Summary
Hierbij rapporteren we de verschillende fasen die betrokken zijn bij de kennisgebaseerde ontwikkeling van een effectief mycoinsecticide, waaronder de isolatie, identificatie, screening en selectie van de "best fit" entomopathogene schimmel, Metarhizium anisopliae , voor de bestrijding van insectenpest in de landbouw .
Abstract
Een grote zorg bij het ontwikkelen van commerciële mycoinsecticiden is de vermogenssnelheid in vergelijking met die van chemische insecticiden. Daarom zijn isolatie en screening voor de selectie van een snelwerkende, zeer virulente entomopathogene schimmel belangrijke stappen. Entomopathogene schimmels, zoals Metarhizium, Beauveria en Nomurea , die optreden via contact, zijn beter geschikt dan Bacillus thuringiensis of nucleopolyhedrosisvirus (NPV), die door het insectenpest ingeënt moet worden. In het huidige werk hebben we 68 Metarhizium stammen van geïnfecteerde insecten geïsoleerd met behulp van een bodemverdunning en aas methode. De isolaten werden geïdentificeerd door de amplificatie en sequentiebepaling van het ITS1-5.8S-ITS2 en 26S rDNA gebied. De meest virulente stam van Metarhizium anisopliae werd geselecteerd op basis van de mediane dodelijke concentratie (LC 50 ) en de tijd (LT 50 ) verkregen in insecten bioassays tegen III-instar larven van Helicoverpa armigera.De massaproductie van sporen door de geselecteerde stam werd uitgevoerd met vaste-fermentatie (SSF) met gebruikmaking van rijst als substraat gedurende 14 dagen. Sporen werden geëxtraheerd uit de sporulated biomassa onder gebruikmaking van 0,1% tween-80, en verschillende formuleringen van de sporen werden bereid. Veldproeven van de formuleringen voor de controle van een H. armigera- besmetting in duivenwten werden uitgevoerd door gerandomiseerd blokontwerp. De infectie controle niveaus verkregen met olie en waterige formuleringen (respectievelijk 78,0% en 70,9%) waren beter dan de 63,4% verkregen met chemisch pesticide.
Introduction
Van de introductie van organische chloorpesticiden in de jaren 1940 in India, is het gebruik van pesticiden veel vouw 1 toegenomen, met gewaspestjes die jaarlijks miljarden rupees 2 kosten in termen van opbrengstverlies in de landbouwproductie. Het wijdverspreide en niet-oordeelkundige gebruik van synthetische pesticiden is een voortdurende bedreiging voor het milieu en de menselijke gezondheid 1 . Het onoordeelkundige gebruik van pesticiden leidt tot residuen in de bodem en de uitputting van natuurlijke roofdieren. Het dient ook als een krachtige selectie druk om de genetische make-up van een plaagpopulatie te veranderen, wat leidt tot de ontwikkeling van weerstand 1 . Ondanks de enorme voordelen van de groene revolutie, die hoge inputs vereiste, zoals meststoffen en pesticiden, blijven ongedierte een belangrijke biotische beperking. Een algemene schatting van de jaarlijkse gewasverliezen in India en wereldwijd bedraagt USD 12 miljardEf "> 2 en USD 2.000 miljard 3 respectievelijk.
Wanneer chemische bestrijdingsmiddelen schadelijke effecten hebben wanneer ze insectenbestrijdingen bestrijden, wordt het belangrijk om te zoeken naar alternatieve methoden die ecologisch geluid, betrouwbaarheid, economisch en duurzaam zijn. Biologische controle biedt een geschikt alternatief en omvat het gebruik van parasieten, roofdieren en microbiële pathogenen 4 . Zo zijn bijvoorbeeld schimmels een breed scala aan insectenbestrijding, waaronder lepidopteranen, hymenopteranen, coleopteranen en dipteranen, die vaak leiden tot natuurlijke epizootica. Bovendien, in tegenstelling tot andere bacteriële en virale insecten controle middelen, is de werking van insecten pathogene schimmels via contact 5 . Deze schimmels bestaan uit een heterogene groep van meer dan 100 genera, waarbij ongeveer 750 soorten onder verschillende insecten worden gerapporteerd. De belangrijke schimmelpathogenen zijn: Metarhizium sp., Beauveria sp., Nomuraea rileyi, Lecanicillium lecanii en Hirsutella sp., een paar te noemen 6. M. anisopliae (Metchnikoff) Sorokin is de tweede meest gebruikte entomopathogene schimmel bij biocontrole. Het is bekend om meer dan 200 soorten insecten aan te vallen 7 .
In deze studie worden verschillende stadia betrokken bij de kennisgebaseerde ontwikkeling van een mycopesticide met behulp van M. anisopliae gepresenteerd. Dit omvat: 1) de identificatie van een bron ( dwz bodem of mycosed insecten) voor virulente entomopathogenen, 2) entomopathogene identificatie en selectie, 3) strategieën om hun virulente natuur en effectiviteit in het laboratorium bio-analyse en in het veld te handhaven, 4 ) De kosteneffectieve formulering van infectieve propagules, 5) de ontwikkeling van unieke kwaliteitscontroleparameters voor virulente bereiding, en 6) bioprospectie en waardetoevoeging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolatie van Entomopathogene Fungi
- Grondverdunning methode
- Verzamel de bodemmonsters en mycosed insecten uit verschillende gewasvelden ( tabel 1 ). Isolate de entomopathogene schimmels uit bodemmonsters met behulp van de grondverdunningingsplating methode 8 .
Opmerking: In deze studie werden monsters verzameld uit de Pune (18 ° 31'13'N, 73 ° 51'24''E) en Buldhana (19 ° 58'36''N 76 ° 30'30''E ) Districten, Maharashtra, India. - Weeg 10 g van elk bodemmonster en voeg ze afzonderlijk toe aan 90 ml steriele 0,1% (w / v) Tween-80.
- Meng de monsters grondig met behulp van een magnetische roerder gedurende 60 minuten om de sporen vast te houden die aan bodemdeeltjes worden gehecht.
- Na het mengen, verspreid 100- tot 200 μl aliquots van elk monster op selectief medium dat (g / L) bevat: pepton, 10; Glucose, 20; Agar, 18; Streptomycine, 0,6; Tetracycline, 0,05; cycLohexamide, 0,05; En dodine, 0,1 ml; PH 7,0 9 . Incubeer de platen bij 28 ° C gedurende 3-7 dagen.
- Selecteer en subcultuur de individuele sporulerende kolonies op hetzelfde medium om pure culturen te verkrijgen.
- Verzamel de bodemmonsters en mycosed insecten uit verschillende gewasvelden ( tabel 1 ). Isolate de entomopathogene schimmels uit bodemmonsters met behulp van de grondverdunningingsplating methode 8 .
- Van mycosed insecten
- Verzamel de gemaalde insecten uit het veld.
Opmerking: een harde larve lichaam is waarschijnlijk geïnfecteerd met entomopathogene schimmel. Met bacteriële of virale infectie is het dode insectenlichaam zacht. - Verzamel levende insecten met abnormaal gedrag, slechte coördinatie en ruige bewegingen.
- Bewaar de insecten tot de dood en laat ze dan naar vochtige kamers voor verdere mycosis en sporulatie, indien aanwezig, bij 28 ° C en 70-80% RV.
- Streep de sporen van de sporulerende kadavers op het bovengenoemde selectieve medium en verkry pure culturen door verder subculturen 2-3 keer op hetzelfde medium.
- Verzamel de gemaalde insecten uit het veld.
- Aasmethode
- In eenInjectieflacon (3,85 x 6,0 cm) met 60 g bodemmonster, voeg 4 rijstmotlarven ( Corcyra cephalonica ) toe en houd de flacons gedurende een periode van 14 dagen bij 25 ± 2 ° C.
- Draai de flesjes elke dag op zijn kop. Na 14 dagen scherm de bodemmonsters voor de aanwezigheid van gemaalde rijstmotlarven. Isolate de entomopathogene schimmel door streepende sporen uit sporulerende kadavers op selectief medium.
- Na het verkrijgen van zuivere culturen, overdragen de isolaten naar de aartappeldextrose agar (PDA) slang en incuberen bij 28 ° C en 70-80% RH gedurende 7 dagen om sporulatie mogelijk te maken. Volg na sporulatie de moederculturen bij 8 ° C tot gebruik.
2. Identificatie van Entomopathogene Fungi
- Entomopathogene schimmels identificeren door morfologische eigenschappen te observeren ( dwz ongeslaglijke sporengrootte en vorm en de ordening van de sporen op conidioforen); Isolaten van 3 hoofdgenera, Metarhizium , Beauv Eria, en Nomuraea , kunnen worden geïdentificeerd.
- Voor de moleculaire identificatie van Metarhizium stammen, extract het genomisch DNA uit de myceliale biomassa met behulp van een DNA isolatie kit; Volg de instructies van de fabrikant (zie de tabel ). Controleer de kwaliteit van genomisch DNA door elektroforese op een 0,8% agarosegel uit te voeren.
- PCR-amplificeer het ITS1-5.8S-ITS2 en 26S rDNA gebied. Gebruik genomisch DNA als een sjabloon, met ITS1 forward (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) en ITS4 reverse (TCCTCCGCTTATTGATATGC) primers 10 .
- Gel-elueren en zuiveren de amplitonen met een verwachte grootte, met behulp van een gel-extractie kit; Volg de instructies van de fabrikant (zie de tabel ). Kwantificeer het gezuiverde amplicon en de sequentie.
- Lees en bewerk de sequenties met behulp van de software en voer een BLAST-zoekopdracht uit van de nucleotide sequenties in de NCBI GenBank databibliotheek om de close homology te analyseren= "Xref"> 11.
- Plaats de sequenties van geïdentificeerde entamopathogene isolaten in de NCBI GenBank-database om de toetredingsnummers op te halen.
3. Het screenen van Metarhizium Isolates tegen H. Armigera
- Insectopvang
- Bepaal de initiële cultuur van H. armigera door het verzamelen van gezonde larven en poppen van het insect uit het veld.
- Voor het opgroeien, groei de larven individueel in steriele polypropyleenflessen (3,85 x 6,0 cm, 50 ml capaciteit) die stukken okra desinfecteren met 0,5% (v / v) natriumhypochloriet gedurende 10 minuten 12 .
- Verzamel de insecten eieren die tijdens het opvoeden worden gelegd en ze-steriliseren met 0,5% (v / v) natriumhypochloriet.
- Behoud de larven bij 25 ± 2 ° C en 65 ± 5% RH.
- Insect bioassay
Opmerking: Voor de bio bioassay is de productie van sporen,En veldprestaties, werden de eerste subculturen van Metarhizium stammen van mycosed H. armigera larven gebruikt, tenzij anders vermeld.- Voor de bio bioassays gebruikt u III-instarlarven van H. armigera .
- Dip een reeks van 30 larven in triplicaat individueel in een 10 ml spore suspensie van Metarhizium isolaten (1 x 10 7 sporen / ml, tenzij anders vermeld, levensvatbaarheid> 90%) gedurende 5 s.
- Na de behandeling, overbrengen elke larve individueel naar een aparte steriele injectieflacon om kannibalisme te vermijden. Voeg bij elke injectieflacon vochtig Whatmann filterpapier nr. 1 en een stuk desinfecteerde okra toe als voer. Verander het papier en voer op alternatieve dagen.
- Houd de larven bij 25 ± 2 ° C, 65 ± 5% RH en 16: 8 licht: donker gedurende 14 dagen of tot ze doodgaan.
- Breng de dode larven over op steriele Petri-platen die vochtige katoenwatten bevatten en houd ze bij 28 ° C en 70-80% RV gedurende 3-7 dagen om mycelia en sporen te latenVorming over de kadavers.
- Voor een controle, behandel een set van 30 larven in triplicaat met 0,1% (w / v) Tween-80 in steriel gedistilleerd water.
- Doe alle experimenten in triplicaat met behulp van vers bereide sporen suspensies. Verzamel en pool de gegevens over percenten sterfte uit drie experimenten om gemiddelde waarden te krijgen. Bereken de gecorrigeerde percent mortaliteit met behulp van Abbott's formule 13 .
- Voer de experimenten uit via een gerandomiseerde volledige blokontwerp (RCBD), met elke behandeling die een set van 30 larven bevat in drievoud. Gebaseerd op percent mortaliteit tegen H. armigera , selecteert Metarhizium isolaten voor verdere screening van het beste isolaat voor commerciële productie.
- Selecteer de isolaten die> 90% sterfte tonen tegen H. armigera III-instar larven.
Opmerking: hier werden 12 isolaten geselecteerd. - Bepaal de LT 50 van deze isolaten en selecteer de isolaten demBeoordeling van de snelste moord (in minder tijd).
Opmerking: hier werden 5 isolaten geselecteerd uit de 12 meest krachtige isolaten. - Bepaal de LC 50- waarden van de geselecteerde isolaten met behulp van vier verschillende concentraties (dwz 1 × 10 3 , 1 × 10 5 , 1 × 10 7 en 1 × 10 9 sporen / ml) spore suspensie.
- Bepaal de LC 50 van de Metarhizium- isolaten tegen III-instarlarven van H. armigera om de kans op het verschil in de virulentie van isolaten met hoge sterftewaarden te bepalen die onopgemerkt kunnen zijn als alleen een enkele dosis wordt gebruikt.
4. Productie van Sporen van een Metarhizium Isolaat voor Field Performance Studies
- Productie van Metarhizium sporen door SSF
- Voor SSF, berei het inoculum voor door 2 x 10 7 sporen van de Metarhizium isolaten toe te voegen aan200 ml YPG (0,3% gist extract, 0,5% pepton en 1,0% glucose) medium. Incubeer de flesjes bij 28 ° C bij schudden (180 rpm) gedurende 48 uur.
- Voor de massaproductie van sporen door SSF, gebruik rijst als substraat, tenzij anders vermeld.
- Voor SSF, vul autoclaafzakken (type / 14 met een enkele microventief filter van 0,5 μm, 2 kg capaciteit, 64 × 36 cm) met 2 kg rijst. Voeg 1000 ml gedistilleerd water toe aan de rijst in de zakjes en week overnacht 14 . Autoklaaf de zakjes met de geweekte rijst bij 121 ° C gedurende 45 minuten 15 .
- Inoculeer de zakjes met 48-h-oude mycel inoculum (10% inoculum, 200 ml voor 2 kg rijst) en incubeer bij 28 ° C en 70-80% RH gedurende 14 dagen.
- Oog de sporen door vloeibare extractie met 0,1% Tween-80. Voeg hiervoor de inhoud van de zak toe aan 0,1% Tween-80 (3 L per 1 kg rijst), meng het grondig, verdeel de sporen uit de vloeistof door centrifugeren en droog gedurende 2 dagen bij 37 ° C. < / Li>
- Als alternatief droog de tassen die rijst bevatten met de sporen en wat mycelia bij 2 ° C bij 37 ° C om het vochtgehalte (<20%) te verminderen. Oog de sporen met een myco-harvester of vibro-sifter.
- Levensvatbaarheidsstudies
- Bepaal de percentage levensvatbaarheid van de geoogste sporen met behulp van verschillende methoden 15 . Bereid hiervoor de spore suspensies in 0,1% (w / v) Tween-80 en stel de telling aan op 1 × 10 3 sporen / ml.
- Spread suspensions (0.1 mL) op PDA platen in triplicaat en incubeer bij 28 ° C en 70-80% RV gedurende 72 uur.
- Tel de geïsoleerde kolonies handmatig en bepaal de totale levensvatbare telling voor het respectievelijke monster.
- Spore sedimentatie snelheid
- Voor een uniforme dosering is de homogene spore suspensie vereist; Bepaal de sporen sedimentatie tarieven voor Metarhizium isolaten zoals beschreven"Xref"> 16. Controleer de sedimentatiegraden van sporen in 0,2 M ammoniumsulfaat en 0,1% Tween-80.
- Pas de telling van de sporensuspensie tot ~ 7 x 7 10 sporen / ml tot een aanvankelijke absorptie van 0,6 bij 540 nm te verkrijgen. Laat de cuvetten gedurende 6 uur ongehinderd staan om de sporen te regelen.
- Noteer de absorptie gedurende maximaal 6 uur. Druk de sedimentatie in procent uit en bereken de tijd die nodig is voor 50% sedimentatie (ST 50 ). Herhaal het experiment driemaal met behulp van vers bereide sporen suspensies.
5. Veldprestaties Studies van de mogelijkheid van de geselecteerde M. anisopliae Isoleren om H. armigera in Duivenweiden te controleren
- Wettable poederformulering van M. anisopliae M 34412 sporen
- Bereid de 2,5-5% bevochtigde poedervorming door de sporen met talk te mengen.
- Stel de uiteindelijke levensvatbare telling (TVC) in op 1 x 10 12 spoRes per kg formulering.
- Veldprestaties van M. anisopliae M 34412 sporen
- Voor veldprestatie studies van het vermogen van het geselecteerde M. anisopliae isolaat om H. armigera infestatie in duivenwten te regelen, gebruik een RCBD met vier replicaties.
Opmerking: hier uitgevoerd op Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth (MPKV), Rahuri (19.3927 ° N, 74.6488 ° E). - Gebruik twee verschillende spuitformuleringen, een olieformulering van sporen (5 x 10 12 sporen / 3 liter diesel: zonnebloemolie, 7: 3) en een waterige formulering in Tween-80 (0,1%). Spuit de olieformulering met een ultra-lage volume (ULV) spuit (70 min, 3 L / ha) de waterige formulering met een rugsakspuit (5 x 10 12 sporen, 500 L / ha).
Opmerking: Hier werden de larvepopulaties één dag voor de spray en 3 en 7 dagen na de toediening van elke spray opgenomen op 5 willekeurig geselecteerde planten. De totale bevolking was tRansformed naar de vierkantswortel van n + 1 voor de statistische analyse.- Volgens de landbouwpraktijken voor het duivenweefsel, voer de eerste spuiten tussen 10 en 15 d na het leggen van eieren en 2 keer met een interval van 14 dagen. Doe de spuiten tussen 16:00 en 18:00 uur IST. Bewaar de windrichting en gebruik indien nodig doekgordijnen om de sporen van naburige percelen te voorkomen.
- Ter vergelijking, spray de chemische insecticiden met een handcompressie knapsack spuit.
- Bepaal de persistentie van het inoculum in het veld door H. armigera larven 0, 3, 5, 7 en 14 dagen na het spuiten te verzamelen.
- Bewaar deze larven gedurende een periode van 14 dagen en na de dood gedurende een periode van 14 dagen, overbrengen naar een plastic flesje met vochtig filterpapier. Incubeer bij 25 ± 2 ° C en 70 ± 10% RH om mycose te waarnemen.
- Bepaal de persistentie van het inoculum op de larvalpopulatie op basis van de p Stijgende sterftegegevens van de larven die uit het veld zijn verzameld na het spuiten.
- Evalueer de veldstudies op basis van de procentuele werkzaamheid 17 , procent podschade en procentuele opbrengst 18 .
Opmerking: hier worden de data voor de parameters, zoals temperatuur, vochtigheid, windsnelheid (km / h), zonneschijn (h), regenval (mm), regenachtige dagen en verdamping (mm) Landbouwuniversiteit (Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth, Rahuri, 19.3927 ° N, 74.6488 ° E).
- Voor veldprestatie studies van het vermogen van het geselecteerde M. anisopliae isolaat om H. armigera infestatie in duivenwten te regelen, gebruik een RCBD met vier replicaties.
- Boeren deelnemende programma
- Selecteer het aantal boeren voor de demonstratieproeven. Breng de duivenzaadzaden (BSMR - 736) samen met kunstmest aan de boeren.
Opmerking: in deze studie waren er 20 boeren betrokken. Dorp: Deolali Pravara, (19.473 ° N 74.6 ° E). - Gebruik dezelfde sprayformuleringen en aantal sprays zoals in stap 5.2.
- Selecteer het aantal boeren voor de demonstratieproeven. Breng de duivenzaadzaden (BSMR - 736) samen met kunstmest aan de boeren.
- Let op het effect van mycoinsecticide spray, indien aanwezig, op de duivenweefselblaadjes.
- 1 dag na elke behandeling in de onbehandelde percelen en in de percelen die behandeld worden met M. anisopliae, verzamelen de geleiderpotigen en bladbewoners .
- Verzamel de geleedpotigen in de bodem binnen 24 uur na de behandeling en haal de inplantende insecten in de ochtend na het behandelen ( bijv. Ongeveer 15-18 uur na de behandeling) in de ochtend na de behandeling.
- Bewaar ze individueel in cilindrische plastic dozen met een diameter van 3,5 cm en een hoogte van 4,0 cm. Controleer de insecten dagelijks voor infectie en voed ze met geschikt voedsel.
- Noteer de aanwezigheid van M. anisopliae , indien helemaal, en isoleer de paddestoel.
7. Identificatie van kwaliteitscontroleparameters
- Controleer de levensvatbaarheid van de spore door de spore ontkieming op de PDA bij 28 ° te meten; C.
- Maatregel cuticle degraderende enzymactiviteiten, zoals chitinase, chitine-deacetylase, chitosanase, protease en lipase, geproduceerd in de YPG en chitine media, zoals eerder beschreven 15 .
- Bepaal de procentuele sterfte van H. armigera in een laboratorium bioassay 15 .
- Gebruik moleculaire markers, zoals een PCR-RFLP patroon van chitinases ( Chit 1 , 2 en 4 ) en protease ( Pr1A ) genen, als virulentie attributen voor M. anisopliae .
- Extract het genomische DNA uit de mycelia biomassa met behulp van een DNA isolatie kit 15 . PCR-amplificeer de Chit1- en Chit2- genfragmenten met behulp van genomisch DNA als template, met primerparen Chit1F / Chit1R (CTCTGCAGGCCACTCTCGGT / AGCCATCTGCTTCCTCATAT) en Chit2F / Chit2R (GACAAGCACCCGGAGCGC / GCCTTGCTTGACACATTGGTAA). Voor Chit4 , gebruik het primerpaarje Chit4F / Chit4R (ATCCGGCAGCACGGCTAC / CTTGGATC CGTCCCAGTTG).
- Voor de amplificatie van het Pr1A-gen, gebruik het METPR2- en METPR5-primerpaar (AGGTAGGCAGCCAGACCGGC / TGCCACTATTGGCCGGCGCG).
- Voer de restrictie vertering 19 van het Chit1 gen met BsaJI , BstUI en ScrFI ; Van het Chit2 gen met AluI , HpyCH4IV en HpyCH4V en van het Chit4 gen met BstUI , HaeIII en MboI . Voor de digestie van de Pr1A gen gebruikt RsaI, DdeI en Mspl 20.
- Houd rekening met het limietfragmentlengte polymorfisme (RFLP) patroon op 1,5% agarosegel door elektroforese voor elk gen voor de meeste virulente stammen (> 90% mortaliteit); Dit kan gebruikt worden als een virulentie marker voor de selectie van M. anisopliae .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tijdens het onderzoek werden verschillende stammen van Metarhizium, Beauveria en Nomuraea geïsoleerd door verschillende isolatiemethoden (data niet getoond) 6 , 14 Aangezien Metarhizium- stammen effectiever waren bij het beheersen van H. armigera , een vreselijke plaag in pulsen 6 , 14 , Werden verdere isolaties gericht op het isoleren van Metarhizium stammen uit verschillende gewasvelden en insecten ( Tabel 1 ). Het totaal van 68 Metarhizium isolaten verkregen werden geïdentificeerd door culturele en morfologische eigenschappen en door ITS 1-5,8S-ITS 4 sequencing. Op basis van de> 90% sterfte van H. armigera in laboratorium bioassays werden 12 Metarhizium isolaten verder getest op spore productie, levensvatbaarheid, LC 50 , LT 50 en ST 50 . Tabel 2 beschrijft de gegevensVoor 3 mogelijke isolaten, M34311, M34412 en M81123; M34412 bleek het best presterende isolaat te zijn.
Onder de geteste substraten, zoals rijst, sorghum, maïs en tarwe, ondersteund rijst de maximale sporulatie bij Metarhizium- isolaten (60-75 g sporen / kg, 4-4,4 x 10 10 sporen / g sporenpoeder) .
Tijdens de veldproef voor de controle van H. armigera in duivenwten werden 78,0% en 70,9% werkzaamheden verkregen met respectievelijk de M. anisopliae M34412 olie en waterige formuleringen . De peulbeschadiging in M. anisopliae- behandelde percelen bleek minder (8,76%) te zijn dan in de onbehandelde controle plots (23,63%) en de chemisch behandelde plots (10,24%). De gemiddelde opbrengst (q / ha) in de onbehandelde controle was 7,31 q / ha, wat minder was dan na M. anisopliae M34412 behandeling (14,04 q / ha). Behandeling met chemische stof gaf een opbrengst van 12,78 q / ha ( tabel 3 ).
De waarnemingen die zijn geconstateerd voor fytotoxiciteitsymptomen bleek dat geen behandelingen een fytotoxisch effect op het duivenweefsel vertoonden na 3 sprays van M. anisopliae formulering. Van de 57 verzamelde geleedpotigen (veldkrekels en spinnen) werden niemand geïnfecteerd. Uit 590 verzamelde baldakende bewoners bevonden twee personen van de orde Heteroptera (= 0,3% van de verzamelde geleedpotigen) geïnfecteerd met M. anisopliae ( tabel 4 ). Noch spinnen of coccinelliden zwommen naar de schimmel.
| Bodem (58 isolaten) | ||
| Isolate No. | Gewas | Aantal isolaten |
| M1311, M1322, M1333, M2104, M2305, M2416, M2427, M2508, M42014, M45115, M45216, M45317, M79120, M79221, M79322 | Tomaat | 15 |
| M3419, M34210, M34311, M34412, M34513, M171264 | Custard Appel | 6 |
| M81123, M91124, M91225, M91326, M91528, M91427, M91629, M91730, M91831, M91932, M111145 | Suikerstok | 11 |
| M101133, M101234, M101335, M101436, M101537, M101638, M101739, M101840, M101941, M102042, M102143, M102244 | brinjal | 12 |
| M51118, M51219 | okra | 2 |
| M131150, M141151, M141252, M151153 | Duif Erwt | 4 |
| M121146, M121247, M121348, M121449 | kikkererwten | 4 |
| M183365 | Katoen | 1 |
| M193166 | Jawar | 1 |
| Insect host (10 isolaten) | ||
| M16255, M16356, M16457, M16558, M16659 | Duif-vette snijworm | 5 |
| M16154, M16760 | Suikerriet-Mielige Insect | 2 |
| M16861 | Suikerriet-witte grub | 1 |
| M16962 | Suikerriet-kever | 1 |
| M161063 | Suikerriet-Pyrilla perpussila | 1 |
Tabel 1. Herkomst van Metarhizium stammen. De 68 Metarhizium stammen werden geïsoleerd uit verschillende gewasvelden (58 stammen) en mycosed insecten uit de gewasvelden (10 stammen).
| Isoleren | Opbrengst (g / kg rijst) | Levensvatbaarheid (%) | LC 50 (x 103 sporen / ml) | LT 50 (dagen) | Sterfte (%) | |
| Gemiddelde ± SD | Gemiddelde ± SD | (Fiducial Limit) | (Fiducial Limit) | (Fiducial Limit) | ||
| M34311 | 60.00 ± 2.64a | 92.00 ± 2.64a | 2,47 (2,26-2,69) | 2 (0,4-10,3) | 3,5 (3,2-3,7) | 96.67 |
| M34412 | 67.00 ± 3.46b | 97.00 ± 1.73a | 2,3 (2,11-2,52) | 1,4 (0,1-1,9) | 3,3 (3,0-3,6) | 96.67 |
| M81123 | 75.00 ± 3.60c | 93.00 ± 1.73a | 2,65 (2,43-2,90) | 5,7 (1,2-26,7) | 3,3 (3,1-3,6) | 95,56 |
| Nummers gevolgd door dezelfde letter binnen de kolom zijn niet statistisch verschillend. | ||||||
| ST 50 , tijd nodig voor sedimentatie van 50% sporen in 0,1% (w / v) Tween 80. | ||||||
| Nummers gevolgd door dezelfde letter binnen de kolom zijn niet statistisch verschillend. SD, standaardafwijking. T80, Tween 80 (0,1%, w / v). | ||||||
| LC 50 , de gemiddelde dodelijke concentratie van sporen, berekend om na 14 dagen 50% sterfte van H. armigera te veroorzaken. | ||||||
| LT 50 , de gemiddelde dodelijke tijd van sporen berekend om 50% sterfte van H. armigera te veroorzaken . | ||||||
Tabel 2. Selectie van drie best presterende Metarhizium isolaten. H. armigera 3e -instar larven.
| Veldproef $ | ||
| Behandeling | % Werkzaamheid* | Opbrengst (q / ha) |
| Waterige M. anisopliae M34412 (5x10 12 sporen / ha) 500L | 70,93 ± 4,19 | 14.04 |
| Olieformulering ( M. anisopliae ) (5x10 12 sporen / ha) 3 L | 78,02 ± 4,61 | 15.53 |
| Chemisch bestrijdingsmiddel / Boerenpraktijk (2ml / L, 500 L / ha) | 63,43 ± 0,85 | 12.78 |
| Onbehandelde controle | - | 7.31 |
| Demonstratieproces in (boeren deelnemende programma) $$ | ||
| Behandeling | % Pod schade | Opbrengst (q / ha) |
| Waterige formulering ( M. anisopliae ); Oppervlakte 4,2 ha | 15,9 ± 1,26 | 10.75 |
| Olieformulering ( M. anisopliae ); Gebied 0,4 ha | 17.74 | 12.5 |
| Boerenoefening; Gebied 11ha | 22,72 ± 3,37 | 7.55 |
| Besproeiend gewas | ||
| $ Randomized Block Design | ||
| * Na Henderson en Tilton (1955) | ||
| # HaNPV, H. armigera nucleopolyhedrovirus | ||
| $$ NUmber van boeren betrokken bij de demonstratieproeven waren 20. De duivenzaadzaden (BSMR - 736) werden geleverd met meststoffen aan de boeren. Dorp: Deolali Pravara, Tal. Rahuri. Dist. A'Nagar (MS) (19.473 ° N 74.6 ° E) | ||
Tabel 3. Veldprestatie van de M. anosopliae (M34412) stam tegen H. armigera . De werkzaamheden van verschillende formuleringen van M. anisopiae werden vergeleken met chemische bestrijdingsmiddelen behandelingen tegen H. armigera infestatie in duivenwten onder veldomstandigheden.
| Parameter | Veld 1 | Veld 2 | Veld 3 |
| Plot grootte (m) | 12 x 17 | 10 x 10 | 10 x 15 |
| herhalingen | 2 | 2 | 2 |
| # Loodgieters van valkuilvallen getest | 20 | 22 | 15 |
| % Geïnfecteerd met M. anisopliae (valkuilvallen) | ND | ND | ND |
| # Loodgieters uit de netto-collectie getest | 193 | 171 | 226 |
| % Geïnfecteerd met M. anisopliae (verzamelnet collectie) | ND | ND | 0.9 |
| ND, Niet gedetecteerd Veld 1, Landbouwkollege, Pune; Gebied 2, NGO 1, Tulapur, Pune; Veld 3, NGO 2, Aalandi, Pune. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tijdens de 1880's werd de eerste poging gedaan om Metarhizium te gebruiken om de scarabeker , Anisoplia austriaca, en de suikerbietcurculio, Cleonis punctiventris 21 , te beheersen . In dit protocol was een van de voor- waarden om een virulente stam te isoleren, van de grond of van geïnfecteerde insecten. Inderdaad hebben andere parameters, zoals LC 50 , LT 50 en ST 50 , aanzienlijk bijgedragen aan de kosteneffectiviteit van het product 22 , 23 . Voor de optimalisatie van de sporeproductie bleef een gevoelig evenwicht tussen het aantal sporen, levensvatbaarheid en virulentie 24 .
Aangezien de landbouw een product met een hoge volumekosten is, zijn de kwaliteitskenmerken, de aanvaardbaarheid door eindgebruikers en de houdbaarheid van sporen de belangrijkste zorgen. Gastspecificiteit is voordelig om niet-target effecten te vermijden= "Xref"> 14. Het vermijden van herhaalde subculturen op kunstmatig medium en de incidentele doorgang door de insectengas behouden de virulentie en effectiviteit van de Metarhiziumsporen in het veld 22 . De gepresenteerde aanpak heeft beperkingen: de bereiding is effectiever wanneer het economische drempelniveau ~ 2-3 larven per plant is en de spore ontkieming maximaal in aanwezigheid van hoge vochtigheid en relatief lage temperaturen is.
Hier is de schimmelpreparatie effectief na contact, terwijl bacteriële (Bt) en virale preparaten (-HaNPV) alleen effectief zijn wanneer ze worden verteerd. Wat betreft kwaliteitscontroleparameters, is naast de levensvatbaarheid van de sporen voor het eerst aangetoond dat biochemische en moleculaire markers gebaseerd op cuticle-degraderende enzymactiviteiten en specifieke restrictieverdelingspatronen van dezelfde enzymgenen de effectiviteit kunnen waarborgen in het veld. De kwaliteit-contrDe voorgestelde parameters zijn: a) de levensvatbaarheid van de spore, gemeten als spore-ontkieming (moet> 90% zijn op PDA na 16 uur bij 28 ° C en 70-80% RV); (b) het percentage mortaliteit van H. armigera (moet> 90%, met 1 x 10 7 sporen in het laboratorium biologische bepaling); (C) de chitinase activiteit in het chitine medium na 72 uur (moet> 3,5 x 10 -3 U / ml) zijn; En (d) het PCR-RFLP patroon van chitinase genen. Dit manuscript heeft in hoofdzaak de protocollen beschreven, van de isolatie van een entomopathogene schimmel naar de opwekking van effectiviteitsgegevens tegen het doelpest in het veld. Dit is een van de vereisten om elke biopesticide formulering te registreren bij de Central Insecticide Board of India en uiteindelijk voor commercialisering.
De hier beschreven reeks experimenten zullen nuttig zijn voor de ontwikkeling van een mogelijke mycoinsecticide. Daarnaast kan, na de extractie van de sporen, de afvalmieliale biomassa worden gebruiktPlantengroeibevordering of voor het isoleren van chitosan- of glucosaminepolymeren voor gezondheidszorgtoepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de bijdrage van medewerkers van het programma Biomedische Biologie (ISCB) van het Departement Biotechnologie, New Delhi en het Zwitserse Agentschap voor Ontwikkeling en Samenwerking, Berne, Zwitserland. De bijdragen van projectstudenten en medewerkers betrokken bij de ontwikkeling van het mycoinsecticide, waaronder Vandana Ghormade, Pallavi Nahar, Priya Yadav, Shuklangi Kulkarni, Manisha Kapoor, Santosh Chavan, Ravindra Vidhate, Shamala Mane en Abhijeet Lande, worden erkend. EKP en SGT bedanken de universitaire subsidiecommissie, India en de Raad van Wetenschappelijk en Industrieel Onderzoek (CSIR), India, respectievelijk voor onderzoeksbeurzen. MVD erkent de steun van de Raad van Industrieel en Wetenschappelijk Onderzoek, New Delhi voor het Emeritus Scientist Scheme. De auteurs zijn dankbaar aan de afdeling Biotechnologie, New Delhi, India voor de financiële ondersteuning onder de ISCB en SBIRI programma's. Wij zijn dankbaar voorBeoordelaars voor hun input.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Hi-Media | RM666 | Reagent |
| Ammonium sulphate | Thomas Baker | 11645 | Reagent |
| DNA analyzer | Applied biosystem | ABI prism 3730 | Instrument |
| DNA islation kit | Qiagen | 69104 | Reagent |
| Dodine | Sigma | 45466 | Reagent |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28604 | Reagent |
| Glucose | Hi-Media | GRM077 | Reagent |
| Knapsac sparyer | Kaypee | HY-16L (1004) | Instrument |
| Peptone | Hi-Media | RM006-500G | Reagent |
| Polypropylene vials | Laxbro | SV-50 | Plasticware |
| Potato dextrose agar (PDA) | Hi-Media | M096-500G | Reagent |
| Tween-80 | SRL | 28940 | Reagent |
| Ultra low volume sparyer | Matabi | INSECDISK | Instrument |
| Unicorn-bags | Unicorn | UP-140024-SMB | Autoclavalbe bag for SSF |
| Yeast extract | Hi-Media | RM027-500G | Reagent |
| Chromas 2.1 | software |
References
- Aktar, M. W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
- Dhaliwal, G. S., Jindal, V., Mohindru, B. Crop losses due to insect pests: Global and Indian scenario. Indian J Entomol. 77 (2), 165-168 (2015).
- Popp, J., Peto, K., Nagy, J. Pesticide productivity and food security. A review. Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2015).
- van Lenteren, J. C., Manzaroli, G. Evaluation and use of predators and parasitoids for biological control of pests in greenhouses. Integrated pest and disease management in greenhouse crops. Albajes, R., Gullino, M. L., van Lenteren, J. C., Elad, Y. , Kluwer. Dordrecht, The Netherlands. 183-201 (1999).
- Charnley, A. K., Collins, S. A. Entomopathogenic fungi and their role in pest control. The Mycota IV: Environmental and Microbial Relationships. Kubicek, C. P., Druzhinina, I. S. , 2nd, Springer-Verlag. Berlin. 159-187 (2007).
- Deshpande, M. V., et al. Comparative evaluation of indigenous fungal isolates, Metarhizium anisopliae M34412, Beauveria bassiana B3301 and Nomuraea rileyi N812 for the control of Helicoverpa armigera (Hüb.) on pulses. Proceeding of the international workshop on entomopathogenic fungi - a valuable alternative to fight against insect pests. MV, D. eshpande , National Chemical Laboratory. Pune, India. 51-59 (2004).
- Roberts, D. W., Hajek, A. E. Entomopathogenic fungi as bioinsecticides. Frontiers in industrial mycology. Leathan, G. F. , Chapman & Hall. New York, NY. 144-159 (1992).
- Goettel, M., Inglis, G. D. Fungi: Hyphomycetes. Manual of techniques in insect pathology. Lacey, L. A. , Academic Press. USA. 213-245 (1996).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J., et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR-Protocols: A guide to methods and applications. Innis, M. A., et al. , Academic Press, Inc. San Diego. USA. 315-322 (1990).
- Basic Local Alignment Search Tool. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST (2017).
- Ignoffo, C. M., Futtler, B., Marston, N. L., Hostetter, D. L., Dickerson, W. A. Seasonal incidence of the entomopathogenic fungus Spicaria rileyi associated with noctuid pests of soybeans. J Invertebr Pathol. 25 (1), 135-137 (1975).
- Abbott, W. S. A method for computing the effectiveness of an insecticide. J Econ Entomol. 18 (2), 265-267 (1925).
- Nahar, P. Development of biocontrol agents for the control of pests in agriculture using chitin metabolism as target. , PhD thesis submitted to Department of Microbiology, University of Pune 137 (2004).
- Kulkarni, S. A., et al. Comparison of Metarhizium isolates for biocontrol of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) in chickpea. Biocontrol Sci Tech. 18 (8), 809-828 (2008).
- Jeffs, L. B., Khachatourians, G. G. Estimation of spore hydrophobicity for members of the genera Beauveria, Metarhizium, and Tolypocladium by salt-mediated aggregation and sedimentation. Can J Microbiol. 43 (1), 23-28 (1997).
- Henderson, C. F., Tilton, E. W. Tests with acaricides against the brow wheat mite. J Econ Entomol. 48 (2), 157-161 (1955).
- Hassani, M. Development and proving of biocontrol methods based on Bacillus thuringiensis and entamopathogenic fungi against the cotton pests Spodoptera littoralis, Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) and Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae). , PhD thesis submitted to Justus-Liebig-University Giessen, Germany (2000).
- Enkerli, J., Ghormade, V., Oulevey, C., Widmer, F. PCR-RFLP analysis of chitinase genes enable efficient genotyping of Metarhizium anisopliae var. anisopliae. J Invert Pathol. 102 (2), 185-188 (2009).
- Bidochka, M. J., Melzer, M. J. Genetic polymorphism in three subtilisin-like protease isoforms (Pr1A, Pr1B and Pr1C) from Metarhizium strains. Can. J. Microbiol. 46 (12), 1138-1144 (2000).
- McCoy, C. W., Samson, R. A., Boucias, D. G. Entomogenous fungi. Handbook of natural pesticides, Microbial insecticides, Part A. Entomogenous protozoa and fungi. Ignoffo, C. M., Mandava, N. B. , CRC Press. Boca Raton, FL. 151-236 (1988).
- Nahar, P. B., et al. Effect of repeated in vitro sub-culturing on the virulence of Metarhizium anisopliae against Helicoverpa armigera (Lepidoptera Noctuidae). Biocontrol Sci Tech. 18 (4), 337-355 (2008).
- Kapoor, M., Deshpande, M. V. Development of mycoinsecticide for the control of insect pests: Issues and challenges in transfer of technology from laboratory to field. Kavaka. 40, 45-56 (2013).
- Deshpande, M. V. Mycopesticide Production by Fermentation: Potential and Challenges. Crit Rev Microbiol. 25 (3), 229-243 (1999).
