), isolere 21 og veie den tumorbærende nyre og den kontralaterale nyre fra den samme mus, hvor forskjellen i nyrevekt definerer tumormassen. Nøye dissekere bort noe fremmed bindevev fra de utskårede nyrene før måling av deres vekter.
  3. Vurdere graden av tumormetastaser i lungene ved oppblåsing av lungene med tusj før fjerning og straks feste lungene hos Fekete løsninglass = "ekstern referanse"> 22. Manuell beregning av metastatiske lesjoner på lungeoverflaten kan da utføres.
    1. Lag en midtlinjen snitt med saks starter på midten av magen, gjennom brystkasse, og opp gjennom halsen / spyttkjertlene. Fjern forsiktig brystkassen ved hjelp av sakser og pinsetter, uten at det går i lungevevet.
    2. Eksponere trakea ved fjerning av bindevev.
    3. Fremstill en 3 ml sprøyte med en 18-gauge nål fylt med 10% India blekk oppløsning i HBSS.
    4. Bruk pinsett, nøye tråden en silke sutur under luftrøret. Dette vil bli brukt til å feste luftrøret en gang oppblåst.
    5. Sett forsiktig nålen ned i luftrøret og langsomt trykke ned i sprøyten for å blåse i lungene med tusj løsning. Omtrent 1 - 1,5 ml av India blekk løsningen vil blåses helt opp i lungene.
    6. Klemme i luftrøret stenges ved å binde flere knuter, med suturen under nålen for å hindre tilbakestrømning av blekk.
    7. fjernelse ave nålen og forsiktig kuttet bort bindevevet for å fjerne den oppblåste lunger.
    8. I et avtrekksskap, sett i lungene til en 15 ml konisk rør inneholdende 5 ml av Fekete oppløsning (35 ml 95% etanol, 15 ml dH 2 O, 5 ml av formaldehyd og 2,5 ml iseddiksyre i i en 100 ml glassflaske) 23.
    9. Tillat lungene for å feste / destain i 24 - 48 timer ved romtemperatur før manuell telling av avfarget tumorknuter.
    10. Fjern de intakte lungene etter avfarging og nøye dissekere de faste lungene ved lapp i et 35 x 10 mm petriskål. Tell antall tumorknuter (hvite knuter) på hver nese under et disseksjonsmikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den vellykkede implantering av Renca celler vil resultere i tumorutvikling i nyrene og metastasering til lungene hos musene. Etter fjerning av tumoren bærende og de kontralaterale nyrer, ble anvendt våte vev vekter (g) måles for å påvise tumorbelastningen på grunnlag av økt vekt (figur 1). Renca tumorer kan identifiseres ved immunhistokjemi gjennom cytokeratin 8 og 18 farging (figur 2). For longitudinelle studier, ble en luciferase-uttrykkende cellelinje Renca implantert. Bioluminescerende avbildning ble utført ved bruk av en in vivo bildesystem (IVIS) for å spore tumorbyrden og effekten av behandlingen over tid (figur 3A). Metastasering til lungene ble bekreftet ved selvlysende avbildning (figur 3B) og tusj av lungeinnblåsning (figur 3C).

s / ftp_upload / 55080 / 55080fig1.jpg"/>
Figur 1. ortotopisk implantering av Renca tumorceller danner et stort renal masse. Renca-GL-celler (2 x 10 5 i 0,1 mL) ble injisert intrarenally, og vektene til de utskårede tumorbærende nyrer og tumorfrie kontralaterale nyrer i gram (+ SEM) ble bestemt på dag 24. n = 15 tumor- frie og tumor-bærende nyrer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Immunofluorescent mikroskopisk bilde av tumorfrie kontralaterale og tumorbærende nyrer. Renca-GL-celler (2 x 10 5 i 0,1 mL) ble injisert intrarenally, og den tumorbærende og tumorfrie nyrer ble høstet på dag 12. Nyrene ble hurtigfrosset og behandlet for immunofluorescence avbildning for å visualisere plasseringen av kollagen, Cytokeratin 8 og 18, og CD31. 10x bilder ble tatt og sydd sammen for å se hele tumorbærende nyre. Skala streker = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. ortotopisk implantering av Renca tumorceller fører til spontane lungemetastaser. A. Renca-GL-celler (2 x 10 5 i 0,1 mL) ble injisert intrarenally i Balb / c-mus. Bioluminescerende bildene ble tatt på de angitte dager. B. På dag 23, lungene fra tumorfrie og tumor-bærende mus ble skåret ut og bioluminiscerende bilder ble tatt. C. parallelle sett av mus på dag 23 hadde sine lunger blåses opp med India blekk for å visualisere lungetumorknuter.Skala streker = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi presenterer en protokoll for en ortotopisk RCC musemodell. Implantasjon av musenyre adenokarsinom tumorceller inn i musenyre har en klinisk relevant modell av mRCC. Denne modellen resulterer i en primær tumor i nyre og fjernmetastaser i lungene, som begge er kjennetegnene til avansert RCC. Den beskrivelse som presenteres her er spesifikk for den Renca cellelinje hos immunkompetente Balb / c-mus. Ved hjelp av denne ortotopisk modell, har vi vist at Renca svulster er mottakelig for immunterapi, noe som viser anvendbarheten av denne modellen for terapeutisk testing 17, 24, 25, 26, 27. Muligheten til å bruke en syngen tumorcellelinje for implantering gir den fordelen av å studere tumorprogresjon i en immunologisk intakt dyr. Den syngene, orthotopic og klinisk relevant characteristics av ​​dette systemet gi en overlegen modell som gir mulighet for testing av behandlinger i et relevant preklinisk modell. Dette kan bli kopiert når tumorene ble implantert subkutant. Det er viktig å nevne at et slikt modellsystem ikke er begrenset til å evaluere anti-tumor immunresponser eller ulike immunterapeutiske fremgangsmåter for behandling av RCC. Det ville være mulig å anvende humane tumorceller implantert intrarenally inn i immunodefekte mus, avhengig av typen av forsøk som utføres. Tilgjengeligheten av etablerte RCC-cellelinjer som kan dyrkes in vitro forbedrer reproduserbarhet av denne in vivo ortotopisk modell, som alle dyr kan bli implantert med et likt antall av tumorceller på samme tid. Videre kan tumorceller bli manipulert in vitro før implantering intrarenal tilbyr muligheten til å kontrollere hvordan cellene vokser og / eller svare på miljøsignaler. En begrensning med dette (og de fleste) implantabell tumormodeller er at de omgå de tidlige hendelsene som er ansvarlige for tumordannelse, en fordel som gis ved bruk av en musemodell genetisk konstruert for dannelsen av stedegne tumorer.

En av ulempene med ortotopisk modell er den generelle manglende evne til å visualisere svulstvekst, en funksjon som kan lett overvåkes for en sc tumor ved kalibermåling. Dagens teknologi som anvender genetisk-konstruerte tumorceller og bioluminescerende avbildning gir mulighet for langsgående målinger av indre tumorer. Vi har vist evne til å bestemme primære nyretumor og metastatisk belastning ved forskjellige tidspunkter, basert på selvlysende avbildning og / eller organ ekstraksjon 17, 24, 25. En styrke vår modell er tilgjengeligheten av GFP og luciferase-uttrykke Renca cellelinje, men modellen krever ikke denne funksjonen for å lykkes. Vi har preget ellerthotopic RCC modell med både det parenterale Renca og Renca-GL-celler. Etter implantasjon av Renca-GL-celler, kan primære tumorer lett måles ved selvlysende avbildning. Det kan være vanskelig å overvåke metastaser i hele dyret, men som den primære svulsten kan produsere et signal som overvelder de nedre signaler som kan avgis fra den metastaserende området. Utspaltning og avbilde de enkelte organene fra hele dyre tillater visualisering og kvantifisering av metastaser i disse organer. I Renca ortotopisk modell, de primære nyresvulster gi opphav til spontane mikrometastaser i lungene av dyrene så tidlig som 7 dager etter implantering, slik det fremgår av luminescens i det utskårede lungevev 17.

Mens bruken av et luciferase-uttrykkende tumorcellelinje i dette systemet gir brukeren muligheten til å spore tumorprogresjon i lengderetningen i det samme dyr, det gir også brukeren med muligheten til å evaluate presisjonen av innset teknikk. Musen nyre er en liten anatomisk struktur, som gjør det mulig, spesielt ved hjelp av en lang nål, for å injisere tumorcellene gjennom nyrene og direkte inn i peritoneum. Imaging mus i løpet av flere dager etter injeksjon bestemmer i hvilken grad den implantering av tumorcellene er lokalisert til nyrene. En annen funksjon som kan komplisere intrarenal injeksjonen er tilstedeværelsen av en overflod av visceralt fett, noe som kan samle opp når dyret aldre. Nyren er lett synlig gjennom bukhinnen i en mager mus, men nyren kan bli skjult i henhold fliker av visceralt fett som kan utvikle seg over tid.

Ved avslutningen av et gitt forsøk, kan en rekke vurderinger bli anvendt for å bestemme hele kroppen tumorbyrde. Bioluminescerende avbildning av de utskårne organer gir et objektivt mål på tumorbyrde. Den våte vekt av primære tumorer normalisert til den kontralaterale kidney som en intern kontroll gir en -massen måling. Den metastatisk belastning i lungen kan også bestemmes ved oppblåsing av lungene med tusj en bloc for å tillate visualisering av hvite lungetumorknuter ved hjelp av et disseksjonsmikroskop. Disse avlesninger kan etablere total kroppstumorbyrde, som kan brukes som en basis for å undersøke den terapeutiske effektivitet ved preklinisk stadium av legemiddelutvikling. Den ekspresjon av GFP av Renca-GL-celler gir seg også til strømningscytometriske analyser av de tumorbærende vev. Imidlertid må det utvises forsiktighet for en hvilken som helst flowcytometrisk vurdering av tumorbærende nyre, særlig når man undersøker sammensetningen og størrelsen av en hvilken som helst immunologisk respons generert som en konsekvens av behandlingen. Nyrer er meget vaskulære organer, noe som gjør det sannsynlig at evalueringen av immunresponsen (enten pro-tumor eller antitumor) i hele tumorbærende nyrer vil omfatte både "vevs- og blodkar-Lokaliserd" immunceller på tidspunktet for innhøsting organ. For å skille vev sammenlignet med blodimmunceller, bruker vi en teknikk hvor fluorokrom-merket anti-CD45.2 monoklonalt antistoff (mAb) er injisert iv før eutanasi. Nyrene ble deretter preparert for strømning cytometri, som omfatter ex vivo farging med forskjellig fluorkrom-merket anti-CD45.2 mAb 28, 29. Dual CD45.2 farging diskriminerer celler i vaskulaturen fra vevet ved tidspunktet for høsting. Dette enkle protokollen muliggjør identifikasjon av større leukocytt linjene som inneholdes i det vaskulære karet som ellers kunne forvirre den tolkning av adaptive og medfødte immunresponser hos vev. Denne protokollen eliminerer også behovet for perfusjon, som kan ha uønskede konsekvenser 28, 29.

Det er i dag en økt forståelse for og bruk av immunterapifor å behandle kreft. Utviklingen av fremtidige immunologisk baserte behandlinger for mRCC (og andre kreftformer) starter i laboratoriet ved hjelp av en clinically- og fysiologisk relevant modell. Den ortotopisk RCC modellen beskrevet heri inneholder en rekke nøkkelfunksjoner (for eksempel primære nyretumor, fjernmetastaser, tumor-indusert immunsuppresjon, og komponenter for langsgående overvåking av tumorvekst) for å teste effekten av forskjellige terapeutiske modaliteter. Det er også fristende å spekulere i at denne modellen kan også tilpasses i fremtiden for å vurdere fremskritt i andre midler for behandling av RCC, slik som kirurgisk og / eller fokale terapiprotokoller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Cancer Institute (R15CA173657 til AW og R01CA109446 til TSG), Simmons Cancer Institute (til AW), og Universitetet i Minnestoa klatre 4 Kidney Cancer Foundation (til TSG). Vi takker Dr. Kristin Anderson for å få hjelp med immunfluorescens.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Artificial tears ophthalmic ointment Akorn NDC 17478-162-35
Vetbond Tissue Adhesive 3M CBGBIW011019
Betadine Solution (Povidone-iodine, 5%) Purdue Products, L.P. NDC 67618-155-32
0.25% Marcaine (bupivavaine HCl injection) Hospira 0409-1587-50 
Heating pad Sunbeam
Syringes BD 309659
Gauze Venture 908291
Ketamine Phoenix Pharmaceuticals NDC 57319-609-02
Xylazine  Akorn NDC 59399-111
Hank’s Balanced Salts Sigma-Aldrich H2387
IVIS Caliper
D-Luciferin, Potassium Salt GoldBio LUCK-1G
India Ink Chartpak Inc 44201
Scissors
Forceps
Sleeping Beauty (SB) transposon system Neuromics SBT0200
Renca ATCC CRL-2947

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 66, 7-30 (2016).
  2. Chow, W. H., Dong, L. M., Devesa, S. S. Epidemiology and risk factors for kidney cancer. Nat. Rev. Urol. 7, 245-257 (2010).
  3. Hollingsworth, J. M., Miller, D. C., Daignault, S., Hollenbeck, B. K. Rising incidence of small renal masses: a need to reassess treatment effect. J. Natl. Cancer Inst. 98, 1331-1334 (2006).
  4. Lee-Ying, R., Lester, R., Heng, D. Current management and future perspectives of metastatic renal cell carcinoma. Int. J. Urol. 21, 847-855 (2014).
  5. Rini, B. I. New strategies in kidney cancer: therapeutic advances through understanding the molecular basis of response and resistance. Clin. Cancer Res. 16, 1348-1354 (2010).
  6. Acquavella, N., Fojo, T. Renal cell carcinoma: trying but failing to improve the only curative therapy. J. Immunother. 36, 459-461 (2013).
  7. Salup, R. R., Wiltrout, R. H. Adjuvant immunotherapy of established murine renal cancer by interleukin 2-stimulated cytotoxic lymphocytes. Cancer Res. 46, 3358-3363 (1986).
  8. Ko, J. S., et al. Direct and differential suppression of myeloid-derived suppressor cell subsets by sunitinib is compartmentally constrained. Cancer Res. 70, 3526-3536 (2010).
  9. Kusmartsev, S., et al. Oxidative stress regulates expression of VEGFR1 in myeloid cells: link to tumor-induced immune suppression in renal cell carcinoma. J. Immunol. 181, 346-353 (2008).
  10. Rocha, F. G., et al. Endostatin gene therapy enhances the efficacy of IL-2 in suppressing metastatic renal cell carcinoma in mice. Cancer Immunol. Immunother. 59, 1357-1365 (2010).
  11. Shanker, A., et al. Treating metastatic solid tumors with bortezomib and a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonist antibody. J. Natl. Cancer Inst. 100, 649-662 (2008).
  12. VanOosten, R. L., Griffith, T. S. Activation of tumor-specific CD8+ T Cells after intratumoral Ad5-TRAIL/CpG oligodeoxynucleotide combination therapy. Cancer Res. 67, 11980-11990 (2007).
  13. Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation: advantages and disadvantages. Eur. J. Cancer. 40, 852-857 (2004).
  14. Devaud, C., et al. Tissues in different anatomical sites can sculpt and vary the tumor microenvironment to affect responses to therapy. Mol. Ther. 22, 18-27 (2014).
  15. Devaud, C., et al. Differential potency of regulatory T cell-mediated immunosuppression in kidney tumors compared to subcutaneous tumors. Oncoimmunology. 3, 963395 (2014).
  16. Devaud, C., et al. Cross-talk between tumors can affect responses to therapy. Oncoimmunology. 4, 975572 (2015).
  17. Norian, L. A., et al. Eradication of metastatic renal cell carcinoma after adenovirus-encoded TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)/CpG immunotherapy. PLoS One. 7, 31085 (2012).
  18. Matin, S. F., et al. Immunological response to renal cryoablation in an in vivo orthotopic renal cell carcinoma murine model. J. Urol. 183, 333-338 (2010).
  19. Wilber, A., et al. RNA as a source of transposase for Sleeping Beauty-mediated gene insertion and expression in somatic cells and tissues. Mol. Ther. 13, 625-630 (2006).
  20. Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J. Vis. Exp. , (2009).
  21. Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice. J Vis Exp. , (2013).
  22. Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse. J. Vis. Exp. , (2010).
  23. Wexler, H. Accurate identification of experimental pulmonary metastases. J. Natl. Cancer Inst. 36, 641-645 (1966).
  24. James, B. R., et al. CpG-mediated modulation of MDSC contributes to the efficacy of Ad5-TRAIL therapy against renal cell carcinoma. Cancer Immunol. Immunother. 63, 1213-1227 (2014).
  25. James, B. R., Brincks, E. L., Kucaba, T. A., Boon, L., Griffith, T. S. Effective TRAIL-based immunotherapy requires both plasmacytoid and CD8a DC. Cancer Immunol. Immunother. 63, 685-697 (2014).
  26. James, B. R., et al. Diet-induced obesity alters dendritic cell function in the presence and absence of tumor growth. J. Immunol. 189, 1311-1321 (2012).
  27. Brincks, E. L., et al. Triptolide enhances the tumoricidal activity of TRAIL against renal cell carcinoma. FEBS J. 282, 4747-4765 (2015).
  28. Anderson, K. G., et al. Cutting edge: intravascular staining redefines lung CD8 T cell responses. J. Immunol. 189, 2702-2706 (2012).
  29. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nat. Protocols. 9, 209-222 (2014).

Tags

Cancer Research utgave 122 renal celle karsinom metastase nyre ortotopisk intrarenal luciferase
En syngene mus modell av metastatisk nyrecellekarsinom for Kvantitativ og Langsgående vurdering av Prekliniske terapier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Murphy, K. A., James, B. R., Wilber, … More

Murphy, K. A., James, B. R., Wilber, A., Griffith, T. S. A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies. J. Vis. Exp. (122), e55080, doi:10.3791/55080 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter