Summary
Implementação de um modelo ortotópico de carcinoma de células renais, em ratinhos imunocompetente proporciona o investigador um sistema clinicamente relevante definida pela presença de um primárias metástases tumorais e pulmonares renais no mesmo animal. Este sistema pode ser usado para testar pré-clinicamente uma variedade de tratamentos in vivo.
Abstract
carcinoma de células renais (RCC) afeta> 60.000 pessoas nos Estados Unidos anualmente, e ~ 30% dos pacientes com CCR têm múltiplas metástases no momento do diagnóstico. Metastático RCC (mRCC) é incurável, com um tempo médio de sobrevivência de apenas 18 meses. Intervenções imunológicas baseadas em (por exemplo, o interferão (IFN) e interleucina (IL) -2) induzir respostas duradouras em uma fracção de pacientes mRCC, e inibidores multiquinase (por exemplo, sunitinib ou sorafenib) ou anti-receptor de VEGF anticorpos monoclonais (mAbs) são em grande medida paliativa, como remissões completas são raras. Tais deficiências em terapias actuais para doentes mRCC proporcionar a base racional para o desenvolvimento de novos protocolos de tratamento. Um componente chave na testes pré-clínicos de novas terapias para mRCC é um modelo animal adequado. características benéficas que recapitulam a condição humana incluem um tumor primário renal, metástases de tumores renais, e um sistema imune intacto para investigar qualquer effecto imune accionada-terapiarespostas r e a formação de factores imunossupressores induzida por tumor. Este relatório descreve um modelo de camundongo ortotópico mRCC que tem todos esses recursos. Descrevemos uma técnica de implante intra-renal utilizando o rato renal linha celular de adenocarcinoma Renca, seguindo-se a avaliação do crescimento tumoral no rim (sítio primário) e pulmões (local metastático).
Introduction
Carcinoma de células renais (RCC) é responsável pela maioria das neoplasias malignas nos rins e aproximadamente 3% de todas as malignidades adultos no mundo inteiro 1, 2. Devido à falta de sintomas, diagnóstico errado, e ferramentas de rastreio insuficientes para RCC, quase 30% dos pacientes apresentarão com RCC metastático (CCRm) no momento do diagnóstico, com um 20-30% adicional de pacientes que evoluíram para um estágio metastático 2. Estes casos resultam em ~ 13.500 mortes por ano 1, 3. Embora a detecção e tratamento de carcinoma de células renais primário anterior melhorou, a taxa de morte relacionada com o RCC continua a aumentar, o que sugere que a doença metastática é em grande parte responsáveis pela mortalidade 3. desenvolvimento terapia para RCC progrediu na última década com a descoberta e implementação de terapias direcionadas e imunoterapias. Infelizmente, surviv livre de progressãoai e sobrevivência global dos casos avançados ainda são bem menores de 2 anos para a maioria dos doentes com 4, 5, 6. Estas estatísticas justificam a necessidade de mais investigação sobre a identificação e desenvolvimento de tratamentos eficazes para RCC. Para avançar adequadamente intervenções terapêuticas para mRCC, modelos pré-clínicos traducionalmente relevantes da doença são primeiro necessário.
Desenvolvimento de um modelo relevante e consistente para recapitular a condição humana de CCR avançado deve abordar várias questões-chave: 1) é o modelo anatomicamente relevante; 2) A progresso do tumor de forma semelhante à patologia humana; 3) Fazer metástases surgir a partir do tumor primário; e 4) pode progressão do tumor primário e metastático ser monitorado ao longo do tempo? Dependendo do tipo de tratamento a ser investigados, as linhas de rato tumorais RCC celulares, linhas celulares de tumores humanos, e RCC RCC xenog humana derivada de pacientejangadas pode ser usado em ratos imunocompetentes ou imunodeficientes. Um hospedeiro com um sistema imunitário intacto e funcional é necessário para aqueles estudos que avaliaram a algum aspecto da imunoterapia, que implique a utilização da linha de células Renca bem descrito derivada de um adenocarcinoma renal espontâneo de ratinhos Balb / c 7. A maioria dos estudos de injectar células Renca por via subcutânea (SC), que forma um local do tumor fácil de medida, ou por via intravenosa (iv) em ratos Balb / c para produzir experimentais pulmonares "metástases" 8, 9, 10, 11, 12. Uso de um tumor Renca implantou-sc para modelar RCC humana tem um número de limitações, incluindo inervação impreciso da vasculatura 13, as diferenças em microambiente 14, 15, e uma falta de órgão / tumor Communic celularção 13, 16. Além disso, muitos tumores sc (especialmente Renca) não metastizar para órgãos distantes, inibindo o estudo de um evento que é uma característica comum clínico 17. Para estudar mRCC, culas RENCA pode ser injectado iv para estabelecer a carga de tumor nos pulmões-o local principal de metástases em doentes RCC. O método de injecção iv de iniciar tumores metastáticos, no entanto, não permite a investigação de como, quando, ou porque as células migraram do órgão primário (isto é, o rim) para o local distante. Um modelo com ambas as doenças primário e metastático evidente no mesmo animal é crucial para estudar a progressão e tratamento de doença avançada, especialmente considerando que as metástases são tipicamente a causa de mortalidade nesses pacientes.
Nosso laboratório desenvolveu um modelo murino de mRCC que incorpora todas as características acima descritas. Para estabelecer prtumores imary, ortotópicos, células Renca são implantadas directamente no rim do animal através do peritoneu translúcido. Uma pequena incisão no flanco esquerdo permite a visualização do baço (como uma referência) e o rim esquerdo. Utilizando uma agulha de calibre pequeno, as células de tumor Renca são injectados directamente no rim através do peritoneu para implante ortotópico. Em comparação com outros métodos de implantação de células Renca abaixo da cápsula renal 18, este método de implantação permite um caudal mais elevado, uma vez que é relativamente não invasivo, não requer sutura, é de uma classe de dor, e é eficiente tempo quando praticada.
A bem caracterizados os resultados do modelo de carga primário reprodutível tumoral (~ 99% taxa de absorção) no rim injectado, bem como carga de tumor metastático nos pulmões. As vantagens significativas deste modelo incluem a sua natureza singeneicos, permitindo para as investigações de imunoterapia; as suas metástases espontâneas, para estudar umdoença dvanced; e a sua implantação ortotópica, para modelar o impacto anatómica na progressão da doença e do tratamento. Terapias destinadas a alvejando RCC beneficiariam muito a utilização deste modelo durante o desenvolvimento pré-clínico.
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Protocol
O protocolo seguinte descreve um procedimento experimental para a indução e monitorização do crescimento de tumores ortoticos renais experimentais e quaisquer potenciais metástases espontâneas. Todos os seguintes procedimentos são feitos de acordo com as políticas institucionais e procedimentos aprovados em relação ao uso humano dos animais experimentais.
1. A manutenção de linhas celulares
- Manter a linha celular de adenocarcinoma renal murino, Renca, no Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS), 1% de penicilina-estreptomicina, e 1 mM de cada um dos não-aminoácidos essenciais, L-glutamina , e piruvato de sódio (designado por RPMI completo). Células de cultura numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2.
NOTA: Como com qualquer linha celular estabelecida, é recomendado o uso de baixa passagem-Número células Renca para a transfecção e implantação subsequente para minimizar quaisquer fenotípicas ou genéticas alterações que podem ocorrer após culto longo prazoure.- Usar um sistema de transposões para manipular células Renca para expressar de forma estável a proteína verde fluorescente (GFP) e luciferase de pirilampo.
- Usando uma poliacrilamida catiónica à base de lipossomas reagente de transfeco, a co-transfectar células Renca com um vector de expressão de transposase (pPGK-SB11) e uma codificação de transposão vector para a expressão de luciferase do pirilampo, bem como um gene que codifica a fusão para GFP e o gene de resistência à zeocina , ambos sob o controlo transcricional de um promotor bidireccional (pKT2 / Lubig) 19.
- Dois dias mais tarde, as células transfectadas placa, a uma diluição limitante e permitir que as células a expandir-se em meio RPMI completo suplementado com zeocina (300? G / mL). Confirmar a expressão da GFP em cada um dos clones por citometria de fluxo. Estas células são denominadas Renca-GL.
NOTA: clonagem Limitando-diluição irá permitir que as células seleccionadas para ser derivadas de uma única célula.
- Usar um sistema de transposões para manipular células Renca para expressar de forma estável a proteína verde fluorescente (GFP) e luciferase de pirilampo.
- Para implantar células Renca intrarenally, preparar células Renca into uma suspensão de uma única célula a 2 x 10 6 culas / mL em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS).
- Remover as células Renca aderentes a partir do balão de cultura de tecidos usando tripsina a 0,25% em HBSS. Após ~ 5 minutos, adiciona-RPMI completo ao frasco para neutralizar a tripsina e transferência das células para um tubo de centrífuga para a lavagem. Centrifugar as células a 300 g de força centrífuga relativa (RCF xg) durante 5 min a 25 ° C.
- Decantar o sobrenadante e ressuspender as células em HBSS. Contar as células utilizando um hemocitómetro e ajustar o volume com HBSS para se obter 2 X 10 6 células / ml.
- Desenhar as células para uma seringa de 1 ml equipada com uma agulha de calibre 18 para evitar que a tensão de corte sobre as células. Substituir a agulha de calibre 18 com uma agulha de calibre 28, antes da injecção das células tumorais. Uma injecção de 0,1 mL de entrega 2 x 10 5 culas para o rim.
2. Preparação área cirúrgica
- Prepare um cirúrgica estérilárea em uma cabine de segurança biológica, colocando uma cortina cirúrgica estéril sobre uma almofada de aquecimento. Reunir todas as fontes, incluindo fórceps, bisturi, tesouras, gotas para os olhos, 5% gaze povidona-iodo-séptico, e estéril. Autoclave todos os instrumentos antes de usar.
- Realizar a cirurgia usando uma técnica de ponta asséptica. instrumentos reesterilizar entre animais com um esterilizador talão. Usar luvas estéreis, um jaleco e uma máscara facial.
3. Preparação de animais
- Anestesiar os ratos com cetamina / xilazina (87,5 mg / kg e 12,5 mg / kg, respectivamente, IP), de acordo com as orientações institucionais. Determinar a profundidade da anestesia através da realização de um dedo do pé-pitada.
- Quando o animal é considerado não-responsivo, preparar o local da injecção (por exemplo, flanco esquerdo) em ratos Balb / c por depena (com os dedos) ou de barbear (usando cortadores) da pele.
- Mover os ratinhos a partir da área de preparação a cirurgia (por exemplo, a caixa de alojamento) para a área cirúrgica e aplicar pomada veterinário para oolhos para prevenir o ressecamento. Liberalmente pincelar o local da incisão preparado com anti-séptico 5% de povidona-iodo.
- Injectar cloridrato de bupivacaa (0,1 mL de uma 2,5 mg / mL de solução, SC) na área onde a incisão será feita como uma analgesia pré-operatória.
- Fazer uma única incisão (~ 1,0 - 1,5 cm) no flanco esquerdo dos animais utilizando um bisturi ou tesouras estéril, com cuidado para não penetrar o peritoneu. Separa-se a derme do peritoneu com uma tesoura estéreis. Dab o local da incisão com gaze de algodão estéril para remover qualquer vestígio de sangue.
- Segure o mouse com ambas as mãos, usando a mão esquerda para segurar a cabeça ea mão direita para apoiar o flanco.
- Identificar o baço através do peritoneu e, com um dedo da mão direita, apalpar o rato a partir de baixo; o rim agora deve ser visível através do peritônio. Mantenha um firme do animal para fornecer tensão em todo o peritônio e rim.
- Ter uma segunda pessoa injetar o ce tumorlls (preparada na secção 1.2.) através do peritoneu intacto para o centro do rim, utilizando uma seringa de 1 ml equipada com uma agulha de calibre 28. Proporcionar-se lentamente 0,1 mL (2 x 10 5) de células. Uma vez que as células são injectadas, segure a agulha no lugar, durante 5 - 10 s para reduzir o refluxo de células. É importante observar a necessidade de cuidado extremo durante este passo, como a pessoa injectando as células irá trazer a agulha em estreita proximidade com os dedos da pessoa que segura o rato.
- Remover a agulha e fechar a incisão com uma fina camada de adesivo de tecido de cianoacrilato.
- Colocar o animal de volta para uma gaiola limpa com uma toalha de papel estéril. Que os animais possam se recuperar em uma almofada de aquecimento. Não deixar os animais sem vigilância durante o período de recuperação. Não retornar os animais às condições de alojamento padrão até que estejam na posição vertical e esternal. Siga as orientações institucionais em todos os procedimentos que utilizam animais de laboratório.
4. BioImagem luminescente
- Monitorar o crescimento do tumor por imagem de bioluminescência.
NOTA: detalhes de procedimento para a execução de imagiologia bioluminescente pode ser obtido a partir de Lim et al. 20 O sinal da luciferase pode ser detectada tão cedo quanto 24 h após implantação de células de tumor. Como não há nenhum tumor visível do exterior, neste modelo, é essencial para monitorar o crescimento do tumor periodicamente. Dependendo da experiência concebida, o crescimento do tumor ortotico pode prosseguir durante períodos de tempo variáveis. Uma vantagem de usar as células Renca-expressar luciferase é que o crescimento do tumor pode ser repetidamente monitorizada no mesmo animal em intervalos regulares durante todo o período da experiência, e uma interrogação específica de portador de tumor e órgãos livres de tumor pode ser feito numa ponto final definido.- Injectar luciferina (0,1 mL de uma solução a 15 mg / ml em PBS estéril) ip e permitir que ele se circular durante 10 minutos antes de colocar o rato para o sistema de imagem de bioluminescência. Coloque o mo usar com o lado dorsal para cima, laminagem ligeiramente de lado, a fim de ter o rim injectado para cima.
- Medir o peso do tumor em fotões de luz emitidos por segundo (fluxo de fotões) dentro de uma região definida de interesse (ROI), usando software de análise de imagem.
- Quantificação da carga tumoral em órgãos individuais.
NOTA: A quantificao pode ser realizada em pontos de tempo definidos em órgãos individuais após a sua remoção a partir de ratos sacrificados.- Injectar os ratinhos com luciferina, tal como no passo 4.1.
- Após 10 min, sacrificar os ratinhos utilizando um procedimento aprovado.
- Dissecar os órgãos de interesse (por exemplo, os rins e pulmões; ver secção 5 abaixo). Transferir o tecido a placas de Petri de 35 x 10 mm e colocá-las no sistema de imagem de bioluminescência.
- Medir o peso do tumor em fotões de luz emitidos por segundo (fluxo de fotões) dentro de um ROI definida usando software de análise de imagem.
- Em um ponto final definido para o experimento indivíduo, eutanásia ratos portadores de tumores de acordo com as orientações institucionais preferidos (por exemplo, CO 2, deslocamento cervical, overdose de anestesia). No entanto, evitar a deslocação cervical se os pulmões devem ser recolhidas após a inflação tinta da China.
- Realizar uma avaliação bruta do crescimento do tumor primário renal no rim injectado através da medição do peso dos órgãos molhado.
- Para determinar a massa de tumor (em g), isolar 21 e pesar o rim com tumor e o rim contralateral do mesmo ratinho, onde a diferença de pesos de rim define a massa do tumor. Cuidadosamente dissecar afastado qualquer tecido conjuntivo estranho a partir dos rins excisados antes de medir os seus pesos.
- Avaliar o grau de metástase do tumor para os pulmões por inflar os pulmões com tinta da Índia antes da excisão e fixa imediatamente os pulmões em solução de Feketelass = "xref"> 22. Cálculo manual de lesões metastáticas na superfície do pulmão pode então ser realizada.
- Faça uma incisão na linha média com uma tesoura a partir de meados do abdômen, através da caixa torácica, e através das glândulas do pescoço / salivares. Cuidadosamente remover a caixa torácica utilizando tesouras e pinças, sem comprometer o tecido pulmonar.
- Expor a traqueia através da remoção do tecido conjuntivo.
- Prepara-se uma seringa de 3 mL com uma agulha de 18 gauge cheia com uma solução de tinta da China 10% em HBSS.
- Utilizando uma pinça, passe cuidadosamente uma sutura de seda sob a traquéia. Isso será usado para amarrar a traqueia, uma vez inflado.
- Cuidadosamente inserir a agulha para baixo a traqueia e lentamente deprimir a seringa para inflar os pulmões com a solução de tinta Índia. Cerca de 1 - 1,5 mL de uma solução de tinta Índia vai insuflar completamente os pulmões.
- Comprima a traqueia fechada atando vários nós, com o fio de sutura abaixo da agulha para inibir o escoamento de retorno da tinta.
- REMOVe a agulha e cortar cuidadosamente o tecido conjuntivo para remover os pulmões inflados.
- Em uma coifa química, colocar os pulmões para um tubo cónico de 15 mL contendo 5 mL de solução de Fekete (35 mL de 95% de EtOH, 15 ml de dH 2 O, 5 ml de formaldeído e 2,5 mL de ácido acídico glacial uma garrafa de vidro de 100 mL) 23.
- Permitir que os pulmões de corrigir / destain durante 24 - 48 h à temperatura ambiente antes da contagem manualmente os nódulos tumorais descorados.
- Remover os pulmões intactos após descoloração e dissecar cuidadosamente os pulmões fixados por lóbulo em um 35 x 10 mm placa de Petri. Contar o número de nódulos de tumor (nódulos branco) em cada lóbulo sob um microscópio de dissecação.
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Representative Results
A implantação bem sucedida de células Renca irá resultar em desenvolvimento tumoral no rim e metástases para os pulmões dos ratinhos. Após a excisão do portador de tumor e os rins contralaterais, pesos de tecido húmido (g) foram medidas para demonstrar a carga de tumor com base no aumento de peso (Figura 1). Tumores RENCA podem ser identificados por imuno-histoquímica através citoqueratina 8 e 18, a coloração (Figura 2). Para os estudos longitudinais, uma linha de células Renca-expressando a luciferase foi implantado. Imagiologia bioluminescente foi realizada utilizando um sistema de imagem in vivo em (IVIS) para controlar a carga do tumor e a resposta à terapia ao longo do tempo (Figura 3A). Metástases para os pulmões foi confirmada por imagiologia bioluminescente (Figura 3B) e insuflação pulmonar tinta Índia (Figura 3C).
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Figura 1. ortotópico implantação de células de tumor Renca forma uma massa renal grande. Células Renca-GL (2 x 10 5 em 0,1 ml) foram injectados intrarenally, e os pesos dos rins portadores de tumores excisados e rins contralaterais livres de tumor em gramas (+ SEM) foram determinados no dia 24. N = 15 tumor- livres e portadores de tumor dos rins. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Imunofluorescência imagem microscópica dos rins contralaterais e portadores de tumor livres de tumor. Células Renca-GL (2 x 10 5 em 0,1 ml) foram injectados intrarenally, e os rins portador de tumor e livres de tumor foram colhidas no dia 12. Os rins foram rapidamente congelado e processado para immunofimagiologia luorescence para visualizar a localização do colagénio, citoqueratina 8 e 18, e CD31. 10x imagens foram tiradas e cosido em conjunto para visualizar todo o rim portador de tumor. Barras de escala = 1 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. ortotópico implantação de células de tumor Renca leva a metástases do pulmão espontâneas. A. células Renca-GL (2 x 10 5 em 0,1 ml) foram injectados intrarenally em ratinhos Balb / c. imagens bioluminescentes foram tomadas nos dias indicados. B. No dia 23, os pulmões de ratinhos livres de tumor e portadores de tumor foram excisadas e bioluminescentes imagens foram tiradas. C. conjuntos paralelos de ratinhos no dia 23 tinham os seus pulmões inflado com tinta da China para visualizar nódulos tumorais pulmonares.Barras de escala = 1 cm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Apresenta-se um protocolo para um modelo de ratinho RCC ortotópico. O implante de células tumorais de adenocarcinoma renal de ratinho na rim de ratinho proporciona um modelo clinicamente relevante da mRCC. Este modelo resulta num tumor primário dentro do rim e metástases distantes nos pulmões, os quais são características de CCR avançado. A descrição aqui apresentada é específico para a linha de células Renca em imunocompetentes ratinhos Balb / c. Usando este modelo ortotópico, mostrámos que os tumores Renca são sensíveis à imunoterapia, demonstrando a utilidade deste modelo para o teste terapêutico 17, 24, 25, 26, 27. A capacidade para utilizar uma linha celular de tumor singeneico para implantação proporciona a vantagem de se estudar a progressão do tumor num animal imunologicamente intacto. A singeneica, ortotica, e caracte clinicamente relevanterísticas deste sistema fornecer um modelo superior que permite o teste de terapias em um modelo pré-clínica relevante. Este não pode ser replicado quando os tumores são implantados por via subcutânea. É importante mencionar que um tal sistema de modelação não está limitado a avaliação de respostas imunitárias anti-tumorais ou várias abordagens de imunoterapia para o tratamento de carcinoma de células renais. Seria possível a utilização de células de tumores humanos implantadas em ratos imunodeficientes intrarenally, dependendo do tipo de experimentação ser realizado. A disponibilidade de linhas de células RCC estabelecidas que podem ser cultivadas in vitro melhora a reprodutibilidade deste modelo ortotópico in vivo, como todos os animais podem ser implantados com um número igual de células de tumor, ao mesmo tempo. Além disso, as células tumorais podem ser manipuladas in vitro antes da implantação intra-renal que oferece a possibilidade de controlar a forma como as células crescem e / ou respondem a sinais ambientais. Uma limitação com este (e mais) IMPLANmodelos de tumor tabela é que eles contornar os primeiros eventos responsáveis para a formação de tumores, uma vantagem que é proporcionada por meio de um modelo de ratinho geneticamente modificadas para a formação de tumores nativas.
Uma desvantagem do modelo ortotópico é a incapacidade geral de visualizar o crescimento do tumor, uma característica que é facilmente monitorizado por um tumor sc por medição de compasso de calibre. A tecnologia actual utilizando células tumorais geneticamente modificadas e imagiologia bioluminescente permite medições longitudinais de tumores internos. Nós demonstramos a capacidade de determinar tumor renal primária e carga metastática em vários pontos de tempo com base em imagiologia bioluminescente e / ou extracção de órgãos 17, 24, 25. A força do nosso modelo é a disponibilidade da GFP e linha de células Renca-expressando luciferase, mas o modelo não requer esse recurso para o sucesso. Nós têm caracterizado a oumodelo RCC thotopic com ambas as células parentais Renca e Renca-GL. A seguir à implantação de células Renca-GL, tumores primários pode ser facilmente medida por imagiologia bioluminescente. Pode ser difícil controlar metástases em todo o animal, no entanto, como o tumor primário pode produzir um sinal que sobrecarrega os sinais mais baixos que podem ser emitidas a partir do local metastico. Excisar e imagiologia de órgãos individuais a partir de todo o animal permite a visualização e quantificação de metástases nesses órgãos. No modelo ortotópico Renca, os tumores de rim primários dar origem a micro-metástases espontâneas nos pulmões dos animais tão cedo como 7 dias pós-implante, como pode ser visto por luminescência no tecido pulmonar excisado 17.
Enquanto o uso de uma linha de células de tumor que expressam a luciferase neste sistema fornece o utilizador com a capacidade de controlar a progressão do tumor longitudinalmente no mesmo animal, que também proporciona o utilizador com a capacidade de Avaliado come A precisão da técnica de implante. O rim de rato é uma pequena estrutura anatómica, tornando-se possível, especialmente quando se utiliza uma agulha longa, para injectar as células tumorais através do rim e directamente no peritoneu. Imaging o rato dentro de vários dias após a injecção determina a extensão em que o implante das células tumorais está localizada no rim. Outra característica que pode complicar a injecção intra-renal é a presença de uma grande quantidade de gordura visceral, que pode acumular-se como o animal envelhece. O rim é facilmente visível através do peritônio em um rato magro, mas o rim pode tornar-se obscurecida sob lóbulos de gordura visceral que podem desenvolver ao longo do tempo.
No fim de uma dada experiência, um número de análises podem ser utilizados para determinar a carga tumoral em todo o corpo. imagiologia bioluminescente dos órgãos extirpados fornece uma medida objetiva de carga tumoral. O peso húmido de tumores primários normalizados para o kidne contralateralY como um controlo interno fornece uma medição de massa a granel. A carga metastática no pulmão também pode ser determinada por inflar os pulmões com tinta da China em bloco, para permitir a visualização de nódulos tumorais pulmonares brancos usando um microscópio de dissecação. Estas leituras pode estabelecer a carga tumoral total do corpo, que pode ser usado como uma base para investigar a eficácia terapêutica na fase pré-clínica de desenvolvimento de drogas. A expressão de GFP pelas células Renca-GL também se presta a fluir análises de citometria de tecidos portadores de tumor. No entanto, é preciso ter cuidado para qualquer avaliação de citometria de fluxo do rim portador de tumor, especialmente quando se investiga a composição e a magnitude de qualquer resposta imunológica gerada como uma consequência da terapia. Os rins são órgãos altamente vasculares, o que torna provável que a avaliação da resposta imunitária (quer pró-tumor ou anti-tumor) em todo o rins portadores de tumor irá incluir tanto "tecido- e vasculatura-localizadosd" células imunitárias no momento da colheita de órgãos. Para distinguir tecido contra células imunitárias do sangue, usamos uma técnica em que o anticorpo monoclonal anti-CD45.2 marcado com fluorocromo (mAb) é injectado iv antes da eutanásia. Os rins são preparados, em seguida, para o fluxo de citometria, que inclui coloração ex vivo com diferentes marcado com fluorocromo anti-CD45.2 mAb 28, 29. CD45.2 dupla coloração discrimina as células dentro da vasculatura do tecido no momento da colheita. Este protocolo simples permite a identificação de grande leucócitos linhagens contidos dentro da vasculatura que de outro modo poderiam confundir a interpretação da resposta imune adaptativa e inatas em tecidos. Este protocolo também elimina a necessidade para a perfusão, o que pode ter consequências indesejáveis 28, 29.
Não há atualmente um aumento da valorização e o uso de imunoterapiapara tratar o câncer. O desenvolvimento dos futuros tratamentos baseados em imunologicamente para mRCC (e outros tipos de cancro) é iniciado em laboratório, utilizando um modelo comprovadas clinicamente e fisiologicamente relevante. O modelo ortotópico RCC aqui descrito contém um número de características chave (por exemplo, tumor primário renal, metástases distantes, supressão imunológica induzida pelo tumor, e componentes para a monitorização longitudinal de crescimento do tumor) para testar a eficácia de uma variedade de modalidades terapêuticas. Também é tentador especular que este modelo pode ser adaptado no futuro para avaliar avanços em outros meios de tratamento de carcinoma de células renais, tais como cirurgia e / ou protocolos de terapia focais.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional do Câncer (R15CA173657 para AW e R01CA109446 para TSG), o Instituto do Câncer Simmons (a AW), e da Universidade de Minnestoa Suba Cancer Foundation 4 Kidney (a TSG). Agradecemos ao Dr. Kristin Anderson para a assistência com a imunofluorescência.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial tears ophthalmic ointment | Akorn | NDC 17478-162-35 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | CBGBIW011019 | |
| Betadine Solution (Povidone-iodine, 5%) | Purdue Products, L.P. | NDC 67618-155-32 | |
| 0.25% Marcaine (bupivavaine HCl injection) | Hospira | 0409-1587-50 | |
| Heating pad | Sunbeam | ||
| Syringes | BD | 309659 | |
| Gauze | Venture | 908291 | |
| Ketamine | Phoenix Pharmaceuticals | NDC 57319-609-02 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-111 | |
| Hank’s Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| IVIS | Caliper | ||
| D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | |
| India Ink | Chartpak Inc | 44201 | |
| Scissors | |||
| Forceps | |||
| Sleeping Beauty (SB) transposon system | Neuromics | SBT0200 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 |
References
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