Summary
여기서는 농업에서 해충 방제를위한 "최적의"곤충 병원성 균류 인 Metarhizium anisopliae 의 분리, 확인, 스크리닝 및 선택을 포함한 효과적인 제균제 개발에 관한 지식 기반 개발과 관련된 여러 단계를보고합니다 .
Abstract
상업용 살균제 개발시 주요 관심사는 화학 살충제에 비해 살균 속도입니다. 따라서 신속히 작용하는 독성이 강한 곤충 병원성 균의 선발을위한 격리 및 스크리닝은 중요한 단계입니다. 접촉으로 작용하는 Metarhizium , Beauveria, Nomurea 와 같은 병원균은 곤충 해충에 의해 섭취되어야하는 Bacillus thuringiensis 또는 핵 다당체 바이러스 (NPV)보다 더 적합합니다. 현재 연구에서 우리는 토양 희석 및 미끼 방법을 사용하여 감염된 곤충으로부터 68 개의 Metarhizium 균주를 분리했다. 분리 균주는 ITS1-5.8S-ITS2 및 26S rDNA 영역의 증폭 및 시퀀싱에 의해 동정되었다. Metarhizium anisopliae 의 가장 독성이있는 균주는 Helicoverpa armigera 의 III-instar 유충에 대한 곤충 생물 검정에서 얻은 중간 치사 농도 (LC 50 )와 시간 (LT 50 )을 기준으로 선정되었습니다 .선정 된 균주에 의한 포자 대량 생산은 벼를 기질로 사용하여 14 일 동안 고체 발효 (SSF)로 수행되었다. 포자는 0.1 % 트윈 -80을 사용하여 포자 포자 된 바이오 매스로부터 추출되었고 포자의 상이한 제제가 제조되었다. 비둘기 완두에서의 H. armigera 감염의 조절을위한 제제의 현장 시험은 무작위 블록 설계에 의해 수행되었다. 기름과 수성 제형 (각각 78.0 %와 70.9 %)으로 얻은 침입 방제 수준은 화학 농약으로 얻은 63.4 %보다 낫습니다.
Introduction
인도에서 1940 년대에 유기 염소 살충제의 도입에서, 살충제의 사용은 작물 해충은 여전히 농업 생산의 수율 손실의 측면에서 매년 루피 2 수십억을 비용으로 많은 배 (1) 증가했다. 합성 농약의 광범위하고 비 현명한 사용은 환경과 인간의 건강 (1)에 대한 지속적인 위협이다. 농약의 무차별적인 사용은 토양의 잔류 물과 자연 해충 포식자의 고갈로 이어진다. 또한 저항 1의 개발로 이어지는, 해충 인구의 유전 적 구성을 변경하기위한 강력한 선택 압력으로 작용한다. 비료와 살충제 같은 높은 투입물을 요구하는 녹색 혁명의 엄청난 이익에도 불구하고, 해충은 주요한 생물학적 제약이 계속되고 있습니다. 인도 및 전세계의 연간 작물 손실 기록에 대한 일반적인 추정치는 120 억 달러EF "각각> 2 USD 2,000 억 3.
화학 살충제가 해충을 방제 할 때 해로운 영향을 미칠 경우 생태 학적으로 건전하고 신뢰할 수 있으며 경제적이며 지속 가능한 대체 방법을 찾아야합니다. 생물학적 방제는 적절한 대안을 제공하며 기생충, 포식자 및 미생물 병원균의 사용을 포함합니다 4 . 예를 들어 곰팡이는 나비목, hymenopterans, coleopterans 및 dipterans를 비롯한 광범위한 해충을 감염시키는 것으로 알려져 있으며, 종종 자연적인 감염증을 초래합니다. 또한, 다른 바이러스 및 박테리아, 곤충 방제 제는 달리, 곤충 병원성 진균의 작용 모드는 접촉자 (5)가된다. 이 곰팡이는 100 종 이상의 이종 그룹으로 구성되어 있으며, 약 750 종이 서로 다른 곤충들 사이에서보고됩니다. 중요한 곰팡이 병원균은 다음과 같습니다 : Metarhizium sp., Beauveria sP., Nomuraea의 rileyi, Lecanicillium의 lecanii 및 Hirsutella 특검팀은., 6 몇 이름을 지정합니다. M. anisopliae (Metchnikoff) Sorokin은 생물학적 방제에서 두 번째로 널리 사용되는 곤충 병원성 균이다. 200 종 이상의 곤충을 공격하는 것으로 알려져 있습니다 7 .
이 연구에서는 M. anisopliae를 이용한 mycopesticide의 지식 기반 개발과 관련된 여러 단계가 제시됩니다. 1) 병원성 곤충 병원체에 대한 원천 ( 즉, 토양 또는 균사체 곤충) 확인, 2) 곤충 병원체 식별 및 선택, 3) 실험실 생물 분석 및 현장에서의 독성 및 유효성 유지 전략 5) 독성 물질 준비를위한 독창적 인 품질 관리 매개 변수의 개발, 6) 생물 조사 및 부가가치.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Entomopathogenic 곰팡이의 분리
- 토양 희석법
- 다른 작물 장에서 토양 표본과 진균 성 곤충을 수집하십시오 ( 표 1 ). 토양 희석 도금 방법 8을 사용하여 토양 샘플에서 곤충 병원성 진균을 분리합니다.
주 : 본 연구에서는 Pune (18 ° 31'13''N; 73 ° 51'24''E)과 Buldhana (19 ° 58'36''N 76 ° 30'30''E ) 지구, Maharashtra, 인도. - 각 토양 시료 10g을 달아 무균의 0.1 % (w / v) Tween-80 90mL에 따로 따로 첨가한다.
- 토양 입자에 부착 된 포자를 방출하기 위해 60 분 동안 자기 교반기를 사용하여 시료를 철저하게 섞는다.
- 혼합 후, 각 샘플에서 (g / L) : 펩톤, 10을 포함하는 선택 배지에 100 내지 200 μL 분취 량을 퍼뜨린다. 글루코오스, 20; 한천, 18 세; 스트렙토 마이신 0.6; 테트라 사이클린, 0.05; 싸이클로 헥사 마이드, 0.05; 및 도딘, 0.1 mL; pH 7.0 9 . 28에서 플레이트를 품어 ° C. 3-7 일.
- 순수 배양 물을 얻기 위해 동일한 배지에서 개별 포자 형성 콜로니를 선택하고 계대 배양하십시오.
- 다른 작물 장에서 토양 표본과 진균 성 곤충을 수집하십시오 ( 표 1 ). 토양 희석 도금 방법 8을 사용하여 토양 샘플에서 곤충 병원성 진균을 분리합니다.
- 진균류 곤충에서
- 들판에서 mycosed 곤충을 수집합니다.
참고 : 단단한 애벌레 몸체는 곤충 병원성 균에 감염 될 가능성이 있습니다. 세균성 또는 바이러스 성 감염으로 죽은 곤충 몸체는 부드럽습니다. - 비정상적인 행동, 빈약 한 조정 및 불규칙한 움직임으로 살아있는 곤충을 모으십시오.
- 28 ° C와 70-80 % RH에서 추가 균종과 포자 성화가 일어날 때까지 곤충을 사체에 보관하고 촉촉한 방으로 옮기십시오.
- 위에서 언급 한 선택 배지에 포자 모양의 포자에서 포자를 줄기 및 같은 매체에 2-3 배 더 subculturing하여 순수 문화를 얻을 수 있습니다.
- 들판에서 mycosed 곤충을 수집합니다.
- 미끼 법
- 안에유리 병 (3.85 x 6.0 cm)에 토양 시료 60 g을 넣고 벼 유충 ( Corcyra cephalonica ) 4 개를 넣고 25 ± 2 ° C에 14 일 동안 보관합니다.
- 매일 바이알을 뒤집어 놓습니다. 14 일 후, 진균류 나방 유충의 존재에 대한 토양 샘플을 조사하십시오. 선택적 배지에 포자를 포자에서 줄기로 entomopathogenic 곰팡이를 분리.
- 순수한 배양 물을 얻은 후, 분리 균주를 감자 덱스 트로 오스 한천 (PDA) 배설물에 옮기고 28 ° C 및 70-80 % RH에서 7 일 동안 배양하여 포자 균을 허용한다. 포자를 낳은 후 사용하기 전까지 모 배양을 8 ° C로 유지하십시오.
2. Entomopathogenic 곰팡이의 식별
- 형태 학적 특성 ( 즉, 무성 포자의 크기와 형태, 분생 포자의 포자 배열)을 관찰하여 곤충 병원성 진균을 확인한다. 3 개의 주요 속의 분리, Metarhizium , Beauv 에리아, 노무 라이아 등을 확인할 수 있습니다.
- Metarhizium 균주의 분자 동정을 위해, DNA isolation kit를 이용하여 균사체 바이오 매스로부터 게놈 DNA를 추출한다. 제조업체의 지침을 따르십시오 ( 재료 표 참조). 0.8 % 아가 로스 겔에서 전기 영동을 수행하여 게놈 DNA의 품질을 확인하십시오.
- ITS1-5.8S - ITS2 및 26S rDNA 영역을 PCR 증폭. ITS1 포워드 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG)와 ITS4 리버스 (TCCTCCGCTTATTGATATGC) 프라이머 10 으로 genomic DNA를 template로 사용하십시오.
- 겔 추출 키트를 사용하여 예상 크기의 앰플 리콘을 겔에서 용리하고 정제하십시오. 제조업체의 지침을 따르십시오 ( 재료 표 참조). 정제 된 amplicon과 서열을 정량하십시오.
- 소프트웨어를 사용하여 서열을 읽고 편집하고 NCBI GenBank 데이터 라이브러리의 염기 서열을 BLAST 검색하여 가까운 상 동성을 분석하십시오= "xref"> 11.
- 접근 번호를 검색하기 위해 NCBI GenBank 데이터베이스에 식별 된 entamopathogenic 분리의 시퀀스를 입금.
Metarhizium 3. 심사는 반대 H.의 armigera 격리 된 것
- 곤충 사육
- 현장에서 곤충의 건강한 유충 및 번데기를 모아서 H. armigera 의 초기 양식을하십시오.
- 응원, 10 분 (12) (3.85 X 50 cm 6.0 ㎖의 용량) 멸균 폴리 프로필렌 튜브에서 각각 0.5 % 살균 오크라의 조각을 포함하는 (v / v)의 차아 염소산 나트륨을 유충 성장.
- 양육 중에 놓인 곤충 알을 모으고 0.5 % (v / v) 차아 염소산 나트륨으로 표면 살균하십시오.
- 25 ± 2 ° C 및 65 ± 5 % RH에서 유충 유지.
- 곤충 생물 분석
참고 : 곤충 생물 분석을 위해, 포자의 생산,달리 명시되지 않는 필드의 성능 시험은 mycosed H. armigera의 유충에서 Metarhizium 균주의 첫번째 계대 배양을 사용 하였다.- 곤충 생물 분석을 위해서는 H. armigera 의 III-instar 유충을 사용하십시오.
- 별도로 언급하지 않는 한 Metarhizium 분리 물 (1 x 10 7 포자 / mL, 생존률> 90 %)의 10-mL 포자 현탁액에 개별적으로 30 개의 유충 한 세트를 5 초 동안 3 회 담근다.
- 처리 후 식인 풍습을 피하기 위해 각 유충을 개별적으로 멸균 바이알에 옮깁니다. 각 바이알에 촉촉한 Whatmann 여과지 1 번과 소독 된 오크라 조각을 사료로 첨가하십시오. 대체 요일에 용지와 공급을 변경하십시오.
- 유충을 25 ± 2 ° C, 65 ± 5 % RH 및 16 : 8의 가벼운 곳에 보관하십시오 : 14 일 동안 또는 그들이 죽을 때까지 어둡게하십시오.
- 죽은 유충을 축축한 면봉이 들어있는 멸균 페트리 플레이트에 옮기고 균사체와 포자를 허용하도록 3-7 일 동안 28 ° C와 70-80 % RH에서 보관하십시오시체 위로 형성.
- 대조군의 경우, 멸균 증류수에 0.1 % (w / v) Tween-80을 3 회에 걸쳐 30 마리의 유충을 처리하십시오.
- 신선하게 준비된 포자 현탁액을 사용하여 모든 실험을 3 회 실시하십시오. 평균값을 얻기 위해 세 번의 실험에서 사망률에 대한 데이터를 수집하고 저장합니다. Abbott의 공식을 사용하여 보정 된 사망률을 계산하십시오 13 .
- 무작위로 완성 된 블록 설계 (RCBD) 레이아웃을 사용하여 실험을 수행하십시오. 각각의 처리에는 30 개의 애벌레가 3 세트로 포함되어 있습니다. H. armigera 에 대한 사망률을 기준으로 상업 생산을위한 최고의 분리 균주에 대한 추가 스크리닝을 위해 Metarhizium 분리주를 선택하십시오.
- H. armigera III-instar 유생에 대해> 90 %의 사망률을 나타내는 격리 균주를 선택하십시오.
참고 : 여기에서 12 균주가 선택되었습니다. - 이 분리 균의 LT 50 을 결정하고 분리 균을 선택하십시오.가장 빠른 살인 등급 (짧은 시간 내).
참고 : 여기서 가장 고립 된 12 개의 분리주에서 5 개의 분리주가 선택되었습니다. - 포자 현탁액의 4 가지 농도 (즉, 1 × 10 3 , 1 × 10 5 , 1 × 10 7 및 1 × 10 9 포자 / mL)를 사용하여 선택된 분리 물의 LC 50 값을 결정합니다.
- H. armigera 의 III-instar 유충에 대한 Metarhizium 균주의 LC 50 을 측정하여 단회 투여 만 사용하는 경우에는 발견되지 않을 높은 사망률 값을 가진 격리 균의 독성의 차이를 확인할 가능성을 높입니다.
4. 현장 성능 연구를위한 Metarhizium Isolate의 포자 생산
- SSF에 의한 Metarhizium 포자 생산
- SSF 들어, Metarhizium 분리 2 x 10 7 포자를 추가하여 inoculum을 준비YPG (0.3 % 효모 추출물, 0.5 % 펩톤 및 1.0 % 글루코스) 배지 200㎖를 첨가 하였다. 48 시간 동안 흔들어 (180 rpm) 28 ° C에서 flasks를 품어.
- SSF에 의한 포자의 대량 생산을 위해서는 별도의 언급이없는 한 밥을 기질로 사용하십시오.
- SSF의 경우 2kg의 쌀과 함께 오토 클레이브 백 (type / 14, 0.5μm의 단일 미세 여과기 필터, 용량 2kg, 64x36cm)을 채 웁니다. 봉지의 쌀 증류수 1,000 mL를 첨가하고, 밤새 14 소크. 121 ° C에서 담근 쌀로 백을 45 분 동안 오토 클레이브합니다. 15 .
- 48 시간 된 균사체 접종 물 (10 % 접종 물, 2kg 쌀의 경우 200mL)을 접종하고 28 ° C 및 70-80 % RH에서 14 일 동안 배양하십시오.
- 0.1 % Tween-80을 사용하여 액체 추출에 의해 포자를 수확하십시오. 이를 위해 백의 내용물을 0.1 % Tween-80 (쌀 1kg 당 3L)에 넣고 철저히 혼합하고 원심 분리하여 액체와 포자를 분리 한 다음 37 ℃에서 2 일 동안 건조시킵니다 < / li>
- 또는 수분 함량을 줄이기 위해 37 ° C에서 2 일 동안 포자와 일부 균사가있는 쌀이 들어있는 백을 건조시킵니다 (<20 %). myco-harvester 또는 vibro-sifter를 사용하여 포자를 수확하십시오.
- 생존 능력 연구
- 다른 방법을 사용하여 수확 된 포자의 생존율을 결정하십시오 15 . 이를 위해 포자 현탁액을 0.1 % (w / v) Tween-80으로 준비하고 1 x 10 3 포자 / mL로 조정하십시오.
- PDA 플레이트에 포자 현탁액 (0.1 ML)을 3 배로 퍼 내고 72 시간 동안 28 ° C 및 70-80 % RH에서 배양합니다.
- 격리 된 식민지를 수동으로 계산하고 각각의 샘플에 대한 전체 생존 수를 결정합니다.
- 포자 침강 속도
- 균일 한 복용량을 위해 균질 한 포자 현탁액이 필요합니다. 설명 된대로 Metarhizium 균주의 포자 침강 속도를 결정하십시오."xref"> 16. 0.2 M 황산 암모늄과 0.1 % Tween-80에서 포자의 침강 속도를 확인하십시오.
- 540 nm에서 0.6의 초기 흡광도를 얻으려면 ~ 7 × 10 7 포자 / mL로 포자 현탁액의 수를 조정하십시오. 포자가 안정화되도록 큐벳을 6 시간 동안 그대로 두십시오.
- 최대 6 시간 동안 흡광도를 기록하십시오. 침강 속도를 %로 표현하고 50 % 침강에 필요한 시간을 계산하십시오 (ST 50 ). 갓 준비한 포자 현탁액을 사용하여 실험을 세 번 반복하십시오.
5. 비둘기 완두에서 H. armigera 를 통제하기 위하여 선택된 M. anisopliae 분리 물의 능력에 관한 현장 성능 연구
- M. anisopliae M 34412 포자의 습윤 분말 제형
- 포자와 활석을 혼합하여 2.5-5 % 습윤성 분말 제제를 준비합니다.
- 최종 생존 수 (TVC)를 1 x 10 12 spo로 조정하십시오.입술 1 킬로그램 당 입술.
- M. anisopliae M 34412 포자의 현장 수행 연구
- 비둘기 완두에서의 H. armigera 감염을 통제하기 위해 선택된 M. anisopliae 분리 물의 능력에 대한 현장 성능 연구를 위해, 4 번의 복제로 RCBD를 사용하십시오.
참고 : 여기 Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth (MPKV), Rahuri (19.3927 ° N, 74.6488 ° E)에서 공연. - 포자 (5 x 10 12 포자 / 3 L의 디젤 : 해바라기 유, 7 : 3)와 Tween-80 (0.1 %)의 수성 제제의 오일 제제 인 두 가지 다른 스프레이 제제를 사용하십시오. 배수 분무기 (5 x 10 12 포자, 500 L / ha)로 수성 배합물을 초 저량 (ULV) 분무기 (70 분; 3 L / 헥타르)로 분무합니다.
참고 : 여기에서, 유생 개체수는 분무하기 하루 전과 무작위로 선정한 5 개의 식물에 각 분무를 적용한 후 3 일과 7 일 후에 기록했습니다. 전체 인구는 t통계 분석을 위해 n + 1의 제곱근으로 변환됩니다.- 비둘기 완두 농작물에 대한 농업 관행에 따르면, 산란 후 10 일에서 15 일 사이에 첫 번째 살포를 수행하고 14 일 간격으로 2 번 더 살포하십시오. 16:00에서 18:00시 사이에 분무를 수행하십시오. 바람 방향을 모니터하고 필요할 경우 천 커튼을 사용하여 포자가 인접한 플롯으로 이동하지 않도록하십시오.
- 비교를 위해 손 살포 배낭 분무기로 화학 살충제를 분무하십시오.
- 살포 후 0, 3, 5, 7, 14 일에 H. armigera 유충을 채집하여 현장에서 접종 균의 지속성을 결정합니다.
- 이 애벌레를 14 일 동안 관찰 한 후 사후 보관 한 후 젖은 여과지가 들어있는 플라스틱 병에 옮깁니다. mycosis를 관찰하기 위해 25 ± 2 ° C 및 70 ± 10 % RH에서 인큐베이션하십시오.
- p에 근거하여 유충 개체군의 접종 물 지속성을 결정합니다. 살포 후 현장에서 채집 한 유충의 사상충도 자료.
- 유효성 % 17 , 포드 (pod) 손상 % 및 수확량 퍼센트 18을 기준으로 현장 조사를 평가하십시오.
참고 : 여기서 온도, 습도, 풍속 (km / h), 햇빛 (h), 강우량 (mm), 비오는 날 및 증발량 (mm)과 같은 매개 변수에 대한 데이터는 농업 대학 (Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth, Rahuri, 19.3927 ° N, 74.6488 ° E).
- 비둘기 완두에서의 H. armigera 감염을 통제하기 위해 선택된 M. anisopliae 분리 물의 능력에 대한 현장 성능 연구를 위해, 4 번의 복제로 RCBD를 사용하십시오.
- 농민 참여 프로그램
- 시범 재판을 위해 농부 수를 선택하십시오. 비둘기 완두 종자 (BSMR - 736)를 농부들에게 비료와 함께 공급하십시오.
참고 : 본 연구에서는 20 명의 농부가 참여했습니다. 마을 : Deolali Pravara, (19.473 ° N 74.6 ° E). - 단계 5.2에서와 동일한 스프레이 배합 및 스프레이 수를 사용하십시오.
- 시범 재판을 위해 농부 수를 선택하십시오. 비둘기 완두 종자 (BSMR - 736)를 농부들에게 비료와 함께 공급하십시오.
- 비둘기 완두 잎에 mycoinsecticide 스프레이가 있으면 그 영향을 관찰하십시오.
- 미 처리 플롯과 M. anisopliae로 처리 한 플롯에서 각 처리 후 1 일 후에 토양 주거 arthropods와 잎에 서식하는 곤충을 수집하십시오.
- 처리 후 24 시간 이내에 함정에 빠진 함정이있는 토양에 사는 절지 동물을 모으고 치료 후 아침 ( 예 : 치료 후 약 15-18 시간)에 소엽이있는 곤충을 수집합니다.
- 직경 3.5cm, 높이 4.0cm 인 원통형 플라스틱 박스에 개별적으로 보관하십시오. 곤충에 매일 감염이 있는지 확인하고 적절한 음식을 먹이십시오.
- M. anisopliae 의 존재를 기록하고, 곰팡이를 분리하십시오.
7. 품질 관리 매개 변수의 식별
- 28 °에서 PDA의 포자 발아율을 측정하여 포자 생존 능력을 확인하십시오;기음.
- 이전 15 바와 같이, YPG 키틴 매체 제조 예 키틴, 키틴 데 아세틸 라제, chitosanase, 프로테아제, 리파제 등의 표피 분해 효소 활동을 측정.
- 실험실 생물 분석에서 H. armigera의 사망률을 결정합니다 15 .
- M. anisopliae의 독성 속성으로 Chitinases ( Chit 1 , 2 및 4 ) 및 protease ( Pr1A ) 유전자의 PCR-RFLP 패턴과 같은 분자 마커를 사용합니다.
- DNA 격리 키트 15를 사용하여 균사체 바이오 매스에서 게놈 DNA를 추출합니다. Chit1F / Chit1R (CTCTGCAGGCCACTCTCGGT / AGCCATCTGCTTCCCATAT) 및 Chit2F / Chit2R (GACAAGCACCCGGAGCGC / GCCTTGCTTGACACATTGGTAA) 프라이머 쌍을 이용하여 게놈 DNA를 주형으로하여 Chit1 및 Chit2 유전자 단편을 PCR 증폭한다. Chit4 들어 , 프라이머 쌍 Chit4F / Chit4R (ATCCGGCAGCACGGCTAC / CTTGGATC CGTCCCAGTTG).
- Pr1A 유전자의 증폭을 위해서는 METPR2와 METPR5 프라이머 쌍 (AGGTAGGCAGCCAGACCGGC / TGCCACTATTGGCCGGCGCG)을 사용하십시오.
- BsaJI , BstUI 및 ScrFI로 Chit1 유전자의 제한 효소 절단 19 를 수행하십시오. ALUI, HpyCH4IV 및 HpyCH4V,와 BstUI, HaeIII, 그리고 MboI와 Chit4 유전자의 Chit2 유전자. Pr1A 유전자의 소화에는 RsaI , DdeI 및 MspI 20을 사용하십시오 .
- 대부분의 독성 균주 (> 90 % 사망률)에 대해 각 유전자에 대한 전기 영동으로 1.5 % 아가 로스 겔에서 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 패턴을 관찰한다. 이것은 M. anisopliae 의 선택을위한 병독성 마커로 사용될 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
수사 중에 Metarhizium, Beauveria 및 Nomuraea 상이한 균주 Metarhizium 균주로서 14 H.의 armigera 펄스 6 무서운 해충 (14)를 제어하기에 더 효과적인 것으로 밝혀졌다 (데이타는 미도시) 6, 다양한 분리 방법에 의해 분리 하였다 , 다른 작물들과 곤충들로부터 Metarhizium 균주들을 분리하기위한 추가 격리가 표적되었다 ( 표 1 ). 얻어진 Metarhizium 분리 균 68 개를 문화적, 형태 학적 특성과 ITS 1-5.8S-ITS 4 sequencing으로 확인 하였다. 실험실 생물 분석에서 H. armigera 의> 90 % 사망률에 기초하여 12 개의 Metarhizium 균주를 포자 생산, 생존력, LC 50 , LT 50 및 ST 50에 대해 추가로 테스트했습니다. 표 2 는 데이터3 개의 잠재적 단리품 인 M34311, M34412 및 M81123; M34412가 가장 우수한 성능의 균주로 판명되었다.
쌀, 수수, 옥수수, 밀 등의 시험 기판 중 쌀 Metarhizium의 경우 최대 포자 균주 지원 (포자 / kg의 60-75 g, 포자 분말 4-4.4 × 10 개 10 포자 / g) .
비둘기 완두에서의 H. armigera 방제 시험 기간 동안 M. anisopliae M34412 오일 및 수성 제제로 각각 78.0 % 및 70.9 %의 효능이 얻어졌다 . M. anisopliae 처리구의 포드 손상은 처리되지 않은 대조구 (23.63 %) 및 화학 처리 된 플롯 (10.24 %)보다 적은 (8.76 %) 것으로 나타났다. 처리되지 않은 대조구의 평균 수율 (q / ha)은 7.31 q / ha이었고, M. anisopliae M34412 처리 후 (14.04 q / ha)보다 낮았다. 화학 물질 처리는 12.78 q / ha의 수율을 나타냈다 ( 표 3 ).
식물 독성 증상을 관찰 한 결과, M. anisopliae 제제를 3 회 분무 한 후에 비둘기 완두 작물에 식물 독성 효과가 나타나지 않았다. 57 개의 수집 된 토양 - 주거 arthropods (들쥐와 거미) 중에서 아무도 감염되지 않았습니다. 590 개의 수집 된 캐노피 - 유인 절지 동물 중에서, Heteroptera (수집 된 절지 동물의 0.3 %)의 두 개체가 M. anisopliae에 감염된 것으로 밝혀졌다 ( 표 4 ). 거미도 Coccinellids도 곰팡이에 굴복하지 않았습니다.
| 토양 (58 격리) | ||
| 격리 | 수확고 | 분리 균수 |
| M1311, M1322, M1333, M2104, M2305, M2416, M2427, M2508, M42014, M45115, M45216, M45317, M79120, M79221, M79322 | 토마토 | 15 명 |
| M3419, M34210, M34311, M34412, M34513, M171264 | 커스터드 애플 | 6 |
| M81123, M91124, M91225, M91326, M91528, M91427, M91629, M91730, M91831, M91932, M111145 | 사탕 수수 | 11 |
| M101133, M101234, M101335, M101436, M101537, M101638, M101739, M101840, M101941, M102042, M102143, M102244 | 브린 잘 | 12 |
| M51118, M51219 | 오크라 | 2 |
| M131150, M141151, M141252, M151153 | 비둘기 완두콩 | 4 |
| M121146, M121247, M121348, M121449 | 병아리 콩 | 4 |
| M183365 | 면 | 1 |
| M193166 | 자와 르 | 1 |
| 곤충 호스트 (10 격리) | ||
| M16255, M16356, M16457, M16558, M16659 | 비둘기 완두콩 기름기 많은 컷웜 | 5 |
| M16154, M16760 | 사탕 수수 - 밀리 버그 | 2 |
| M16861 | 사탕 수수 - 흰색 땅벌레 | 1 |
| M16962 | 사탕 수수 - 딱정벌레 | 1 |
| M161063 | 사탕 수수 피라미다 perpussila | 1 |
표 1. Metarhizium 균주의 기원. 68 개의 Metarhizium 균주는 다른 작물 장 (58 균주)과 작물 장 (10 균주)의 진균류로부터 분리되었다.
| 격리 | 수확량 (g / kg 쌀) | 생존력 (%) | LC 50 (x 103 포자 / mL) | LT 50 (일) | 사망률 (%) | |
| 평균 ± 표준 편차 | 평균 ± 표준 편차 | (기준 기준) | (기준 기준) | (기준 기준) | ||
| M34311 | 60.00 ± 2.64a | 92.00 ± 2.64a | 2.47 (2.26-2.69) | 2 (0.4-10.3) | 3.5 (3.2-3.7) | 96.67 |
| M34412 | 67.00 ± 3.46b | 97.00 ± 1.73a | 2.3 (2.11-2.52) | 1.4 (0.1-1.9) | 3.3 (3.0-3.6) | 96.67 |
| M81123 | 75.00 ± 3.60c | 93.00 ± 1.73a | 2.65 (2.43-2.90) | 5.7 (1.2-26.7) | 3.3 (3.1-3.6) | 95.56 |
| 칼럼 내에서 동일한 문자가 뒤에 오는 숫자는 통계적으로 다릅니다. | ||||||
| ST 50 , 0.1 % (w / v) Tween 80 중 50 % 포자의 침강에 필요한 시간. | ||||||
| 칼럼 내에서 동일한 문자가 뒤에 오는 숫자는 통계적으로 다릅니다. SD, 표준 편차. T80, Tween 80 (0.1 %, w / v). | ||||||
| LC 50 , 14 일 후에 H. armigera 의 50 % 사망을 유발하는 것으로 계산 된 포자의 치명적 농도의 중간 값. | ||||||
| LT 50 , H. armigera 의 50 % 사망을 유발하는 포자의 치명적인 중위 시간. | ||||||
표 2. 최고 성능의 Metarhizium 균주 3 종 선택. H. armigera 3 rd -instar 애벌레의 곤충 생물 검정에서 생산 매개 변수와 성능을 기준으로 선정되었습니다.
| 현장 시험 $ | ||
| 치료 | % 효능 * | 수율 (q / ha) |
| 수성 M. anisopliae M34412 (1012 배 포자 / HA) 500L | 70.93 ± 4.19 | 14.04 |
| 오일 제제 ( M. anisopliae ) (5 x 10 12 포자 / ha) 3 L | 78.02 ± 4.61 | 15.53 |
| 화학 농약 / 농부 연습 (2ml / L, 500L / ha) | 63.43 ± 0.85 | 12.78 |
| 치료되지 않은 관리 | - | 7.31 |
| (농민 참여 프로그램) $$ 시범 재판 | ||
| 치료 | 포드 데미지 % | 수율 (q / ha) |
| 수성 제제 ( M. anisopliae ); 면적 4.2 헥타르 | 15.9 ± 1.26 | 10.75 |
| 오일 제제 ( M. anisopliae ); 면적 0.4 헥타르 | 17.74 | 12.5 |
| 농부 연습; 면적 11ha | 22.72 ± 3.37 | 7.55 |
| 관개 작물 | ||
| $ Randomized Block Design | ||
| * Henderson과 Tilton (1955 년) 이후 | ||
| # HaNPV, H. armigera nucleopolyhedrovirus | ||
| $$ N시범 실험에 참여한 농민 수는 20 명이었습니다. 비둘기 완두 종자 (BSMR - 736)는 농부들에게 비료와 함께 공급되었습니다. 마을 : Deolali Pravara, Tal. 라후리. Dist. A'Nagar (MS) (19.473 ° N 74.6 ° E) | ||
표 3. H. armigera 에 대한 M. anosopliae (M34412) 균주의 현장 성능. M. anisopiae 의 다른 제형의 효능을 현장 조건에서 비둘기 완두에서의 H. armigera 감염에 대한 화학 살충제 처리와 비교 하였다.
| 매개 변수 | 필드 1 | 필드 2 | 필드 3 |
| 플롯 크기 (m) | 12 x 17 | 10 x 10 | 10 x 15 |
| 복제 | 2 | 2 | 2 |
| # 수감 된 함정의 절지 동물 | 20 | 22 개월 | 15 명 |
| M. anisopliae 감염 (함정 함정) | 노스 다코타 | 노스 다코타 | 노스 다코타 |
| # 청소 된 그물 수집에서 절지 동물 | 193 | 171 | 226 |
| M. anisopliae 감염 (스윕 네트 수집) | 노스 다코타 | 노스 다코타 | 0.9 |
| ND, 감지되지 않음 필드 1, 농업 대학, 푸네; 현장 2, NGO 1, Tulapur, Pune; 3 군데, NGO 2, Aalandi, Pune. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1880 년대에, 첫 번째 시도는 스카 랍 비틀 ( Anisoplia austriaca) 과 사탕무 관상어 인 Cleonis punctiventris 21 을 통제하기 위해 Metarhizium 을 사용하려는 첫 시도였다. 이 프로토콜에서 선행 조건 중 하나는 토양 또는 감염된 곤충으로부터 독성 균주를 분리하는 것이 었습니다. 실제로 LC 50 , LT 50 및 ST 50 과 같은 다른 매개 변수는 제품 22 , 23 의 비용 효율성에 크게 기여했습니다. 포자 생산의 최적화를 위해, 포자, 생존의 수, 독성 사이의 미묘한 균형은 24 maintainend했다.
농업은 대량 생산 저가 제품이기 때문에 최종 사용자의 품질 인지도, 수용성 및 포자 수명이 주요 관심사입니다. 숙주 특이성은 비 표적 효과를 피하는데 유리하다.= "xref"> 14. 인공 배지 곤충 숙주 통한 이따금 통로에서 반복 계대의 회피는 필드 (22) 내의 Metarhizium 포자의 독성 및 효능을 유지 하였다. 제시된 접근법에는 한계점이있다 : 준비는 경제적 한계점 수준이 식물 당 2-3 마리의 유충이고, 포자의 발아가 높은 습기와 비교적 낮은 온도의 존재 하에서 최대 일 때 더 효과적이다.
여기에서 곰팡이 제제는 접촉 후 효과적이지만 세균성 (Bt) 및 바이러스 성 제제 (-HaNPV)는 소화시에만 효과적입니다. 품질 제어 매개 변수와 관련하여, 포자의 생존 능력 이외에, 큐리클 분해 효소 활성 및 동일한 효소 유전자의 특정 제한 소화 패턴에 기초한 생화학 적 및 분자 적 마커가 포자의 유효성을 보장 할 수 있다는 것이 제안되었다 필드. 품질 관리권장되는 매개 변수는 다음과 같다 : (a) 포자 발아력으로 측정되는 포자 생존 능력 (28 ° C 및 70-80 % RH에서 16 시간 후 PDA에서> 90 %이어야 함); (b) H. armigera의 사망률 (실험실 생물 분석에서 포자가 1 x 10 7 이상인 경우 90 % 이상이어야 함); (c) 72 시간 후 키틴 배지에서의 키티나아제 활성 (> 3.5 x 10-3 U / mL이어야 함); 및 (d) 키틴 분해 효소 유전자의 PCR-RFLP 패턴. 이 원고는 본질적으로 곤충 병원성 균류의 분리에서부터 현장의 표적 해충에 대한 효능 자료의 생성에 이르기까지의 프로토콜을 기술하고있다. 이것은 인도의 중앙 살충제위원회에 생물 농약 제형을 등록하고, 결국 상업화를위한 전제 조건 중 하나입니다.
여기에 설명 된 일련의 실험은 잠재적 인 마이 코민 살충제의 개발에 유용 할 것입니다. 또한, 포자를 추출한 후, 폐기물 균사체 바이오 매스를식물 성장 촉진 또는 건강 관리 응용을위한 키토산 또는 글루코사민 고분자의 분리.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 뉴 델리 생명 공학과의 ISCB (Indo-Swiss Collaboration in Biotechnology) 프로그램과 스위스 베른 (Berne)의 스위스 개발 및 협력기구에서 협력자가 기여한 점을 인정합니다. Vandana Ghormade, Pallavi Nahar, Priya Yadav, Shuklangi Kulkarni, Manisha Kapoor, Santosh Chavan, Ravindra Vidhate, Shamala Mane 및 Abhijeet Lande를 포함한 마이코 살충제 개발에 참여한 프로젝트 학생 및 직원의 공헌을 인정합니다. EKP와 SGT는 인도의 대학 보조금위원회와 인도의 과학 산업 연구 협의회 (CSIR)에서 연구 펠로우 십에 감사를 표합니다. MVD는 뉴 델리 명예 과학자 계획 산업 과학 연구위원회 (Council of Industrial and Scientific Research)의지지를 표합니다. 저자들은 ISCB 및 SBIRI 프로그램에 따른 재정적 지원에 대해 인도 뉴 델리의 생물 공학과 (Department of Biotechnology)에 감사드립니다. 우리는 감사하고 있습니다.검토 자에게 제공합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Hi-Media | RM666 | Reagent |
| Ammonium sulphate | Thomas Baker | 11645 | Reagent |
| DNA analyzer | Applied biosystem | ABI prism 3730 | Instrument |
| DNA islation kit | Qiagen | 69104 | Reagent |
| Dodine | Sigma | 45466 | Reagent |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28604 | Reagent |
| Glucose | Hi-Media | GRM077 | Reagent |
| Knapsac sparyer | Kaypee | HY-16L (1004) | Instrument |
| Peptone | Hi-Media | RM006-500G | Reagent |
| Polypropylene vials | Laxbro | SV-50 | Plasticware |
| Potato dextrose agar (PDA) | Hi-Media | M096-500G | Reagent |
| Tween-80 | SRL | 28940 | Reagent |
| Ultra low volume sparyer | Matabi | INSECDISK | Instrument |
| Unicorn-bags | Unicorn | UP-140024-SMB | Autoclavalbe bag for SSF |
| Yeast extract | Hi-Media | RM027-500G | Reagent |
| Chromas 2.1 | software |
References
- Aktar, M. W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
- Dhaliwal, G. S., Jindal, V., Mohindru, B. Crop losses due to insect pests: Global and Indian scenario. Indian J Entomol. 77 (2), 165-168 (2015).
- Popp, J., Peto, K., Nagy, J. Pesticide productivity and food security. A review. Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2015).
- van Lenteren, J. C., Manzaroli, G. Evaluation and use of predators and parasitoids for biological control of pests in greenhouses. Integrated pest and disease management in greenhouse crops. Albajes, R., Gullino, M. L., van Lenteren, J. C., Elad, Y. , Kluwer. Dordrecht, The Netherlands. 183-201 (1999).
- Charnley, A. K., Collins, S. A. Entomopathogenic fungi and their role in pest control. The Mycota IV: Environmental and Microbial Relationships. Kubicek, C. P., Druzhinina, I. S. , 2nd, Springer-Verlag. Berlin. 159-187 (2007).
- Deshpande, M. V., et al. Comparative evaluation of indigenous fungal isolates, Metarhizium anisopliae M34412, Beauveria bassiana B3301 and Nomuraea rileyi N812 for the control of Helicoverpa armigera (Hüb.) on pulses. Proceeding of the international workshop on entomopathogenic fungi - a valuable alternative to fight against insect pests. MV, D. eshpande , National Chemical Laboratory. Pune, India. 51-59 (2004).
- Roberts, D. W., Hajek, A. E. Entomopathogenic fungi as bioinsecticides. Frontiers in industrial mycology. Leathan, G. F. , Chapman & Hall. New York, NY. 144-159 (1992).
- Goettel, M., Inglis, G. D. Fungi: Hyphomycetes. Manual of techniques in insect pathology. Lacey, L. A. , Academic Press. USA. 213-245 (1996).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J., et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR-Protocols: A guide to methods and applications. Innis, M. A., et al. , Academic Press, Inc. San Diego. USA. 315-322 (1990).
- Basic Local Alignment Search Tool. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST (2017).
- Ignoffo, C. M., Futtler, B., Marston, N. L., Hostetter, D. L., Dickerson, W. A. Seasonal incidence of the entomopathogenic fungus Spicaria rileyi associated with noctuid pests of soybeans. J Invertebr Pathol. 25 (1), 135-137 (1975).
- Abbott, W. S. A method for computing the effectiveness of an insecticide. J Econ Entomol. 18 (2), 265-267 (1925).
- Nahar, P. Development of biocontrol agents for the control of pests in agriculture using chitin metabolism as target. , PhD thesis submitted to Department of Microbiology, University of Pune 137 (2004).
- Kulkarni, S. A., et al. Comparison of Metarhizium isolates for biocontrol of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) in chickpea. Biocontrol Sci Tech. 18 (8), 809-828 (2008).
- Jeffs, L. B., Khachatourians, G. G. Estimation of spore hydrophobicity for members of the genera Beauveria, Metarhizium, and Tolypocladium by salt-mediated aggregation and sedimentation. Can J Microbiol. 43 (1), 23-28 (1997).
- Henderson, C. F., Tilton, E. W. Tests with acaricides against the brow wheat mite. J Econ Entomol. 48 (2), 157-161 (1955).
- Hassani, M. Development and proving of biocontrol methods based on Bacillus thuringiensis and entamopathogenic fungi against the cotton pests Spodoptera littoralis, Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) and Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae). , PhD thesis submitted to Justus-Liebig-University Giessen, Germany (2000).
- Enkerli, J., Ghormade, V., Oulevey, C., Widmer, F. PCR-RFLP analysis of chitinase genes enable efficient genotyping of Metarhizium anisopliae var. anisopliae. J Invert Pathol. 102 (2), 185-188 (2009).
- Bidochka, M. J., Melzer, M. J. Genetic polymorphism in three subtilisin-like protease isoforms (Pr1A, Pr1B and Pr1C) from Metarhizium strains. Can. J. Microbiol. 46 (12), 1138-1144 (2000).
- McCoy, C. W., Samson, R. A., Boucias, D. G. Entomogenous fungi. Handbook of natural pesticides, Microbial insecticides, Part A. Entomogenous protozoa and fungi. Ignoffo, C. M., Mandava, N. B. , CRC Press. Boca Raton, FL. 151-236 (1988).
- Nahar, P. B., et al. Effect of repeated in vitro sub-culturing on the virulence of Metarhizium anisopliae against Helicoverpa armigera (Lepidoptera Noctuidae). Biocontrol Sci Tech. 18 (4), 337-355 (2008).
- Kapoor, M., Deshpande, M. V. Development of mycoinsecticide for the control of insect pests: Issues and challenges in transfer of technology from laboratory to field. Kavaka. 40, 45-56 (2013).
- Deshpande, M. V. Mycopesticide Production by Fermentation: Potential and Challenges. Crit Rev Microbiol. 25 (3), 229-243 (1999).
