Summary
Aquí se presentan las diferentes etapas del desarrollo basado en el conocimiento de un micoinsecticida eficaz, incluyendo el aislamiento, la identificación, el cribado y la selección del hongo entomopatógeno "mejor ajustado", Metarhizium anisopliae , para el control de plagas de insectos en la agricultura .
Abstract
Una preocupación importante cuando se desarrollan los micoinsecticidas comerciales es la velocidad de matanza comparada con la de los insecticidas químicos. Por lo tanto, el aislamiento y el cribado para la selección de un hongo entomopatógeno altamente virulento de acción rápida son pasos importantes. Los hongos entomopatógenos, como Metarhizium, Beauveria y Nomurea , que actúan por contacto, son más adecuados que el Bacillus thuringiensis o el virus de la nucleopoliedrosis (NPV), que debe ser ingerido por la plaga de insectos. En el presente trabajo, se aislaron 68 cepas de Metarhizium de insectos infectados utilizando un método de dilución y cebo. Los aislados fueron identificados por la amplificación y secuenciación de la ITS1-5.8S-ITS2 y 26S rDNA región. La cepa más virulenta de Metarhizium anisopliae se seleccionó en base a la concentración letal media (LC 50 ) y el tiempo (LT 50 ) obtenido en bioensayos de insectos contra larvas de larvas de III-instar de Helicoverpa armigera.La producción en masa de esporas por la cepa seleccionada se llevó a cabo con fermentación en estado sólido (SSF) utilizando arroz como sustrato durante 14 días. Se extrajeron esporas de la biomasa esporulada utilizando tween-80 al 0,1%, y se prepararon diferentes formulaciones de las esporas. Los ensayos de campo de las formulaciones para el control de una infestación por H. armigera en garbanzos se realizaron mediante diseño de bloques al azar. Los niveles de control de infestación obtenidos con formulaciones oleosas y acuosas (78,0% y 70,9%, respectivamente) fueron mejores que el 63,4% obtenido con pesticida químico.
Introduction
Desde la introducción de los plaguicidas organoclorados en la década de 1940 en la India, el uso de plaguicidas ha aumentado muchas veces 1 , con plagas de cultivos que todavía cuestan billones de rupias 2 anualmente en términos de pérdida de rendimiento en la producción agrícola. El uso generalizado y no juicioso de plaguicidas sintéticos es una amenaza continua para el medio ambiente y la salud humana 1 . El uso indiscriminado de plaguicidas produce residuos en el suelo y el agotamiento de los depredadores naturales de plagas. También sirve como una potente presión de selección para alterar la composición genética de una población de plagas, lo que lleva al desarrollo de resistencia 1 . A pesar de los enormes beneficios de la revolución verde, que requiere insumos altos, como fertilizantes y pesticidas, las plagas siguen siendo una importante restricción biótica. Una estimación general de las pérdidas anuales de cultivos registradas en la India y en todo el mundo es de USD 12.000 millonesEf "> 2 y 2.000 millones de dólares 3 , respectivamente.
Cuando los plaguicidas químicos tienen efectos perjudiciales cuando se usan para controlar plagas de insectos, se hace imprescindible buscar métodos alternativos que sean ecológicamente sanos, confiables, económicos y sostenibles. El control biológico ofrece una alternativa adecuada e incluye el uso de parásitos, depredadores y patógenos microbianos 4 . Los hongos, por ejemplo, son conocidos por infectar una amplia gama de plagas de insectos, incluyendo lepidópteros, himenópteros, coleópteros y dipteranos, resultando a menudo en epizootias naturales. Además, a diferencia de otros agentes de control de insectos bacterianos y virales, el modo de acción de hongos patógenos de insectos es por contacto 5 . Estos hongos comprenden un grupo heterogéneo de más de 100 géneros, con aproximadamente 750 especies reportadas entre diferentes insectos. Los patógenos fungosos más importantes son: Metarhizium sp., Beauveria sP., Nomuraea rileyi , Lecanicillium lecanii y Hirsutella sp., Por nombrar algunos 6 . M. anisopliae (Metchnikoff) Sorokin es el segundo hongo entomopatógeno más utilizado en biocontrol. Se sabe que ataca a más de 200 especies de insectos [ 7] .
En este estudio, se presentan diferentes etapas involucradas en el desarrollo basado en el conocimiento de un mycopesticide usando M. anisopliae . 2) identificación y selección de entomopatógenos, 3) estrategias para mantener su naturaleza virulenta y su efectividad en el bioensayo de laboratorio y en el campo, 4) identificación de una fuente ( es decir, insectos micosos o de suelo) para entomopatógenos virulentos; ) La formulación rentable de propágulos infecciosos, 5) el desarrollo de parámetros únicos de control de calidad para la preparación virulenta, y 6) la bioprospección y la adición de valor.
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Protocol
1. Aislamiento de hongos entomopatogénicos
- Método de dilución del suelo
- Recoger las muestras de suelo y los insectos micosos de diferentes cultivos ( Tabla 1 ). Aislar los hongos entomopatógenos de las muestras de suelo utilizando el método de placas de dilución del suelo 8 .
Nota: En este estudio se recogieron muestras de Pune (18 ° 31'13''N, 73 ° 51'24''E) y Buldhana (19 ° 58'36''N 76 ° 30'30''E ) Distritos, Maharashtra, India. - Pesar 10 g de cada muestra de suelo y agregarlos por separado a 90 ml de Tween-80 estéril 0,1% (p / v).
- Mezclar bien las muestras usando un agitador magnético durante 60 minutos para liberar las esporas adheridas a las partículas del suelo.
- Después de mezclar, diseminar alícuotas de 100 a 200 μL de cada muestra sobre medio selectivo que contiene (g / L): peptona, 10; Glucosa, 20; Agar, 18; Estreptomicina, 0,6; Tetraciclina, 0,05; CycLohexamida, 0,05; Y dodina, 0,1 ml; PH 7,0 9 . Incubar las placas a 28 ° C durante 3-7 días.
- Seleccionar y subcultivar las colonias individuales de esporulación en el mismo medio para obtener cultivos puros.
- Recoger las muestras de suelo y los insectos micosos de diferentes cultivos ( Tabla 1 ). Aislar los hongos entomopatógenos de las muestras de suelo utilizando el método de placas de dilución del suelo 8 .
- De los insectos micosos
- Recoger los insectos mycosed del campo.
Nota: Es probable que un cuerpo larval duro esté infectado con hongo entomopatógeno. Con infección bacteriana o viral, el cuerpo de insecto muerto es suave. - Recoger insectos vivos con comportamiento anormal, coordinación pobre, y movimientos espasmódicos.
- Mantener los insectos hasta la muerte y luego transferirlos a cámaras húmedas para detectar micosis y esporulación, si las hay, a 28 ° C y 70-80% de HR.
- Raspar las esporas de los cadáveres esporulados en el medio selectivo mencionado anteriormente y obtener cultivos puros por subcultivo adicional 2-3 veces en el mismo medio.
- Recoger los insectos mycosed del campo.
- Método del cebo
- En un(3,85 x 6,0 cm) que contenga 60 g de muestra de suelo, agregue 4 larvas de polilla de arroz ( Corcyra cephalonica ) y guarde los viales a 25 ± 2 ° C durante un período de 14 días.
- Coloque los viales al revés todos los días. Después de 14 días, revise las muestras de suelo para determinar la presencia de larvas de polilla de arroz micóticas. Aislar el hongo entomopatogénico por rayas de esporas de cadáveres esporulados en medio selectivo.
- Después de obtener cultivos puros, transferir los aislamientos a agar de dextrosa de patata (PDA) e incubar a 28 ° C y 70-80% HR durante 7 días para permitir la esporulación. Después de la esporulación, mantener los cultivos madre a 8 ° C hasta su uso.
2. Identificación de los hongos entomopatógenos
- Identificar hongos entomopatógenos mediante la observación de características morfológicas ( es decir, tamaño y forma de esporas asexuales y la disposición de las esporas en conidióforos); Aislados de 3 géneros principales, Metarhizium , Beauv Eria y Nomuraea .
- Para la identificación molecular de cepas de Metarhizium , extraer el ADN genómico de la biomasa micelial utilizando un kit de aislamiento de ADN; Siga las instrucciones del fabricante (vea la Tabla de Materiales ). Compruebe la calidad del ADN genómico realizando la electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%.
- PCR-amplificar el ITS1-5.8S-ITS2 y 26S rDNA región. Utilizar ADN genómico como una plantilla, con ITS1 adelante (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) y ITS4 inversa (TCCTCCGCTTATTGATATGC) cebadores [ 10] .
- Gel-eluir y purificar los amplicones de tamaño esperado usando un kit de extracción de gel; Siga las instrucciones del fabricante (vea la Tabla de Materiales ). Cuantificar el amplicón y la secuencia purificados.
- Leer y editar las secuencias utilizando el software y realizar una búsqueda BLAST de las secuencias de nucleótidos en el NCBI GenBank biblioteca de datos para analizar la estrecha homología= "Xref"> 11.
- Depositar las secuencias de aislados entamopatógenos identificados a la base de datos NCBI GenBank para recuperar los números de acceso.
3. Detección de aislados de Metarhizium contra H. armigera
- Crianza de insectos
- Establecer la cultura inicial de H. armigera recolectando larvas saludables y pupas del insecto del campo.
- Para la cría, cultivar las larvas individualmente en viales de polipropileno estériles (3,85 x 6,0 cm, capacidad de 50 ml) que contienen trozos de okra desinfectados con hipoclorito de sodio al 0,5% (v / v) durante 10 min 12 .
- Recoger los huevos de los insectos depositados durante la cría y esterilizarlos en la superficie con hipoclorito de sodio al 0,5% (v / v).
- Mantener las larvas a 25 ± 2 ° C y 65 ± 5% de HR.
- Bioensayo de insectos
Nota: Para el bioensayo de insectos, la producción de esporas,Y los estudios de rendimiento de campo, se utilizaron las primeras subculturas de cepas de Metarhizium de larvas de H. armigera de micosis, a menos que se indique lo contrario.- Para los bioensayos de insectos, use larvas de III-instar de H. armigera .
- Sumerja un conjunto de 30 larvas por triplicado individualmente en una suspensión de esporas de 10 ml de aislados de Metarhizium (1 x 10 7 esporas / ml, a menos que se indique lo contrario, viabilidad> 90%) durante 5 s.
- Después del tratamiento, transfiera cada larva individualmente a un vial estéril separado para evitar el canibalismo. A cada vial, agregue el papel de filtro Whatmann húmedo No. 1 y un trozo de okra desinfectado como pienso. Cambie el papel y el alimento en días alternos.
- Mantenga las larvas a 25 ± 2 ° C, 65 ± 5% de HR y 16: 8 de luz: oscuras durante 14 días o hasta que mueran.
- Transferir las larvas muertas a placas de Petri estériles que contengan hisopos de algodón húmedo y mantenerlos a 28 ° C y 70-80% de HR durante 3-7 días para permitir que los micelios y las esporasFormación sobre los cadáveres.
- Para un control, se trata un conjunto de 30 larvas por triplicado con Tween-80 al 0,1% (p / v) en agua destilada estéril.
- Realizar todo el experimento por triplicado utilizando suspensiones de esporas recién preparadas. Recopilar y reunir los datos sobre el porcentaje de mortalidad de tres experimentos para obtener valores promedio. Calcular el porcentaje de mortalidad corregida utilizando la fórmula 13 de Abbott.
- Realizar los experimentos utilizando un diseño de bloques completos al azar (RCBD), con cada tratamiento que contiene un conjunto de 30 larvas por triplicado. Sobre la base del porcentaje de mortalidad frente a H. armigera , seleccione los aislados de Metarhizium para el cribado adicional del mejor aislado para la producción comercial.
- Seleccione los aislamientos que demuestren una mortalidad> 90% frente a las larvas de H. armigera III-instar.
Nota: Aquí se seleccionaron 12 aislamientos. - Determinar el LT 50 de estos aislados y seleccionar los aislamientos demonstCalificando el asesinato más rápido (en menos tiempo).
Nota: Aquí se seleccionaron 5 aislamientos de los 12 aislamientos más potentes. - Determinar los valores de LC 50 del seleccionado aislados utilizando cuatro concentraciones diferentes (es decir, 1 × 10 3, 1 × 10 5, 1 × 10 7, y 1 × 10 9 esporas / ml) de suspensión de esporas.
- Determinar la CL 50 de los aislamientos de Metarhizium frente a las larvas de H. armigera de fase III para aumentar la posibilidad de identificar la diferencia en la virulencia de los aislados con altos valores de mortalidad que pudieran pasar desapercibidos si se utilizaba solo una dosis.
4. Producción de esporas de un aislante de Metarhizium para estudios de rendimiento en el campo
- Producción de esporas de Metarhizium por SSF
- Para SSF, preparar el inóculo añadiendo 2 x 10 7 esporas de los aislados de Metarhizium a200 ml de medio de YPG (0,3% de extracto de levadura, 0,5% de peptona y 1,0% de glucosa). Incubar los frascos a 28 ° C con agitación (180 rpm) durante 48 h.
- Para la producción en masa de esporas por SSF, use el arroz como sustrato a menos que se indique lo contrario.
- Para el SSF, llenar las bolsas de autoclave (tipo / 14 con un solo filtro microvendido de 0,5 μm, 2 kg de capacidad, 64 × 36 cm) con 2 kg de arroz. Agregue 1000 mL de agua destilada al arroz en las bolsas y remoje durante la noche 14 . Autoclave las bolsas con el arroz empapado a 121 ° C durante 45 min 15 .
- Inocular las bolsas con inoculo micelial de 48 h (inóculo al 10%, 200 ml para 2 kg de arroz) e incubar a 28 ° C y 70-80% HR durante 14 días.
- Cosecha de las esporas por extracción líquida con Tween-80 al 0,1%. Para ello, añadir el contenido de la bolsa a Tween-80 al 0,1% (3 L por cada 1 kg de arroz), mezclar bien, separar las esporas del líquido por centrifugación y secar a 37 ° C durante 2 días < Li
- Alternativamente, se secan las bolsas que contienen arroz con las esporas y algunos micelios a 37 ° C durante 2 días para reducir el contenido de humedad (<20%). Cosecha de las esporas con un myco-harvester o vibro-sifter.
- Estudios de viabilidad
- Determinar el porcentaje de viabilidad de las esporas cosechadas utilizando diferentes métodos 15 . Para ello, preparar las suspensiones de esporas en Tween-80 al 0,1% (p / v) y ajustar el recuento a 1 × 10 3 esporas / ml.
- Se separan las suspensiones de esporas (0,1 ml) en placas de PDA por triplicado e incuban a 28ºC y 70-80% de HR durante 72 h.
- Contar manualmente las colonias aisladas y determinar el recuento total viable para la muestra respectiva.
- Tasa de sedimentación de esporas
- Para una dosis uniforme, se requiere la suspensión homogénea de esporas; Determinar las tasas de sedimentación de esporas de los aislados de Metarhizium, tal como se describe"Xref"> 16. Compruebe las velocidades de sedimentación de las esporas en sulfato amónico 0,2 M y Tween-80 al 0,1%.
- Ajustar el recuento de la suspensión de esporas a ~ 7 × 10 7 esporas / mL para obtener una absorbancia inicial de 0,6 a 540 nm. Deje que las cubetas permanezcan inalteradas durante 6 h para que las esporas se asienten.
- Registre la absorbancia hasta 6 h. Expresar la tasa de sedimentación en porcentaje y calcular el tiempo requerido para la sedimentación al 50% (ST 50 ). Repita el experimento tres veces utilizando suspensiones de esporas recién preparadas.
5. Estudios de Rendimiento de Campo de la Capacidad del Aislado de M. anisopliae Seleccionado para Controlar H. armigera en Pichones
- Formulación en polvo húmedo de M. anisopliae M 34412 esporas
- Preparar la formulación en polvo humectable al 2,5-5% mezclando las esporas con talco.
- Ajuste el conteo final viable (TVC) a 1 x 10 12 spoRes por kg de formulación.
- Estudios de rendimiento de M. anisopliae M 34412 esporas
- Para estudios de rendimiento de campo de la capacidad del aislamiento de M. anisopliae seleccionado para controlar la infestación de H. armigera en garbanzos, utilice un RCBD con cuatro repeticiones.
Nota: Aquí, realizada en Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth (MPKV), Rahuri (19.3927 ° N, 74.6488 ° E). - Utilizar dos formulaciones de pulverización diferentes, una formulación en aceite de esporas (5 x 10 12 esporas / 3 L de diesel: aceite de girasol, 7: 3) y una formulación acuosa en Tween-80 (0,1%). Pulverizar la formulación de aceite con un pulverizador de volumen ultra bajo (ULV) (70 min, 3 L / ha), la formulación acuosa con un pulverizador de mochila (5 x 10 12 esporas, 500 L / ha).
Nota: Aquí, las poblaciones de larvas se registraron un día antes de la pulverización y 3 y 7 días después de la aplicación de cada pulverización a 5 plantas seleccionadas al azar. La población total fueRansformado a la raíz cuadrada de n + 1 para el análisis estadístico.- De acuerdo con las prácticas agrícolas para la cosecha de guandul, realizar la primera pulverización entre 10 y 15 días después de la puesta de huevos y 2 veces más con un intervalo de 14 días. Realizar la pulverización entre las 16:00 y las 18:00 h IST. Controle la dirección del viento y, si es necesario, use cortinas de tela para evitar la deriva de esporas a parcelas vecinas.
- Para la comparación, rocíe los insecticidas químicos con un pulverizador de la mochila de la compresión de la mano.
- Determine la persistencia del inóculo en el campo recolectando larvas de H. armigera 0, 3, 5, 7 y 14 días después de la pulverización.
- Mantener estas larvas bajo observación durante un período de 14 días y después de la muerte, transferirlas a un vial de plástico que contenga papel de filtro húmedo. Incubar a 25 ± 2 ° C y 70 ± 10% de HR para observar la micosis.
- Determinar la persistencia del inóculo en la población de larvas basada en la p Datos de mortalidad de las larvas recogidas del campo después de la pulverización.
- Evaluar los estudios de campo sobre la base del porcentaje de eficacia 17 , el porcentaje de daño en la vaina y el porcentaje de rendimiento 18 .
Nota: Aquí se registraron los datos de los parámetros, tales como temperatura, humedad, velocidad del viento (km / h), sol (h), lluvia (mm), días lluviosos, y evaporación (mm) durante un ensayo a una temperatura (Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth, Rahuri, 19.3927 ° N, 74.6488 ° E).
- Para estudios de rendimiento de campo de la capacidad del aislamiento de M. anisopliae seleccionado para controlar la infestación de H. armigera en garbanzos, utilice un RCBD con cuatro repeticiones.
- Programa de participación de los agricultores
- Seleccione el número de agricultores para los ensayos de demostración. Suministro de las semillas de garbanzo (BSMR - 736), junto con fertilizantes para los agricultores.
Nota: En este estudio participaron 20 agricultores. Población: Deolali Pravara, (19.473 ° N 74.6 ° E). - Utilice las mismas formulaciones de pulverización y el número de pulverizaciones como en el paso 5.2.
- Seleccione el número de agricultores para los ensayos de demostración. Suministro de las semillas de garbanzo (BSMR - 736), junto con fertilizantes para los agricultores.
- Observe el efecto del spray de mycoinsecticide, si lo hay, en las hojas de garbanzo.
- Recoger los artrópodos de la tierra y los insectos que habitan en las hojas 1 día después de cada tratamiento en las parcelas no tratadas y en las parcelas tratadas con M. anisopliae .
- Recoja los artrópodos que viven en el suelo con trampas de cautiverio dentro de las 24 h después del tratamiento y recoja los insectos que habitan en las hojas con una red de barrido la mañana siguiente al tratamiento ( es decir, aproximadamente 15-18 h después del tratamiento).
- Conservarlos individualmente en cajas cilíndricas de plástico con diámetros de 3,5 cm y alturas de 4,0 cm. Compruebe los insectos diariamente para la infección y alimentarlos con la comida apropiada.
- Anotar la presencia de M. anisopliae , si es que lo hay, y aislar el hongo.
7. Identificación de parámetros de control de calidad
- Compruebe la viabilidad de las esporas midiendo la germinación de esporas en PDA a 28 °;DO.
- Medir las actividades enzimáticas degradantes de la cutícula, como la quitinasa, la quitin-desacetilasa, la quitosanasa, la proteasa y la lipasa, producidas en los medios YPG y quitina, como se describió anteriormente 15 .
- Determine el porcentaje de mortalidad de H. armigera en un bioensayo de laboratorio 15 .
- Utilizar marcadores moleculares, como un patrón de PCR-RFLP de Chitinases ( Chit 1 , 2 , y 4 ) y genes de proteasa ( Pr1A ), como atributos de virulencia para M. anisopliae .
- Extraer el ADN genómico de la biomasa de micelios utilizando un kit de aislamiento de ADN 15 . PCR-amplificar los fragmentos de genes Chit1 y Chit2 utilizando ADN genómico como plantilla, con pares de cebadores Chit1F / Chit1R (CTCTGCAGGCCACTCTCGGT / AGCCATCTGCTTCCTCATAT) y Chit2F / Chit2R (GACAAGCACCCGGAGCGC / GCCTTGCTTGACACATTGGTAA). Para Chit4 , utilice el par de cebadores Chit4F / Chit4R (ATCCGGCAGCACGGCTAC / CTTGGATC CGTCCCAGTTG).
- Para la amplificación del gen Pr1A, utilice el par de cebadores METPR2 y METPR5 (AGGTAGGCAGCCAGACCGGC / TGCCACTATTGGCCGGCGCG).
- Realizar la digestión de restricción 19 del gen Chit1 con BsaJI, BstUI, y ScrFI; del gen Chit2 con AluI, HpyCH4IV, y HpyCH4V, y del gen Chit4 con BstUI, HaeIII, y MboI. Para la digestión del gen Pr1A , utilizar RsaI , DdeI y MspI 20 .
- Observar el patrón de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) en gel de agarosa al 1,5% por electroforesis para cada gen de la mayoría de las cepas virulentas (> 90% de mortalidad); Esto puede usarse como un marcador de virulencia para la selección de M. anisopliae .
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Representative Results
Durante las investigaciones, se aislaron diferentes cepas de Metarhizium, Beauveria y Nomuraea mediante diversos métodos de aislamiento (datos no mostrados) 6 , 14. Como se demostró que las cepas de Metarhizium eran más efectivas en el control de H. armigera , una plaga espantosa en los pulsos 6 , 14 , Otros aislamientos fueron dirigidos a aislar cepas de Metarhizium de diferentes campos de cultivo y los insectos ( Tabla 1 ]. El total de 68 aislados de Metarhizium obtenidos fueron identificados por características culturales y morfológicas y por ITS 1-5.8S-ITS 4 secuenciación. Basándose en la mortalidad> 90% de H. armigera en los bioensayos de laboratorio, 12 cepas de Metarhizium se sometieron a pruebas adicionales de producción de esporas, viabilidad, LC 50 , LT 50 y ST 50 . La Tabla 2 describe los datosPara 3 aislamientos potenciales, M34311, M34412 y M81123; Se encontró que el M34412 era el mejor aislamiento.
Entre los sustratos probados, tales como el arroz, el sorgo, el maíz y el trigo, el arroz soporta la máxima esporulación en el caso de los aislados de Metarhizium (60-75 g de esporas / kg, 4-4,4 x 10 10 esporas / g de polvo de esporas) .
Durante el ensayo de campo para el control de H. armigera en garbanzos, se obtuvieron eficacias de 78,0% y 70,9% con las formulaciones de aceite y acuosa de M. anisopliae M34412, respectivamente . Se encontró que el daño de vaina en las parcelas tratadas con M. anisopliae fue menor (8,76%) que en las parcelas de control no tratadas (23,63%) y las parcelas tratadas químicamente (10,24%). El rendimiento promedio (q / ha) en el control no tratado fue de 7,31 q / ha, que fue menor que después del tratamiento con M. anisopliae M34412 (14,04 q / ha). El tratamiento con producto químico dio un rendimiento de 12,78 q / ha ( Tabla 3 ).
Las observaciones registradas para los síntomas de fitotoxicidad revelaron que ningún tratamiento mostró un efecto fitotóxico en el cultivo de guandul tras 3 pulverizaciones de la formulación de M. anisopliae . De los 57 artrópodos cosechados (grillos de campo y arañas), ninguno estaba infectado. De los 590 artrópodos recolectados de dosel, se encontró que dos individuos del orden Heterópteros (= 0,3% de los artrópodos recolectados) estaban infectados con M. anisopliae ( Tabla 4 ). Ni las arañas ni los coccinellidos sucumbieron al hongo.
| Suelo (58 aislamientos) | ||
| Aislar No. | Cultivo | No. de aislamientos |
| M1311, M1322, M1333, M2104, M2305, M2416, M2427, M2508, M42014, M45115, M45216, M45317, M79120, M79221, M79322 | Tomate | 15 |
| M3419, M34210, M34311, M34412, M34513, M171264 | Chirimoya | 6 |
| M91123, M91124, M91225, M91326, M91528, M91427, M91629, M91730, M91831, M91932, M111145 | Caña de azúcar | 11 |
| M101133, M101234, M101335, M101436, M101537, M101638, M101739, M101840, M101941, M102042, M102143, M102244 | Brinjal | 12 |
| M51118, M51219 | Okra | 2 |
| M131150, M141151, M141252, M151153 | Garbanzo | 4 |
| M121146, M121247, M121348, M121449 | Garbanzo | 4 |
| M183365 | Algodón | 1 |
| M193166 | Jawar | 1 |
| Anfitrión de insectos (10 aislamientos) | ||
| M16255, M16356, M16457, M16558, M16659 | Pulgón-gusano grasiento | 5 |
| M16154, M16760 | Insecto de la caña de azúcar | 2 |
| M16861 | Grano de caña de azúcar | 1 |
| M16962 | Escarabajo de caña de azúcar | 1 |
| M161063 | Caña de azúcar-Pyrilla perpussila | 1 |
Tabla 1. Origen de las cepas de Metarhizium . Las 68 cepas de Metarhizium fueron aisladas de diferentes campos de cultivo (58 cepas) e insectos micosos de los campos de cultivo (10 cepas).
| Aislar | Rendimiento (g / kg de arroz) | Viabilidad (%) | CL 50 (x 103 esporas / ml) | LT 50 (días) | Mortalidad (%) | |
| Media ± SD | Media ± SD | (Límite Fiducial) | (Límite Fiducial) | (Límite Fiducial) | ||
| M34311 | 60,00 ± 2,64a | 92,00 ± 2,64a | 2,47 (2,26 - 2,69) | 2 (0,4 - 10,3) | 3,5 (3,2-3,7) | 96,67 |
| M34412 | 67,00 ± 3,46b | 97,00 ± 1,73a | 2,3 (2,11-2,52) | 1,4 (0,1 - 1,9) | 3.3 (3.0-3.6) | 96,67 |
| M81123 | 75,00 ± 3,60c | 93,00 ± 1,73a | 2,65 (2,43 - 2,90) | 5,7 (1,2 - 26,7) | 3.3 (3.1-3.6) | 95,56 |
| Los números seguidos por la misma letra dentro de la columna no son estadísticamente diferentes. | ||||||
| ST 50 , tiempo requerido para la sedimentación de esporas al 50% en Tween 80 al 0,1% (p / v). | ||||||
| Los números seguidos por la misma letra dentro de la columna no son estadísticamente diferentes. SD, desviación estándar. T80, Tween 80 (0,1%, p / v). | ||||||
| CL 50 , la concentración letal media de esporas calculada para causar 50% de mortalidad de H. armigera después de 14 días. | ||||||
| LT 50 , el tiempo letal medio de esporas calculado para causar 50% de mortalidad de H. armigera . | ||||||
Tabla 2. Selección de tres aislados de Metarhizium de mejor rendimiento. H. armigera de 3ª .
| Prueba de campo $ | ||
| Tratamiento | % Eficacia* | Rendimiento (q / ha) |
| M. anisopliae acuoso M34412 (5x10 12 esporas / ha) 500L | 70,93 ± 4,19 | 14,04 |
| Formulación de aceite ( M. anisopliae ) (5 x 10 12 esporas / ha) 3 L | 78,02 pm 4,61 | 15,53 |
| Plaguicidas químicos / Práctica de los agricultores (2 ml / L, 500 L / ha) | 63,43 pm 0,85 | 12,78 |
| Control no tratado | - | 7,31 |
| Ensayo de demostración en (Programa participativo de agricultores) $$ | ||
| Tratamiento | % De daño de vaina | Rendimiento (q / ha) |
| Formulación acuosa ( M. anisopliae ); Superficie 4.2 ha | 15,9 pm 1,26 | 10,75 |
| Formulación de aceite ( M. anisopliae ); Superficie 0.4 ha | 17,74 | 12,5 |
| Práctica de los agricultores; Área 11ha | 22,72 pm 3,37 | 7,55 |
| Cultivo de riego | ||
| $ Diseño de bloques al azar | ||
| * Después de Henderson y Tilton (1955) | ||
| # HaNPV, nucleopolyhedrovirus de H. armigera | ||
| $$ NDe los agricultores que participaron en los ensayos de demostración fueron 20. Las semillas de garbanzo (BSMR - 736) fueron suministradas junto con fertilizantes a los agricultores. Población: Deolali Pravara, Tal. Rahuri. Dist. A'Nagar (MS) (19,473 ° N 74,6 ° E) | ||
Tabla 3. Rendimiento de campo de la cepa M. anosopliae (M34412) contra H. armigera . Las eficacias de diferentes formulaciones de M. anisopiae se compararon con tratamientos con pesticidas químicos contra la infestación por H. armigera en garbanzos bajo condiciones de campo.
| Parámetro | Campo 1 | Campo 2 | Campo 3 |
| Tamaño de la parcela (m) | 12 x 17 | 10 x 10 | 10 x 15 |
| Replicates | 2 | 2 | 2 |
| # Artrópodos de trampas de trampas probadas | 20 | 22 | 15 |
| % Infectado con M. anisopliae (trampas) | DAKOTA DEL NORTE | DAKOTA DEL NORTE | DAKOTA DEL NORTE |
| # Artrópodos de la colección de red de barrido probados | 193 | 171 | 226 |
| % Infectado con M. anisopliae (recogida de la red de barrido) | DAKOTA DEL NORTE | DAKOTA DEL NORTE | 0,9 |
| ND, No detectado Campo 1, Escuela de Agricultura, Pune; Campo 2, ONG 1, Tulapur, Pune; Campo 3, ONG 2, Aalandi, Pune. |
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Discussion
Durante la década de 1880, se hizo el primer intento de utilizar Metarhizium para controlar el escarabajo del escarabajo, Anisoplia austriaca, y el curculio de la remolacha azucarera, Cleonis punctiventris 21 . En este protocolo, uno de los prerrequisitos fue aislar una cepa virulenta, ya sea del suelo o de insectos infectados. De hecho, otros parámetros, como LC 50 , LT 50 y ST 50 , contribuyeron significativamente a la rentabilidad del producto [ 22 , 23] . Para la optimización de la producción de esporas, se mantuvo un delicado equilibrio entre número de esporas, viabilidad y virulencia 24 .
Dado que la agricultura es un producto de alto volumen y bajo costo, las preocupaciones principales son la percepción de la calidad, la aceptabilidad de los usuarios finales y la vida útil de las esporas. La especificidad del huésped es ventajosa para evitar efectos no deseados= "Xref"> 14. La evitación de subcultivos repetidos en medio artificial y el ocasional paso a través del hospedero insecto mantuvieron la virulencia y efectividad de las esporas de Metarhizium en el campo 22 . El enfoque presentado tiene limitaciones: la preparación es más efectiva cuando el umbral económico es de ~ 2-3 larvas por planta y la germinación de esporas es máxima en presencia de alta humedad y temperaturas relativamente bajas.
En este caso, la preparación fúngica es eficaz después del contacto, mientras que las preparaciones bacterianas (Bt) y virales (-HaNPV) sólo son eficaces cuando se digieren. En cuanto a los parámetros de control de calidad, además de la viabilidad de las esporas, se ha sugerido por primera vez que los marcadores bioquímicos y moleculares basados en actividades enzimáticas degradantes de la cutícula y patrones de digestión de restricción específicos de los mismos genes enzimáticos pueden asegurar la efectividad en el campo. La calidad-contrLos parámetros sugeridos son: (a) la viabilidad de las esporas, medida como germinación de esporas (debería ser> 90% en PDA después de 16 h a 28 ° C y 70-80% HR); B) el porcentaje de mortalidad de H. armigera (debería ser> 90%, con 1 x 10 7 esporas en el bioensayo de laboratorio); (C) la actividad de quitinasa en el medio de quitina después de 72 h (debería ser> 3,5 x 10 -3 U / ml); Y (d) el patrón de PCR-RFLP de los genes quitinasas. Este manuscrito ha descrito esencialmente los protocolos, desde el aislamiento de un hongo entomopatógeno hasta la generación de datos de eficacia contra la plaga objetivo en el campo. Este es uno de los requisitos previos para registrar cualquier formulación biopesticida con la Central Insecticide Board de la India y, eventualmente, para la comercialización.
La serie de experimentos detallados aquí será útil para el desarrollo de un mycoinsecticide potencial. Además, después de la extracción de las esporas, la biomasa micelial residual puede utilizarse paraLa promoción del crecimiento de las plantas o para el aislamiento de los polímeros de quitosano o glucosamina para aplicaciones sanitarias.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen la contribución de los colaboradores del programa de Colaboración Indo-Suiza en Biotecnología (ISCB) del Departamento de Biotecnología de Nueva Delhi y de la Agencia Suiza para el Desarrollo y la Cooperación, Berna, Suiza. Se reconoce la contribución de los estudiantes del proyecto y del personal involucrado en el desarrollo del micoinsecticida, incluyendo a Vandana Ghormade, Pallavi Nahar, Priya Yadav, Shuklangi Kulkarni, Manisha Kapoor, Santosh Chavan, Ravindra Vidhate, Shamala Mane y Abhijeet Lande. EKP y SGT agradecen a la University Grants Commission, India y al Consejo de Investigación Científica e Industrial (CSIR), India, respectivamente, por becas de investigación. MVD reconoce el apoyo del Consejo de Investigación Industrial y Científica, Nueva Delhi para el Emeritus Scientist Scheme. Los autores agradecen al Departamento de Biotecnología, Nueva Delhi, India, por el apoyo financiero de los programas ISCB y SBIRI. Estamos agradecidos aRevisores por sus aportaciones.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Hi-Media | RM666 | Reagent |
| Ammonium sulphate | Thomas Baker | 11645 | Reagent |
| DNA analyzer | Applied biosystem | ABI prism 3730 | Instrument |
| DNA islation kit | Qiagen | 69104 | Reagent |
| Dodine | Sigma | 45466 | Reagent |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28604 | Reagent |
| Glucose | Hi-Media | GRM077 | Reagent |
| Knapsac sparyer | Kaypee | HY-16L (1004) | Instrument |
| Peptone | Hi-Media | RM006-500G | Reagent |
| Polypropylene vials | Laxbro | SV-50 | Plasticware |
| Potato dextrose agar (PDA) | Hi-Media | M096-500G | Reagent |
| Tween-80 | SRL | 28940 | Reagent |
| Ultra low volume sparyer | Matabi | INSECDISK | Instrument |
| Unicorn-bags | Unicorn | UP-140024-SMB | Autoclavalbe bag for SSF |
| Yeast extract | Hi-Media | RM027-500G | Reagent |
| Chromas 2.1 | software |
References
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