Summary
Umsetzung eines orthotopischen Modell des Nierenzellkarzinoms in immunkompetenten Mäusen liefert den Ermittler ein klinisch relevantes System durch das Vorhandensein einer primären Nierentumor und Lungenmetastasen im gleichen Tiere definiert. Dieses System kann verwendet werden , um präklinisch eine Vielzahl von Behandlungen in vivo zu testen.
Abstract
Das Nierenzellkarzinom (RCC) beeinflusst> 60.000 Menschen in den Vereinigten Staaten jährlich und ~ 30% der RCC-Patienten hat mehrere Metastasen zum Zeitpunkt der Diagnose. Metastasierendem RCC (mRCC) unheilbar ist, mit einer medianen Überlebenszeit von 18 Monaten. Immune basierte Interventionen (zB Interferon (IFN) und Interleukin (IL) -2) induziert dauerhaft Reaktionen in einem Bruchteil mRCC Patienten, und Multi - Kinase - Inhibitoren (zB Sunitinib oder Sorafenib) oder anti-VEGF - Rezeptor - monoklonalen Antikörper (mAb) sind weitgehend palliativ, als komplette Remissionen sind selten. Solche Mängel in den derzeitigen Therapien für mRCC Patienten bieten die Gründe für die Entwicklung neuer Behandlungsprotokolle. Eine Schlüsselkomponente in der präklinischen Testung neuer Therapien für mRCC ist ein geeignetes Tiermodell. Vorteilhafte Merkmale, die die menschliche Erkrankung sind einen primären Nierentumor, Nierentumor Metastasen und ein intaktes Immunsystem zu untersuchen jede Therapie-driven immune effecto rekapitulierenr Reaktionen und die Bildung von tumorinduzierten immunsuppressiven Faktoren. Dieser Bericht beschreibt eine orthotoper mRCC Mausmodell, das alle diese Eigenschaften hat. Wir beschreiben eine intrarenalen Implantationstechnik der Mausnieren Adenokarzinom-Zelllinie unter Verwendung von Renca, gefolgt von der Beurteilung des Tumorwachstums in der Niere (primäre Standort) und die Lunge (metastatische Stelle).
Introduction
Das Nierenzellkarzinom (RCC) ist für die Mehrzahl der bösartigen Nieren Neoplasmen und etwa 3% aller Erwachsenen malignen Erkrankungen weltweit 1, 2. Wegen dem Mangel an Symptomen, Fehldiagnose und unzureichende Screening - Tools für RCC, fast 30% der Patienten mit metastasierendem RCC (mRCC) zum Zeitpunkt der Diagnose, mit einem zusätzlichen 20 bis 30% der Patienten mit einem metastasierenden Stadium 2 voran präsentiert. Diese Fälle führen zu ~ 13.500 Todesfällen pro Jahr 1, 3. Obwohl frühere Erkennung und Behandlung von primären RCC verbessert haben, fährt die Rate der RCC-Todesfälle zu erhöhen, was darauf hindeutet , dass metastatische Erkrankung für die Mortalität 3 weitgehend verantwortlich ist. Therapieentwicklung für RCC hat sich in den letzten zehn Jahren mit der Entdeckung und Umsetzung von gezielten Therapien und Immuntherapien fortgeschritten. Leider progressionsfreie survival und das Gesamtüberleben von fortgeschrittenen Fällen sind immer noch gut unter 2 Jahren für die Mehrheit der Patienten 4, 5, 6. Diese Statistiken rechtfertigen die Notwendigkeit für die weitere Forschung in die Identifizierung und Entwicklung von wirksamen Behandlungen für RCC. angemessen zu therapeutischen Interventionen für mRCC, translational-relevanten vorklinischen Modellen der Krankheit voran zunächst erforderlich.
Entwicklung einer relevanten und konsistentes Modell der menschlichen Zustand der fortgeschrittenen RCC rekapitulieren sollte einige wichtige Fragen beantworten: 1) Ist das Modell anatomisch relevant; 2) Ist den Tumorfortschritt ähnlich wie bei der menschlichen Pathologie; 3) Sind Metastasen aus dem Primärtumor entstehen; und 4) Kann primäre und metastatischen Tumorprogression im Laufe der Zeit überwacht werden? In Abhängigkeit von der Art der Behandlung untersucht, Maus RCC Tumorzellinien, menschliche Tumorzelllinien RCC und humanen RCC Patienten stamm xenogFlöße können bei immunkompetenten oder immungeschwächten Mäusen verwendet werden. Ein Wirt , der mit einem intakten und funktionalen Immunsystem ist für jene Studien erforderlich , einige Aspekte der Immuntherapie Auswertung, was die Verwendung der gut beschriebenen Renca Zelllinie aus einem spontanen renalen Adenokarzinom abgeleitet von Balb / c - Mäusen 7. Die meisten Studien injizieren Renca - Zellen subkutan (sc), die einen einfach zu messen lokalen Tumor bildet oder intravenös (iv) in Balb / c - Mäuse Versuch Lunge "Metastasen" zu erzeugen , 8, 9, 10, 11, 12. Verwendung eines sc-implantierten Tumor Renca menschliche RCC Modell hat eine Anzahl von Einschränkungen, einschließlich ungenauer Innervation Vaskulatur 13, Unterschiede in der Mikroumgebung , 14, 15, und ein Mangel an Organ- / Tumorzell Communication 13, 16. Zusätzlich metastasieren viele sc Tumoren (insbesondere Renca) nicht zu distalen Organen, die Untersuchung eines Ereignisses Hemmung , die ein gemeinsames klinisches Merkmal 17 ist. Zur Untersuchung mRCC können Renca-Zellen iv injiziert werden, um Tumorbelastung in der Lunge am primären Ort von Metastasen in RCC Patienten herzustellen. Die IV - Injektionsverfahren metastatischen Tumoren zu initiieren, jedoch erlaubt es nicht , die Untersuchung , wie, wann und warum die Zellen aus dem Primärorgan (dh die Niere) an den entfernten Ort migriert. Ein Modell mit sowohl primärer und metastatischen Krankheit offensichtlich im gleichen Tiere ist entscheidend für die Progression und Behandlung von fortgeschrittener Erkrankung zu untersuchen, besonders wenn man bedenkt, dass Metastasen typischerweise die Ursache für die Sterblichkeit bei diesen Patienten ist.
Unser Labor hat ein Mausmodell für mRCC entwickelt, die oben umrissenen alle Funktionen enthält. Um festzustellen, primary, orthotopischen Tumoren werden Renca-Zellen direkt in die Niere des Tieres durch die transluzente Peritoneum implantiert. Ein kleiner Schnitt in der linken Flanke ermöglicht die Visualisierung der Milz (als Orientierungspunkt) und die linken Niere. Unter Verwendung einer kleinen Nadel, sind Renca-Tumorzellen für orthotopische Implantation direkt in die Niere durch das Peritoneum injiziert. Im Vergleich zu anderen Methoden der Renca - Zellen unter die Nierenkapsel 18 ist diese Methode der Implantation Implantation ermöglicht einen höheren Durchsatz, da es ziemlich nicht-invasive, nicht Vernähen erforderlich ist , ist eine niedrige Schmerz Klasse und ist zeitsparend , wenn geübt.
Diese gut charakterisierten Modellergebnisse in reproduzierbarer Primärtumorbelastung (~ 99% Aufnahmerate) in der injizierten Niere sowie metastatischen Tumorbelastung in der Lunge. Die wesentlichen Vorteile dieses Modells sind seine syngenen Natur, für die Immuntherapie Untersuchungen zu ermöglichen; seine spontanen Metastasen, zu studieren, um eindvanced Krankheit; und seine orthotope Implantation, die anatomische Auswirkungen auf den Krankheitsverlauf und die Behandlung zu modellieren. stark profitieren von der Nutzung dieses Modells während der präklinischen Entwicklung gezielt Therapien RCC auf Targeting würde.
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Protocol
Das folgende Protokoll beschreibt ein experimentelles Verfahren zum Induzieren und Überwachen des Wachstums von experimentellen orthotopischen Nierentumoren und möglichen spontaner Metastasen. Alle folgenden Verfahren werden in Einklang mit dem institutionellen Richtlinien und anerkannten Verfahren im Hinblick auf die humane Verwendung von Versuchstieren durchgeführt.
1. Wartung von Zelllinien
- Pflegen murine renal-Adenokarzinom-Zelllinie, Renca, in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium mit 10% fötalen Kälberserum (FCS) supplementiert, 1% Penicillin-Streptomycin und 1 mM jeweils von nicht-essentiellen Aminosäuren, L-Glutamin und Natriumpyruvat (als komplettes RPMI bezeichnet). Kulturzellen in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2.
Hinweis: Wie bei jeder etablierten Zelllinie, ist es empfehlenswert, niedrige Passage-Nummer Renca-Zellen für die Transfektion und nachfolgende Implantation zu verwenden, um alle phänotypischen oder genetische Veränderungen zu minimieren, die nach Langzeit Kult auftreten könntenure.- Verwenden, um ein Transposon-System Renca-Zellen zu konstruieren, in stabiler Weise der grün fluoreszierendes Protein (GFP) und Glühwürmchen-Luciferase zu exprimieren.
- Verwendung eine kationischen Liposomen basierende Transfektionsreagenz, co-transfizieren Renca-Zellen mit einem Transposase-Expressionsvektor (pPGK-SB11) und eine Transposon-Vektor-Codierung für die Expression der Firefly Luciferase, sowie eine Fusions-Gen-Kodierung für GFP und die Zeocin-Resistenz-Gene , die beide unter der transkriptionellen Kontrolle eines bidirektionalen Promotor (PKT2 / Lubig) 19.
- Zwei Tage später Platte der transfizierten Zellen bei einer Grenzverdünnung und damit die Zellen expandieren in komplettem RPMI mit Zeocin ergänzt (300 ug / ml). Bestätigen GFP-Expression in jedem Klon mittels Durchflusszytometrie. Diese Zellen werden Renca-GL bezeichnet.
HINWEIS: Die Begrenzung Verdünnung Klonen die ausgewählten Zellen erlauben, aus einer einzelnen Zelle abgeleitet werden.
- Verwenden, um ein Transposon-System Renca-Zellen zu konstruieren, in stabiler Weise der grün fluoreszierendes Protein (GFP) und Glühwürmchen-Luciferase zu exprimieren.
- Einzupflanzen i Renca-Zellen intrarenally, bereiten Renca-Zellennto einer Einzelzellsuspension bei 2 x 10 6 Zellen / ml in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS).
- Entfernen anhaftende Renca-Zellen aus dem Gewebekulturflasche unter Verwendung von 0,25% Trypsin in HBSS. Nach ~ 5 min, fügen kompletten RPMI in den Kolben um das Trypsin und übertragen Sie die Zellen in ein Zentrifugenröhrchen zum Waschen zu neutralisieren. Zentrifuge die Zellen bei 300 g Relativzentrifugalbeschleunigung Kraft (RCF xg) für 5 min bei 25 ° C.
- Man dekantiert den Überstand und die Zellen in HBSS. Zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und die Lautstärke mit HBSS , um 2 x 10 6 Zellen / ml.
- Zeichnen Sie die Zellen in eine 1-ml-Spritze, ausgestattet mit einer 18-Gauge-Nadel Scherspannung auf den Zellen zu verhindern. Ersetzen die 18-Gauge-Nadel mit einer 28-Gauge-Nadel vor der Injektion der Tumorzellen. Eine Injektion von 0,1 mL liefert 2 x 10 5 Zellen in der Niere.
2. OP-Bereich Vorbereitung
- Vorbereiten eines sterilen chirurgischenGebiet in einem biologischen Sicherheit Kabinett durch ein steriles chirurgisches Abdecktuch über ein Heizkissen platzieren. Sammeln Sie alle Verbrauchsmaterialien, einschließlich Pinzetten, Skalpell, Schere, Augentropfen, 5% Povidon-Jod antiseptisch, und sterile Gaze. Autoclave alle Instrumente vor dem Gebrauch.
- Führen Sie die Operation eine aseptische Spitzentechnik. Resterilisieren Instrumente zwischen den Tieren mit einem Wulst Sterilisator. Tragen sterile Handschuhe, einen Laborkittel und eine Gesichtsmaske.
3. Vorbereitung der Tiere
- Anesthetize die Mäuse mit Ketamin / Xylazin (87,5 mg / kg und 12,5 mg / kg bzw. ip) nach institutionellen Richtlinien. Bestimmen Sie Narkosetiefe durch eine Zehen Prise durchführen.
- Wenn das Tier nicht reagiert , in Betracht gezogen, bereitet die Injektionsstelle (zB linke Flanke) an Balb / c - Mäusen durch Rupfen (mit Fingern) oder Rasieren (mit Clippers) , um das Fell.
- Bewegen , um die Mäuse vor der Operation Vorbereitungsbereich (zB der Gehäusekäfig) zu dem Operationsbereich und wenden vet Salbe auf demAugen Trockenheit zu verhindern. Liberally Tupfer die vorbereitete Inzisionsstelle mit 5% Povidon-Jod antiseptisch.
- Einzuspritzen Bupivacain-Hydrochlorid (0,1 ml einer 2,5 mg / ml Lösung, sc) in den Bereich, wo der Schnitt wird als präoperative Analgesie durchgeführt werden.
- Führe einen einzigen Einschnitt (~ 1,0 bis 1,5 cm) auf der linken Flanke des Tieres ein steriles Skalpell oder eine Schere vorsichtig, um nicht das Peritoneum zu durchdringen. Trenne die Dermis aus dem Peritoneum mit einer sterilen Schere. Dab die Inzisionsstelle mit sterilen Baumwollgaze kein Blut zu entfernen.
- Halten Sie die Maus mit beiden Händen, die linke Hand mit dem Kopf und die rechte Hand zu halten, um die Flanke zu unterstützen.
- Identifizieren der Milz durch das Peritoneum und mit einem Finger der rechten Hand, palpiert die Maus von unten; sein die Niere sollte nun sichtbar durch das Peritoneum. Halten Sie einen festen Halt des Tieres Spannung durch das Peritoneum und Niere zu liefern.
- Eine zweite Person soll den Tumor ce injizierenLLS (hergestellt in Abschnitt 1.2.) durch die intakte Peritoneum in die Mitte der Niere einer 1-ml-Spritze mit einer 28-Gauge-Nadel ausgerüstet werden. Liefert langsam 0,1 ml (2 x 10 5) der Zellen. Sobald die Zellen injiziert werden, hält die Nadel an Ort und Stelle für die von 5 bis 10 s um den Rückfluss von Zellen zu reduzieren. Es ist wichtig, die Notwendigkeit extreme Vorsicht bei diesem Schritt zu beachten, da die Person, die die Zellen injizieren wird die Nadel in unmittelbare Nähe zu den Fingern der Person bringt die Maus hält.
- Entfernen Sie die Nadel und Schließen des Einschnitts mit einer dünnen Schicht aus Cyanoacrylatkleber.
- Legen Sie das Tier wieder in einen sauberen Käfig mit einem sterilen Papiertuch. Lassen Sie die Tiere auf einem Heizkissen erholen. Lassen Sie nicht die unbeaufsichtigten Tiere während der Erholungsphase. Die Tiere nicht zur Standardwohnbedingungen zurück, bis sie aufrecht und sternalen sind. Folgen Sie Richtlinien des Instituts in allen Verfahren unter Verwendung von Labortieren.
4. BioLeucht Imaging
- Überwachen Sie das Tumorwachstum durch Biolumineszenz-Bildgebung.
HINWEIS: Verfahrensdetails für Biolumineszenz - Bildgebung durchführen können von Lim et al erhalten werden. 20 Das Luciferase - Signal kann bereits 24 h nach der Tumorzellimplantation nachgewiesen werden. Da es kein von außen sichtbarer Tumor in diesem Modell ist, ist es wichtig, das Tumorwachstum regelmäßig zu überwachen. Je nach geplantes Experiment kann orthotopen Tumorwachstum gehen für längere oder kürzere Zeiträume. Ein Vorteil der Verwendung der Luciferase-exprimierenden Renca-Zellen besteht darin, dass das Tumorwachstum kann wiederholt im gleichen Tiere in regelmäßigen Abständen für die Dauer des Experiments überwacht werden, und eine spezifische Abfrage von tumortragenden und tumorfreien Organen kann an einen getan werden definierten Endpunkt.- Einzuspritzen Luciferin (0,1 ml einer 15 mg / ml-Lösung in sterilem PBS) ip und läßt es für 10 Minuten zirkulieren, bevor die Maus in das Biolumineszenz-Abbildungssystem setzt. Legen Sie den mo verwenden, um mit seiner dorsalen Seite nach oben gerollt leicht auf der Seite, um nach oben zeigt die injizierte Niere zu haben.
- Messen Sie die Tumorbelastung in Lichtphotonen emittiert pro Sekunde (Photonenfluß) innerhalb eines definierten Bereichs von Interesse (ROI) unter Verwendung der Bildanalyse-Software.
- Die quantitative Bestimmung der Tumorlast in einzelnen Organen.
HINWEIS: Die quantitative Bestimmung kann zu bestimmten Zeitpunkten in einzelnen Organen nach der Entfernung aus eingeschläfert Mäusen durchgeführt werden.- Injizieren Sie die Mäuse mit Luciferin, wie in Schritt 4.1.
- Nach 10 min einschläfern die Mäuse ein genehmigtes Verfahren.
- Seziert die Organe von Interesse (zB, die Nieren und die Lunge, siehe Abschnitt 5). Übertragen, um das Gewebe zu 35 x 10 mm-Petrischalen und legen sie in das Biolumineszenz-Bilderzeugungssystem.
- Messen Sie die Tumorbelastung in Lichtphotonen emittiert pro Sekunde (Photonenfluß) innerhalb eines definierten ROI unter Verwendung von Bildanalysesoftware.
- Zu einem definierten Endpunkt für das einzelne Experiment euthanize tumortragenden Mäuse gemäß bevorzugte institutionellen Richtlinien (zB CO 2, zervikale Dislokation, Anästhesie - Überdosis). Allerdings vermeiden Zervikaldislokation wenn Lungen nach Tusche Inflation werden gesammelt sind.
- Führen Sie eine grobe Bewertung des primären Nierentumorwachstums in der injizierten Niere durch das nasse Organgewicht zu messen.
- Um die Tumormasse zu bestimmen (in g), Isolat 21 und wiegt die tumortragenden Niere und die kontralaterale Niere von der gleichen Maus, wo der Unterschied in Nierengewicht die Tumormasse definiert. seziert sorgfältig all Fremd Bindegewebe aus den ausgeschnittenen Nieren entfernt, bevor sie ihre Gewichte zu messen.
- Beurteilen Sie den Grad der Tumormetastasierung in die Lunge durch die Lungen mit Tusche Aufblasen vor der Exzision und sofort zur Festsetzung der Lunge in Fekete-Lösunglass = "xref"> 22. Manuelle Berechnung der metastatischen Läsionen auf der Lungenoberfläche kann dann durchgeführt werden.
- Machen Sie einen Mittelschnitt mit einer Schere in der Mitte Bauch, durch den Brustkorb, und nach oben durch die Hals / Speicheldrüsen beginnen. den Brustkorb Schere und Pinzette, ohne die Verwendung von Lungengewebe sorgfältig entfernen.
- Setzen Sie die Luftröhre durch das Bindegewebe zu entfernen.
- Bereiten eine 3 ml-Spritze mit einer 18-Gauge-Nadel mit 10% Tusche Lösung in HBSS gefüllt.
- Mit einer Pinzette vorsichtig fädelt eine Seidennaht unter der Trachea. Dies wird verwendet werden, um die Luftröhre abzubinden einmal aufgeblasen.
- Schieben Sie die Nadel nach unten die Luftröhre und drücken Sie langsam die Spritze in die Lunge mit der Tusch Lösung aufzublasen. Etwa 1 bis 1,5 ml Tusch Lösung wird vollständig in die Lunge aufzublasen.
- Pinch die Trachea verschlossen durch mehrere Knoten zu binden, mit der Naht unter der Nadel um den Rückfluss der Tinte zu hemmen.
- Remove die Nadel und sorgfältig das Bindegewebe wegschneiden die aufgeblähte Lunge zu entfernen.
- In einem Laborabzug, legen die Lungen in eine 15 ml konischen Röhre 5 ml Fekete-Lösung enthält (35 ml 95% EtOH, 15 ml dH 2 O, 5 ml Formaldehyd und 2,5 ml Eisessig in eine 100 ml Glasflasche) 23.
- Lassen Sie die Lungen beheben / destain für 24 bis 48 h bei Raumtemperatur vor manuell auf den entfärbten Tumorknötchen zu zählen.
- Entfernen Sie die intakte Lunge nach Entfärben und sorgfältig die festen Lungen durch Lappens in einem 35 x 10 mm Petrischale sezieren. Zähle die Anzahl der Tumorknoten (weißen Knötchen) auf jeden Lappen unter einem Binokular.
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Representative Results
Die erfolgreiche Implantation von Renca-Zellen wird in der Niere und Metastasen in den Lungen der Mäuse bei der Tumorentstehung führen. Nach der Exzision der tumortragenden und den kontralateralen Nieren wurden Feuchttuchgewichte (g) gemessen , um die Tumorbelastung zu demonstrieren , basierend auf einem erhöhten Gewicht (Abbildung 1). Renca - Tumoren können durch Immunhistochemie durch Zytokeratin 8 und 18 Anfärbung (Figur 2) identifiziert werden. Für Langzeitstudien wurde eine Luciferase-exprimierenden Zelllinie Renca implantiert. Biolumineszenz - Bildgebung wurde unter Verwendung eines in vivo - Bildgebungssystem (IVIS) durchgeführt , um die Tumorlast und Ansprechen auf die Therapie über die Zeit (3A) zu verfolgen. Metastasierung in die Lunge wurde durch Biolumineszenz - Bildgebung (3B) und Tuschlungeninflation (3C) bestätigt.
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Abbildung 1. Orthotope Implantation von Renca - Tumorzellen bildet einen großen Nierenmasse. Renca-GL - Zellen (2 × 10 5 in 0,1 ml) wurden intrarenally injiziert, und die Gewichte der exzidiert tumortragenden Nieren und tumorfrei kontralateralen Nieren in Gramm (+ SEM) wurden am Tag 24 bestimmt n = 15 tumor- frei und tumortragenden Nieren. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Immunfluoreszenzmikroskopische Aufnahme von tumorfreien kontralateralen und tumortragenden Nieren. Renca-GL - Zellen (2 × 10 5 in 0,1 ml) wurden intrarenally injiziert und die tumortragenden und tumorfreien Nieren wurden am Tag geerntet 12. Die Nieren wurden schockgefroren und für immunof verarbeitetluorescence Abbilden der Position von Kollagen, Cytokeratin-8 und 18 und CD31 zu visualisieren. 10x Bilder wurden aufgenommen und vernäht die gesamte tumortragenden Niere anzuzeigen. Maßstabsbalken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Orthotope Implantation von Renca - Tumorzellen führt zur spontanen Lungenmetastasen. A. Renca-GL - Zellen (2 × 10 5 in 0,1 ml) wurden intrarenally in Balb / c - Mäuse injiziert. Biolumineszenz-Bilder wurden an den angegebenen Tagen genommen. B. Am Tag 23 werden die Lungen von tumorfrei und tumortragenden Mäuse wurden ausgeschnitten und Biolumineszenz - Bilder aufgenommen wurden. C. Parallel Sätze von Mäusen am Tag 23 hatten ihre Lungen mit Tusche aufgeblasen Lungentumorknoten zu visualisieren.Maßstabsbalken = 1 cm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Wir präsentieren ein Protokoll für ein orthotoper RCC Mausmodell. Implantation von Maus-Nieren-Adenokarzinom-Tumorzellen in der Maus Niere stellt ein klinisch relevantes Modell der mRCC. Dieses Modell führt zu einem Primärtumor in der Niere und die Fernmetastasen in der Lunge, die beiden Merkmale des fortgeschrittenen RCC sind. Die Beschreibung hierin präsentierte ist spezifisch für die Renca-Zelllinie in immunokompetenten Balb / c-Mäusen. Unter Verwendung dieses orthotopische Modell haben wir gezeigt , dass die Renca - Tumoren zu Immuntherapie ansprechen, demonstriert die Brauchbarkeit dieses Modells für die therapeutische Tests 17, 24, 25, 26, 27. Die Fähigkeit, eine syngene Tumorzelllinie zur Implantation zu verwenden, bietet den Vorteil der Tumorprogression in einem immunologisch intakten Tiere studieren. Die syngenen, orthotoper und klinisch relevante characteschaften dieses System ein überlegenes Modell liefern, die für die Prüfung von Therapien in einem relevanten vorklinischen Modell ermöglicht. Dies kann nicht repliziert werden, wenn die Tumore subkutan implantiert werden. Es ist wichtig zu erwähnen, dass ein solches Modellsystem nicht auf die Bewertung anti-Tumor-Immunantworten oder verschiedene immuntherapeutische Ansätze zur Behandlung von RCC beschränkt ist. Es wäre denkbar, intrarenally in immundefiziente Mäuse implantiert menschliche Tumorzellen zu verwenden, von der Art des Experimentierens je durchgeführt wird. Die Verfügbarkeit von etablierten RCC - Zelllinien , die in vitro kultiviert werden können , verbessert die Reproduzierbarkeit dieses in vivo orthotopische Modell, da alle Tiere können mit einer gleichen Anzahl von Tumorzellen , die gleichzeitig implantiert werden. Darüber hinaus können die Tumorzellen in vitro manipuliert werden , vor der Implantation intrarenalen die Möglichkeit bieten , zu steuern , wie die Zellen wachsen und / oder auf Umweltsignale zu reagieren. Eine Einschränkung bei dieser (und die meisten) IMPLANTabelle Tumormodellen ist, dass sie die frühen Ereignisse, die für die Tumorbildung, einen Nutzen zu umgehen, die durch die Verwendung eines Mausmodells gentechnisch verändert für die Bildung von Tumoren autochthonen gewährt wird.
Ein Nachteil des orthotopen Modells ist die allgemeine Unfähigkeit, das Tumorwachstum zu visualisieren, ein Merkmal, das für einen sc Tumor durch Dickenmessung leicht überwacht wird. Die derzeitige Technologie gentechnisch veränderten Tumorzellen und Biolumineszenz-Bildgebung ermöglicht Längs Messungen der inneren Tumoren. Wir haben die Fähigkeit zu bestimmen , primären und metastatischen Nierentumorbelastung zu verschiedenen Zeitpunkten bezogen auf Biolumineszenz - Bildgebung und / oder Organextraktion 17 gezeigt, 24, 25. Eine Stärke unseres Modells ist die Verfügbarkeit des GFP und Luciferase-exprimierenden Renca-Zelllinie, aber das Modell erfordert nicht diese Funktion für den Erfolg. Wir charakterisierten die oderthotopic RCC-Modell mit sowohl parentalen Renca und Renca-GL-Zellen. Nach der Implantation von Renca-GL-Zellen können primäre Tumoren leicht durch Biolumineszenz-Bildgebung gemessen werden. Es kann schwierig sein, Metastasen im ganzen Tiere zu überwachen, aber, wie der Primärtumor ein Signal erzeugen kann, dass die unteren Signale überfordert, die von der metastatischen Seite emittiert werden könnten. Exzision und Abbilden der einzelnen Organe aus dem gesamten Tier ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung von Metastasen in diesen Organen. Im Renca orthotoper Modell gibt die primären Nierentumoren Anstieg der spontanen Mikro-Metastasen in den Lungen der Tiere so früh wie 7 Tage nach der Implantation, wie durch Lumineszenz in dem ausgeschnittenen Lungengewebe 17 zu sehen.
Während die Verwendung eines in diesem System Tumorzellinie Luciferase-exprimierenden den Benutzer die Möglichkeit bietet, Tumorprogression in Längsrichtung in demselben Tiere zu verfolgen, bietet sie auch den Anwender mit der Fähigkeit zum evaluate die Präzision der Implantationstechnik. Die Maus Niere ist eine kleine anatomische Struktur, wodurch es möglich wird, insbesondere wenn eine lange Nadel verwendet wird, um die Tumorzellen durch die Niere zu injizieren, und direkt in das Peritoneum. Abbilden der Maus innerhalb einiger Tage der Injektion bestimmt das Ausmaß, in dem die Implantation der Tumorzellen der Niere lokalisiert ist. Ein weiteres Merkmal, das die intrarenalen Injektion erschweren kann, ist das Vorhandensein einer Fülle von viszeralem Fett, die als Tieralter ansammeln können. Die Niere ist leicht sichtbar durch das Peritoneum in einer mageren Maus, aber die Niere kann unter Lappen von viszeralem Fett verdeckt, die im Laufe der Zeit entwickeln kann.
Bei Beendigung eines gegebenen Experiment kann eine Anzahl von Bewertungen verwendet werden, um die Ganzkörper-Tumorlast zu bestimmen. Biolumineszenz-Bildgebung der exzidiert Organe stellt ein objektives Maß der Tumorlast. Das Naßgewicht von Primärtumoren normiert auf die kontralaterale kidney als interne Kontrolle stellt eine bulk Massenmessung. Die metastatischen Belastung in der Lunge kann auch durch Aufblasen der Lungen mit Tusche en bloc zur Visualisierung von weißen Lungentumorknoten mit einem Binokular zu ermöglichen , bestimmt werden. Diese Ablesungen können Ganzkörpertumorbelastung schaffen, die als Grundlage verwendet werden können, um die therapeutische Wirksamkeit bei der präklinischen Phase der Arzneimittelentwicklung für die Untersuchung. Die Expression von GFP durch die Renca-GL-Zellen eignet sich auch zur zytometrischen Strömung des tumortragenden Geweben analysiert. Vorsicht ist jedoch für jede durchflusszytometrische Beurteilung der tumortragenden Niere ausgeübt werden, insbesondere, wenn die Zusammensetzung und das Ausmaß jeglicher Immunantwort als Folge der Therapie erzeugt untersuchen. Nieren sind gefäß Organe, ist es wahrscheinlich macht, dass die Bewertung der Immunantwort (entweder pro-Tumor- oder anti-Tumor) im gesamten tumortragenden Nieren beide umfassen wird „Gewebe- und Vaskulatur-localized“Immunzellen zum Zeitpunkt der Organentnahme. an Gewebe im Vergleich zu Blutimmunzellen zu unterscheiden, verwenden wir eine Technik, bei der Fluorochrom-markierten anti-CD45.2 monoklonalen Antikörper (mAb) iv vor Euthanasie eingespritzt werden. Die Nieren dann für die Strömung bereit sind Cytometry, die mit unterschiedlichem Fluorochrom-markierten anti-CD45.2 mAb 28, 29. Dual - CD45.2 Färbung unterscheidet , Zellen innerhalb des Gefäßsystemes aus dem Gewebe zum Zeitpunkt der Ernte. Dieses einfache Protokoll ermöglicht die Identifizierung von größeren Leukozyten- ex vivo - Färbung umfasst Abstammungslinien innerhalb des Gefäßsystems enthalten ist, die ansonsten die Interpretation von adaptiven und angeborenen Immunantwort in Geweben verwirren könnten. beseitigt dieses Protokoll auch die Notwendigkeit für die Perfusion, die 28, 29 unbeabsichtigte Folgen haben kann.
Es gibt derzeit eine erhöhte Wertschätzung für und die Verwendung von Immuntherapiezur Behandlung von Krebs. Die Entwicklung zukünftiger immunologisch basierte Behandlungen für mRCC (und andere Krebsarten) beginnt im Labor eines clinically- und physiologisch relevantes Modell. Das orthotopischen RCC Modell enthält hier beschrieben eine Reihe von Schlüsselmerkmalen (zB primären Nierentumor, entfernter Metastasen, tumorinduzierter Immunsuppression, und Komponenten für die Überwachung des Längstumorwachstums) zum Testen der Wirksamkeit einer Vielzahl von therapeutischen Modalitäten. Es ist verlockend, auch darüber zu spekulieren, dass dieses Modell in der Zukunft angepasst werden könnten Fortschritte in anderen Mittel zur Behandlung von RCC, wie chirurgische und / oder fokale Therapieprotokolle auszuwerten.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Cancer Institute (R15CA173657 zu AW und R01CA109446 zu TSG) unterstützt, die Simmons Cancer Institute (AW) und die University of Minnestoa Climb 4 Kidney Cancer Foundation (TSG). Wir danken Dr. Kristin Anderson für die Unterstützung bei der Immunofluoreszenz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial tears ophthalmic ointment | Akorn | NDC 17478-162-35 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | CBGBIW011019 | |
| Betadine Solution (Povidone-iodine, 5%) | Purdue Products, L.P. | NDC 67618-155-32 | |
| 0.25% Marcaine (bupivavaine HCl injection) | Hospira | 0409-1587-50 | |
| Heating pad | Sunbeam | ||
| Syringes | BD | 309659 | |
| Gauze | Venture | 908291 | |
| Ketamine | Phoenix Pharmaceuticals | NDC 57319-609-02 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-111 | |
| Hank’s Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| IVIS | Caliper | ||
| D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | |
| India Ink | Chartpak Inc | 44201 | |
| Scissors | |||
| Forceps | |||
| Sleeping Beauty (SB) transposon system | Neuromics | SBT0200 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 |
References
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