Summary
Murino de trasplante de todo el espesor de la piel es un modelo bien establecido para estudiar el rechazo en un entorno aloinmune. A continuación, ofrecemos un tutorial de cada paso que participan en la realización de un c BALB / -> C57BL 6 trasplante de piel / de espesor total.
Abstract
Murino de trasplante de todo el espesor de la piel es un modelo in vivo bien establecido para estudiar la respuesta aloinmune y rechazo del trasplante. A pesar de su aplicación limitada a los seres humanos, el trasplante de piel en ratones ha sido ampliamente empleado para la investigación del trasplante. El procedimiento es fácil de aprender y realizar, y que no requiere técnicas de microcirugía delicada ni una amplia formación. Además, el rechazo del injerto en este modelo se produce en una reacción inmunológica muy reproducible y se monitoriza fácilmente mediante la inspección directa y palpación. Además, el trasplante de piel secundaria con injertos de donantes emparejados o de la piel de otro fabricante puede llevar a cabo en modelos de trasplante más complejos como un método alternativo y sin complicaciones para evaluar la tolerancia específica del donante. Las complicaciones son bajos y son, en general, limitada a una sobredosis de anestesia o dificultad respiratoria después del procedimiento. El fracaso del injerto, por el contrario, se produce habitualmente como resultado de una mala preparación de la grpopa, posicionamiento incorrecto en el lecho del injerto, o la colocación inadecuada de la venda. En este artículo, se presenta un protocolo para el trasplante de piel de espesor completo en ratones y describimos los pasos son importantes y necesarias para el éxito del procedimiento.
Introduction
El trasplante de órganos es el tratamiento de elección para pacientes con insuficiencia orgánica terminal, y los resultados han mejorado notablemente con los avances en procedimientos quirúrgicos y protocolos de inmunosupresión. Sin embargo, la inmunosupresión a largo plazo se asocia con efectos secundarios significativos, y el desarrollo de nuevas estrategias que promueven la tolerancia sigue siendo el objetivo de la investigación trasplante moderna.
Numerosos modelos animales se han desarrollado para la investigación básica en el trasplante, para el estudio de los mecanismos de rechazo de aloinjertos y para poner a prueba la inmunosupresión se aproxima a la prevención del rechazo del injerto y para promover la tolerancia a largo plazo 1-3. Los modelos de ratón han convertido en el pilar de la investigación inmunológica debido a la disponibilidad exclusiva y extensa de anticuerpos terapéuticos y de diagnóstico y cepas puras y transgénicos bien definidos. El trasplante de piel es un procedimiento simple que no requiere conocimientos especiales de microcirugía y puedemonitorizar fácilmente después de la operación. En conjunto, el trasplante de piel de ratón ha sido una herramienta excepcional para estudiar muchos aspectos implicados en la respuesta aloinmune, incluyendo la entrega de antígeno, el tráfico de células y la destrucción del tejido durante el rechazo de injerto 4,5.
Aquí, se muestra el procedimiento paso a paso para el trasplante de piel de espesor total usando el modelo de ratón, y se describen los pasos son importantes y necesarias para un éxito del injerto de la piel trasplantada.
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Protocol
Todos los procedimientos se realizaron de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Instituto Nacional de Salud (NIH) y fueron aprobados por el Comité de la Universidad Johns Hopkins y Uso Animal Care (JHUACUC). Los procedimientos específicos se realizaron bajo la MO13M292 protocolos ACUC aprobado y MO13M370.
1. Donantes de la cosecha de la piel
- Anestesiar el ratón donante con isoflurano (vaporizador de inducción en el 4%, el mantenimiento con un 1 - 2% a través del cono del ratón). Utilice el dedo del pie retirada pizca reflejo para controlar la profundidad de la anestesia.
- El uso de una máquina de afeitar eléctrica, afeitarse la parte posterior del animal y desinfectar con 10% de yodo de povidona (por ejemplo, Betadine).
- Con unas tijeras estériles, guantes y una técnica aséptica, piel de la espalda de los donantes de la cosecha desde la cadera hasta el cuello, con disección roma a nivel del tejido conjuntivo laxo.
- La eutanasia a los animales por dislocación cervical después de cosechar elinjerto de piel.
- Bajo el microscopio, separar el tejido conjuntivo, tejido graso, y panículo carnoso de la piel de la espalda con unas tijeras finas tenotomía. El panículo carnoso es un músculo delgado, transparente responsable de los movimientos espasmódicos de la piel.
- Utilizando una técnica estéril instrumentos, cortar los injertos de 15 mm x 15 mm de la piel de la espalda para una de 10 mm x 10 mm a 15 mm x 15 mm lecho del injerto.
- Guarde los injertos sobre gasas empapadas con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) en una placa de Petri en hielo.
NOTA: 8 - 10 injertos se puede obtener de un ratón donante.
2. receptor de trasplante de piel
- Anestesiar al ratón receptor con isoflurano (vaporizador inducción a 4%, el mantenimiento con un 1 - 2% a través del cono del ratón). Utilice el dedo del pie retirada pizca reflejo para controlar la profundidad de la anestesia.
- Administrar 0,02 mg / kg de peso corporal de buprenorfina para el alivio del dolor postoperatorio.
- Afeitar el lado de la espalda del animal en el que el wi injertoll ser insertada y desinfectar con povidona yodada al 10%.
- Con unas tijeras, corte a 10 mm x 10 mm a 15 mm x 15 mm cuadrado de piel. El tamaño del defecto debe ser ligeramente mayor (10%) que el injerto. Cortar tan superficialmente como sea posible. Tenga cuidado de preservar el panículo carnoso y vasos. El panículo carnoso puede ser distinguida de la fascia subyacente por su movilidad y los vasos sanguíneos que se ejecutan superficial a ella.
- Coloque el injerto en el lecho del injerto, evitando pliegues a lo largo de los bordes.
- Coloque 8 puntos de sutura en las esquinas y en el centro de cada borde. Para cada sutura, pasar la aguja a través del injerto y luego a través del panículo carnoso del injerto cama debajo de la piel destinatario circundante.
- Retire la máscara anestésica y dejar que el animal se recupere de la anestesia parcialmente antes de aplicar el vendaje adhesivo.
- Envolver el ratón receptor con una venda adhesiva con una gasa doblada sobre el injerto. Hacer el vendaje mediante la combinación de dos vendajes, cortandola parte adhesiva de una y la colocación de las dos almohadillas absorbentes juntos.
- Vigilar estrechamente el ratón durante la recuperación para asegurar que el vendaje no está restringiendo la excursión del tórax y la respiración. Quitar el vendaje si el ritmo respiratorio disminuye o el animal empieza a jadear o respirar superficialmente.
3. Cuidado posoperatorio
- Administrar enrofloxacina 5 mg / kg después de la cirugía para la profilaxis de infección.
- Coloque el ratón trasplantado en una jaula limpia sobre una almohadilla térmica para microondas hasta que se recupere completamente de la anestesia.
- Observar el ratón durante 1 hora después de la operación antes de devolverlo a la instalación de la vivienda.
- Siete días después de la cirugía, anestesiar el ratón como en el paso 2.1. Retire el vendaje cortando sólo a través de la parte ventral de la venda.
- Observar y palpar el injerto al día siguiente en busca de signos de formación de costras, la contracción, o dureza. Si está presente, el injerto puede no haber logrado vasculariza adecuadación y debe ser considerado como un fallo técnico.
- Supervisar diariamente para detectar signos de rechazo. Considere injertos rechazado cuando ≥90% del tejido de injerto se vuelve necrótico.
- La eutanasia a los animales rechazados y les cosechar para su análisis.
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Representative Results
La colocación del vendaje en el ratón receptor es un paso importante del procedimiento. El injerto de piel se coloca en el tronco receptor, entre el hombro, cadera y columna vertebral (Figura 1). El vendaje se hace con una gasa plegada y la combinación de dos vendas adhesivas de plástico. El ratón receptor se coloca con el injerto hacia abajo sobre la gasa en el centro de la venda. El uso de dos pinzas de micro curvas, el extremo inferior del vendaje se tira primero, y luego la parte superior del vendaje se envuelve sobre el ratón con el abdomen.
En los modelos completos de desajuste, injertos de piel de espesor completo se deniegan en 8 a 12 días. En los modelos de desadaptación menores, respuestas de rechazo son más lentos, más variable, y la aparición de injerto de piel se caracteriza por distintos cambios menores, tales como la contracción o la pérdida de pelo (Figura 2). rechazo agudo del injerto génerosLLY comienza con hinchazón y eritema del injerto. Estos eventos son seguidas por la desecación del injerto, la contracción, y la formación de costra (Figura 2B y C). Dependiendo del grado de falta de coincidencia MHC y el protocolo de inmunosupresión, el rechazo se puede producir por un proceso subaguda, marcada por cambios sutiles, tales como pérdida de pelo, pigmentación, crestas dérmicas, y el volumen del injerto. En estos casos, un injerto rechazado aparece brillante, blanco, y sin pelo, con bordes irregulares (Figura 2F) 14.
Utilizando este modelo de trasplante de piel, se investigó un nuevo enfoque de orientación metabolismo de las células T para prevenir el rechazo del injerto 15. Es bien sabido que las vías de señalización metabólicas desempeñan papeles críticos en el dictado de los resultados de las respuestas de células T 16. células T vírgenes dependen de la fosforilación oxidativa mitocondrial para generar la energía necesaria para la vigilancia inmune básico. Sin embargo,tras la activación, las células T efectoras metabólicamente reprograman a la glucólisis aeróbica y exhiben el metabolismo incrementado glutamina 16,17. El uso de ratones Balb / c como donantes y C57BL / 6 como receptores, se observó que la inhibición de la glicolisis y la fosforilación oxidativa metabolismo (2DG + metformina) o glutamina sola (DON) prolongó la supervivencia del injerto de piel, pero el bloqueo de las tres vías de forma simultánea resultó en un incremento significativamente-injerto supervivencia (Figura 3C). Por otra parte, la terapia metabólica triple era más eficaz que la ciclosporina convencional o rapamicina (Figura 3A y B). No se logró la aceptación permanente, y otras estrategias, incluyendo la terapia de agotamiento, el bloqueo de la coestimulación, o terapias metabólicas nuevas, pueden promover una mejor inducción de tolerancia del trasplante. Sin embargo, el estudio proporcionó dos nuevos conocimientos: el uso de inhibidores no específicos a las células diana inmunes selectivas con el aumento de las demandas metabólicas, así como el requisito de t o bloquear los tres vías metabólicas simultáneamente para obtener la inmunosupresión más robusto en el rechazo del injerto.
inhibidores de la calcineurina y mamíferos objetivo de rapamicina inhibidores (mTOR) constituyen la mayor parte de la terapia inmunosupresora convencional que se utiliza en el trasplante clínico. las tasas de supervivencia de injerto medianas de Balb / c para C57BL 6 trasplantes / piel tratados con ciclosporina y rapamicina fueron 17 y 16 días, respectivamente. En comparación, los receptores tratados con inhibidores metabólicos que inhiben la glicolisis de las células T, la fosforilación oxidativa mitocondrial y metabolismo de la glutamina habían prolongado la supervivencia: la supervivencia del injerto media fue de 29 días. Además, la histología de los injertos de piel del grupo de terapia metabólica exhibió alineación más tejido intacto y menos infiltrado inflamatorio linfocítica (Figura 4).
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Figura 1: Cubiertas del injerto con el vendaje. De injerto (A) de la piel colocada en el tronco derecho. (B) del vendaje hecho con una gasa plegada y dos tiras de vendas de plástico. Ratón (C) Beneficiario colocado en la gasa. (DF) vendaje envuelto alrededor del ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Aspecto de la piel durante el injerto agudo y rechazo crónico. (A) Balb / c para C57BL / 6 (falta de coincidencia completa) trasplante de piel de espesor total y sin evidencia de rechazo (día 8). (B) Balb / c para C57BL / 6 trasplante de piel de espesor completo con un 50% de rechazo del injerto (día 13). (C) Balb / c para el trasplante de piel C57BL 6 / de espesor total con el rechazo del injerto completa (día 18). (D) Singenéico trasplante de piel de espesor total (día 8). El trasplante (E) Singenéico piel de espesor total (día 30). (F) C57BL / 10 a C57BL / 6 (desajuste menor) trasplante de piel de espesor total con el rechazo crónico del injerto (día 100). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Balb / c a ratones C57BL / 6 Skin Graft Survival. (A) El tratamiento con ciclosporina (/ kg una vez al día 25 mg). (B) El tratamiento con rapamicina (/ kg QD 3 mg). (C) El tratamiento con inhibidores metabólicos, 2-desoxi-D-glucosa (2DG) 500mg / kg QD, la metformina 150 mg / kg QD, y 6-diazo-5-oxo-L-norleucina (DON) 1,6 mg / kg QOD. Todos los tratamientos se administraron desde el día del trasplante hasta rechazo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: hematoxilina y eosina (derecha, X100; a la izquierda, X200) de injertos de piel con terapia metabólica en el postoperatorio Día 7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Desde su introducción por Medawar, primero en estudios humanos y luego en conejos y ratones, el trasplante de piel ha sido un modelo inestimable para el estudio de las respuestas inmunes alogénicas 6,7. En este manuscrito, se presenta un modelo de gran escala, no vascularizado, el trasplante de piel de grosor usando de nuevo la piel superior e inferior. Varios métodos alternativos, incluyendo el uso de la piel de la cola o piel de la oreja del ratón como fuente de tejido de injerto, se ha informado hasta la fecha 8,9. Estos modelos presentan la ventaja de la simplicidad técnica y permiten un rendimiento de alto volumen. La deficiencia relativa de las células de Langerhans epidérmicas y células dendríticas dérmicas en los injertos de piel de la cola, sin embargo, conduce al rechazo retardado, así como para la aceptación del injerto facilitado por el huésped, en particular en modelos desajuste MHC menores 10,11. Por lo tanto, el injerto de piel de grosor del tronco se considera un modelo más robusto y más adecuado para estudiar T-Cell-mediaTed rechazo agudo 12.
Además, nuestro modelo emplea técnicas sencillas y no requieren habilidades avanzadas de microcirugía. El tiempo de funcionamiento es corto (~ 10 min por ratón a partir de la aparición de la anestesia para la realización del procedimiento), así como la morbilidad y mortalidad postoperatoria es insignificante. La mortalidad operatoria global (muerte dentro de las 24 horas después de la cirugía, más la muerte antes de la retirada del vendaje) se ha notificado a ser del 3,8% 13. La mayoría de las complicaciones surgen de sobredosis de anestesia o vendajes excesivamente restrictivas, que puede ser fácilmente evitado por una estrecha monitorización de la función respiratoria en el postoperatorio inmediato y por una rápida eliminación de la venda ante los primeros signos de dificultad respiratoria 6,17.
El factor más importante en el proceso de injerto es la revascularización del tejido injertado por el recrecimiento de vasos de acogida para el injerto 6. La piel cosechado requieres cuidadosa preparación, y la disección del panículo carnoso es un paso crítico. Preferimos para eliminar los panículo carnoso con un microscopio. Se recomienda iniciar la disección de uno de los bordes y para avanzar lentamente empujando el músculo y separándolo de la piel con la hoja de un tenotomy curvada en ángulo ligeramente. El sitio de la cama del injerto debe estar lejos de las articulaciones y la columna vertebral. Antes de hacer incisiones en el ratón receptor, el hombro y la cadera se deben mover para visualizar los pliegues de la piel que ayudan a delimitar el nivel de las articulaciones. Al retirar la piel destinatario, es importante para evitar daños en los vasos sanguíneos que se ejecutan superficial a la panículo carnoso. Si se produce una hemorragia, aplicar compresión local y eliminar la sangre y los coágulos que pueden interferir con el injerto. Por último, el vendaje no debe causar dificultades respiratorias que la recuperación compromiso, si bien debe ser suficientemente constrictiva para evitar el desplazamiento del injerto y de auto-muventi- durante el proceso de revascularización. Las tiras de plástico tiritas son adherente y lo suficientemente fuerte para este propósito. Combinamos dos vendajes para envolver completamente la cintura del ratón y para permitir la colocación de una gasa plegada entre el vendaje y el injerto (Figura 1). El vendaje se retira cortando el lado ventral de la misma, y el resto se elimina por el animal, con el fin de no perturbar el injerto al intentar quitar el vendaje de forma manual.
En resumen, el trasplante de piel de espesor total es un modelo bien establecido con abundantes referencias en la literatura. El procedimiento es fácil de realizar, el tiempo de funcionamiento es corta, y las complicaciones postoperatorias son limitadas. Los pasos críticos están relacionados con la cosecha piel del donante meticulosa y la correcta colocación del vendaje destinatario. Los estudios futuros que implican biomateriales que promueven la angiogénesis y la reparación de tejidos pueden mejorar aún más la tasa de éxito del procedimiento.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el NIH subvención R01AI077610.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight micro forceps | Sigma | F4017 | |
| Curved micro forceps | Aesculap | BD333R | |
| Curved Stevens tenotomy scissors | Aesculap | BC905R | |
| Mayo dissecting scissors | Sigma | S3146 | |
| Micro needle holder | Aesculap | BM563R | |
| Sterile gauze | Covidien | 441218 | |
| 6-0 Nylon suture | MWI | 31849 | |
| Plastic Strips Band-Aid | Johnson & Johnson | Obtained from pharmacy | |
| 10 cm Petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| PBS | Quality Biological | 119069131 | |
| Buprenorphine | DEA Number required; Obtained from hospital pharmacy | ||
| Enrofloxacin | Bayer Health Care | 186599 |
References
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