Summary
Ici, nous signalons les différentes étapes impliquées dans le développement fondé sur la connaissance d'un mycoinsecticide efficace, y compris l'isolement, l'identification, le dépistage et la sélection du champignon entomopathogène "meilleur ajustement", Metarhizium anisopliae , pour le contrôle des insectes nuisibles en agriculture .
Abstract
Une préoccupation majeure lors du développement de mycoinsecticides commerciaux est la vitesse de destruction par rapport à celle des insecticides chimiques. Par conséquent, l'isolement et le dépistage pour la sélection d'un champignon entomopathogène hautement virulent à action rapide sont des étapes importantes. Les champignons entomopathogènes, tels que Metarhizium, Beauveria et Nomurea , qui agissent par contact, sont mieux adaptés que Bacillus thuringiensis ou le virus de la nucléopolisée (VAN), qui doit être ingéré par l'insecte nuisible. Dans le présent travail, nous avons isolé 68 souches de Metarhizium d'insectes infectés en utilisant une méthode de dilution et d'appât du sol. Les isolats ont été identifiés par l'amplification et le séquençage de la région d'ADNr ITS1-5.8S-ITS2 et 26S. La souche la plus virulente de Metarhizium anisopliae a été sélectionnée en fonction de la concentration létale médiane (LC 50 ) et du temps (LT 50 ) obtenue dans des essais biologiques d'insectes contre les larves III-stade de Helicoverpa armigera.La production en masse de spores par la souche sélectionnée a été effectuée avec une fermentation à l'état solide (SSF) en utilisant le riz comme substrat pendant 14 jours. Les spores ont été extraites de la biomasse sporulée en utilisant 0,1% de tween-80 et différentes préparations de spores ont été préparées. Des essais sur le terrain des formulations pour le contrôle d'une infestation par H. armigera chez des pois pigeons ont été réalisés selon la conception du bloc aléatoire. Les niveaux de contrôle d'infestation obtenus avec des formulations huileuses et aqueuses (78,0% et 70,9%, respectivement) étaient meilleurs que les 63,4% obtenus avec un pesticide chimique.
Introduction
À partir de l'introduction de pesticides organochlorés dans les années 40 en Inde, l'utilisation de pesticides a augmenté de plusieurs fois 1 , les ravageurs de cultures coûtent toujours des milliards de roupies 2 par année en termes de perte de rendement dans la production agricole. L'utilisation répandue et non judicieuse des pesticides synthétiques constitue une menace permanente pour l'environnement et la santé humaine 1 . L'utilisation indiscriminée de pesticides conduit à des résidus dans le sol et à l'épuisement des prédateurs naturels de parasites. Il sert également de puissante pression de sélection pour modifier la composition génétique d'une population de nuisibles, ce qui conduit au développement de la résistance 1 . Malgré les énormes avantages de la révolution verte, qui nécessitait des intrants élevés, comme les engrais et les pesticides, les ravageurs continuent d'être une contrainte biologique majeure. Une estimation générale des pertes annuelles enregistrées en Inde et dans le monde est de 12 milliards USDEf>> 2 et USD 2,000 milliards 3 , respectivement.
Lorsque les pesticides chimiques ont des effets néfastes lorsqu'ils sont utilisés pour contrôler les insectes nuisibles, il devient impératif de rechercher d'autres méthodes écologiquement rationnelles, fiables, économiques et durables. Le contrôle biologique offre une alternative appropriée et comprend l'utilisation de parasites, de prédateurs et de pathogènes microbiens 4 . Les champignons, par exemple, sont connus pour infecter une large gamme d'insectes nuisibles, y compris les lépidoptères, les hyménoptères, les coléoptères et les diptères, entraînant souvent des épizooties naturelles. En outre, contrairement à d'autres agents de lutte contre les insectes bactériens et viraux, le mode d'action des champignons pathogènes d'insectes est par contact 5 . Ces champignons comprennent un groupe hétérogène de plus de 100 genres, avec environ 750 espèces signalées chez différents insectes. Les agents pathogènes fongiques importants sont: Metarhizium sp., Beauveria sP. Nomuraea rileyi , Lecanicillium lecanii et Hirsutella sp., Pour n'en citer que 6 . M. anisopliae (Metchnikoff) Sorokin est le deuxième champignon entomopathogène le plus utilisé dans le contrôle biologique. Il est connu d'attaquer plus de 200 espèces d'insectes 7 .
Dans cette étude, les différents stades impliqués dans le développement fondé sur le savoir d'un mycopesticide utilisant M. anisopliae sont présentés. Cela comprend: 1) l'identification d'une source ( c'est-à-dire des insectes moustiques ou du sol) pour les entomopathogènes virulents, 2) l'identification et la sélection de l'entomopathogène, 3) des stratégies pour maintenir leur nature et leur efficacité virulentes dans l'essai biologique du laboratoire et sur le terrain 4 ) La formulation rentable des propagules infectieuses, 5) le développement de paramètres de contrôle de qualité uniques pour la préparation virulente, et 6) la bioprospection et l'ajout de valeur.
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Protocol
1. Isolation des champignons entomopathogènes
- Méthode de dilution du sol
- Recueillir les échantillons de sol et les insectes mycosés de différents champs de cultures ( tableau 1 ). Isoler les champignons entomopathogènes des échantillons de sols en utilisant la méthode de dilution du sol 8 .
Note: Dans cette étude, des échantillons ont été prélevés sur les Pune (18 ° 31'13''N, 73 ° 51'24''E) et Buldhana (19 ° 58'36''N 76 ° 30'30''E ) Districts, Maharashtra, Inde. - Peser 10 g de chaque échantillon de sol et les ajouter séparément à 90 ml de Tween-80 stérile à 0,1% (p / v).
- Mélanger soigneusement les échantillons en utilisant un agitateur magnétique pendant 60 minutes pour libérer les spores adhérant aux particules du sol.
- Après mélange, étaler des aliquotes de 100 à 200 μL de chaque échantillon sur un milieu sélectif contenant (g / L): de la peptone, 10; Glucose, 20; Agar, 18; Streptomycine, 0,6; Tétracycline, 0,05; CycLohexamide, 0,05; Et la dodine, 0,1 ml; PH 7,0 9 . Incuber les plaques à 28 ° C pendant 3 à 7 jours.
- Sélectionnez et sous-culturez les colonies sporulantes individuelles sur le même milieu pour obtenir des cultures pures.
- Recueillir les échantillons de sol et les insectes mycosés de différents champs de cultures ( tableau 1 ). Isoler les champignons entomopathogènes des échantillons de sols en utilisant la méthode de dilution du sol 8 .
- Des insectes mycosés
- Recueillez les insectes mycosés du champ.
Note: Un corps larvaire difficile est susceptible d'être infecté par un champignon entomopathogène. Avec une infection bactérienne ou virale, le corps d'insecte mort est doux. - Recueillez des insectes vivants avec des comportements anormaux, une mauvaise coordination et des mouvements brusques.
- Gardez les insectes jusqu'à la mort, puis transférez-les dans des chambres humides pour plus de mycoses et de sporulation, le cas échéant, à 28 ° C et 70-80% HR.
- Étaler les spores des cadavres sporulés sur le milieu sélectif susmentionné et obtenir des cultures pures en subissant davantage de sous-culture 2-3 fois sur le même milieu.
- Recueillez les insectes mycosés du champ.
- Méthode d'appât
- Dans unUn flacon (3,85 x 6,0 cm) contenant 60 g d'échantillon de sol, ajouter 4 larves de pyrale ( Corcyra cephalonica ) et garder les flacons à 25 ± 2 ° C pendant une période de 14 jours.
- Retournez tous les jours les flacons à l'envers. Après 14 jours, filtrer les échantillons de sols pour la présence de larves de mites de riz mycosées. Isoler le champignon entomopathogène en étalant les spores des cadavres sporulés sur un milieu sélectif.
- Après avoir obtenu des cultures pures, transférez les isolats à l'agar de dextrose de pomme de terre (PDA) et incupez à 28 ° C et 70-80% d'HR pendant 7 jours pour permettre la sporulation. Après la sporulation, maintenir les cultures de la mère à 8 ° C jusqu'à l'utilisation.
2. Identification des champignons entomopathogènes
- Identifier les champignons entomopathogènes en observant les caractéristiques morphologiques ( c.-à-d. La taille et la forme asexué des spores et l'agencement des spores sur les conidiophores); Isolats de 3 genres principaux, Metarhizium , Beauv Eria et Nomuraea , peuvent être identifiés.
- Pour l'identification moléculaire des souches de Metarhizium , extraire l'ADN génomique de la biomasse mycéliale en utilisant un kit d'isolement d'ADN; Suivez les instructions du fabricant (voir la table des matières ). Vérifier la qualité de l'ADN génomique en réalisant une électrophorèse sur un gel d'agarose à 0,8%.
- PCR-amplifier la région ARDNA ITS1-5.8S-ITS2 et 26S. Utilisez l'ADN génomique en tant que modèle, avec les amorces ITS1 en avant (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) et ITS4 inverse (TCCTCCGCTTATTGATATGC) 10 .
- Gel-elute et purifier les amplicons de taille attendue en utilisant un kit d'extraction de gel; Suivez les instructions du fabricant (voir la table des matières ). Quantifier l'amplicon purifié et la séquence.
- Lisez et modifiez les séquences à l'aide du logiciel et effectuez une recherche BLAST des séquences de nucléotides dans la bibliothèque de données NCBI GenBank pour analyser l'homologie étroite= "Xref"> 11.
- Déposez les séquences d'isolats entamopathogènes identifiés dans la base de données NCBI GenBank pour récupérer les numéros d'accès.
3. Criblage d'isolats de Metarhizium contre H. armigera
- L'élevage d'insectes
- Établir la culture initiale de H. armigera en recueillant des larves saines et des pupes de l'insecte du champ.
- Pour l'élevage, cultiver les larves individuellement dans des flacons de polypropylène stériles (3,85 x 6,0 cm, capacité de 50 ml) contenant des morceaux de okra désinfectés avec 0,5% (v / v) d'hypochlorite de sodium pendant 10 min 12 .
- Recueillir les œufs d'insectes posés pendant l'élevage et les stériliser avec un hypochlorite de sodium à 0,5% (v / v).
- Maintenir les larves à 25 ± 2 ° C et 65 ± 5% HR.
- Bioessai d'insectes
Note: Pour l'essai biologique des insectes, la production de spores,Et les études de performance sur le terrain, les premières sous-cultures de souches de Metarhizium provenant de larves mycosées de H. armigera ont été utilisées, sauf indication contraire.- Pour les essais biologiques d'insectes, utilisez des larves III-stade de H. armigera .
- Trempez un ensemble de 30 larves en trois fois individuellement dans une suspension de spores de 10 mL d'isolats de Metarhizium (1 x 10 7 spores / mL, sauf mention contraire, viabilité> 90%) pendant 5 s.
- Après traitement, transférez chaque larve individuellement dans un flacon stérile séparé pour éviter le cannibalisme. Dans chaque flacon, ajouter le papier filtre N ° 1 humide Whatmann et un morceau de okra désinfecté en tant qu'alimentation. Changez le papier et passez les jours alternatifs.
- Garder les larves à 25 ± 2 ° C, 65 ± 5% HR et 16: 8 lumière: sombre pendant 14 jours ou jusqu'à leur mort.
- Transférer les larves mortes dans des plaques de Petri stériles contenant des écouvillons de coton humides et les conserver à 28 ° C et 70-80% d'HR pendant 3-7 jours pour permettre les mycéliums et les sporesFormation sur les cadavres.
- Pour un contrôle, traiter un ensemble de 30 larves en triple avec 0,1% (p / v) de Tween-80 dans de l'eau distillée stérile.
- Effectuer toutes les expériences en trois exemplaires en utilisant des suspensions de spores fraîchement préparées. Collectez et regroupez les données sur le pourcentage de mortalité de trois expériences pour obtenir des valeurs moyennes. Calculer le pourcentage de mortalité corrigé en utilisant la formule 13 d' Abbott.
- Effectuez les expériences en utilisant une mise en page de conception de bloc complet aléatoire (RCBD), chaque traitement contenant un ensemble de 30 larves en trois exemplaires. Basé sur le pourcentage de mortalité contre H. armigera , sélectionnez les isolats de Metarhizium pour un nouveau dépistage du meilleur isolat pour la production commerciale.
- Sélectionnez les isolats démontrant> 90% de mortalité contre les larves de H. armigera III-instar.
Note: Ici, 12 isolats ont été sélectionnés. - Déterminer le LT 50 de ces isolats et sélectionner le démon isoléClasser le meurtre le plus rapide (en moins de temps).
Note: Ici, 5 isolats ont été choisis parmi les 12 isolats les plus puissants. - Déterminer les valeurs LC 50 des isolats sélectionnés en utilisant quatre concentrations différentes (c.-à-d. 1 × 10 3 , 1 × 10 5 , 1 × 10 7 et 1 × 10 9 spores / mL) de suspension de spores.
- Déterminer la LC 50 des isolats de Metarhizium contre les larves de III-stade de H. armigera afin d'augmenter la possibilité d'identifier la différence de virulence des isolats avec des valeurs de mortalité élevées qui pourraient ne pas être détectés si une seule dose est utilisée.
4. Production de spores d'un isolat Metarhizium pour études sur le terrain
- Production de spores de Metarhizium par SSF
- Pour SSF, préparer l'inoculum en ajoutant 2 x 10 7 spores des isolats Metarhizium à200 ml de YPG (0,3% d'extrait de levure, 0,5% de peptone et 1,0% de glucose) de milieu. Incuber les flacons à 28 ° C avec agitation (180 tr / min) pendant 48 h.
- Pour la production en masse de spores par SSF, utiliser le riz comme substrat, sauf indication contraire.
- Pour SSF, remplissez les sacs en autoclave (type 14 avec un seul filtre microvente de 0,5 μm, 2 kg de capacité, 64 × 36 cm) avec 2 kg de riz. Ajouter 1 000 ml d'eau distillée au riz dans les sacs et tremper durant la nuit 14 . Autoclavez les sacs avec le riz trempé à 121 ° C pendant 45 minutes 15 .
- Inoculer les sacs avec un inoculum mycélien de 48 h (10% d'inoculum, 200 mL pour 2 kg de riz) et incuber à 28 ° C et 70-80% d'HR pendant 14 jours.
- Récolter les spores par extraction liquide avec 0,1% de Tween-80. Pour cela, ajouter le contenu du sac à 0,1% de Tween-80 (3 L par 1 kg de riz), bien mélanger, séparer les spores du liquide par centrifugation et sécher à 37 ° C pendant 2 jours. < / Li>
- Alternativement, sécher les sachets contenant du riz avec les spores et des mycéliums à 37 ° C pendant 2 jours pour réduire la teneur en humidité (<20%). Récoltez les spores à l'aide d'un myco-harvester ou vibro-sifter.
- Études de viabilité
- Déterminer le pourcentage de viabilité des spores récoltées en utilisant différentes méthodes 15 . Pour cela, préparer les suspensions de spores dans Tween-80 à 0,1% (p / v) et ajuster le nombre à 1 × 10 3 spores / mL.
- Répartir les suspensions de spores (0,1 ml) sur des plaques de PDA en trois exemplaires et incuber à 28 ° C et 70 à 80% d'HR pendant 72 h.
- Comptez manuellement les colonies isolées et déterminez le nombre total viable de l'échantillon respectif.
- Taux de sédimentation des spores
- Pour un dosage uniforme, la suspension homogène de spores est requise; Déterminer les taux de sédimentation des spores pour les isolats de Metarhizium comme décrit"Xref"> 16. Vérifier les taux de sédimentation des spores dans du sulfate d'ammonium 0,2 M et 0,1% de Tween-80.
- Ajustez le nombre de la suspension de spores à ~ 7 × 10 7 spores / mL pour obtenir une absorbance initiale de 0,6 à 540 nm. Permettre aux cuvettes de rester intactes pendant 6 h pour les spores à régler.
- Enregistrez l'absorbance jusqu'à 6 h. Exprimez le taux de sédimentation en pourcentage et calculez le temps requis pour une sédimentation à 50% (ST 50 ). Répétez l'expérience trois fois en utilisant des suspensions de spores fraîchement préparées.
5. Études de la performance sur le terrain de la capacité de l'isolat de M. anisopliae sélectionné pour contrôler H. armigera dans les pigeons
- Formulation en poudre mouillable de M. anisopliae M 34412 spores
- Préparer la formulation en poudre mouillable de 2,5 à 5% en mélangeant les spores avec du talc.
- Ajustez le compte final viable (TVC) à 1 x 10 12 spoRes par kg de formulation.
- Études de performance sur le terrain de M. anisopliae M 34412 spores
- Pour les études de performance sur le terrain de la capacité de l'isolat de M. anisopliae sélectionné pour contrôler l'infestation par H. armigera chez les pois choux, utilisez un RCBD avec quatre répétitions.
Note: ici, interprété à Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth (MPKV), Rahuri (19.3927 ° N, 74.6488 ° E). - Utilisez deux formulations de pulvérisation différentes, une formulation d'huile de spores (5 x 10 12 spores / 3 L de diesel: huile de tournesol, 7: 3) et une formulation aqueuse dans Tween-80 (0,1%). Pulvériser la formulation d'huile avec un pulvérisateur ultra-faible volume (ULV) (70 min; 3 L / ha), la formulation aqueuse avec un pulvérisateur à sac à dos (5 x 10 12 spores, 500 L / ha).
Note: Ici, les populations de larves ont été enregistrées un jour avant la pulvérisation et 3 et 7 jours après l'application de chaque pulvérisation à 5 plantes sélectionnées au hasard. La population totale était tRansformé à la racine carrée de n + 1 pour l'analyse statistique.- Selon les pratiques agricoles pour la culture du pois pigeon, effectuez la première pulvérisation entre 10 et 15 jours après la ponte et 2 fois de plus avec un intervalle de 14 jours. Effectuer la pulvérisation entre 16:00 et 18:00 h IST. Surveillez la direction du vent et, si nécessaire, utilisez des rideaux en tissu pour éviter la dérive des spores sur les parcelles voisines.
- À titre de comparaison, pulvériser les insecticides chimiques avec un pulvérisateur rotatif à main.
- Déterminer la persistance de l'inoculum sur le terrain en recueillant les larves de H. armigera 0, 3, 5, 7 et 14 jours après la pulvérisation.
- Gardez ces larves sous observation pendant une période de 14 jours et après la mort, transférez-les dans un flacon en plastique contenant du papier filtre humide. Incuber à 25 ± 2 ° C et 70 ± 10% HR pour observer la mycose.
- Déterminer la persistance de l'inoculum sur la population larvaire basée sur la p Les données sur la mortalité des larves recueillies sur le terrain après la pulvérisation.
- Évaluez les études sur le terrain en fonction du pourcentage d'efficacité 17 , des dommages causés par les pod et du rendement en pourcentage 18 .
Remarque: Ici, les données pour les paramètres, telles que la température, l'humidité, la vitesse du vent (km / h), l'ensoleillement (h), les précipitations (mm), les jours pluvieux et l'évaporation (mm) ont été enregistrées lors d'un essai à un Université agricole (Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth, Rahuri, 19.3927 ° N, 74.6488 ° E).
- Pour les études de performance sur le terrain de la capacité de l'isolat de M. anisopliae sélectionné pour contrôler l'infestation par H. armigera chez les pois choux, utilisez un RCBD avec quatre répétitions.
- Programme participatif des agriculteurs
- Sélectionnez le nombre d'agriculteurs pour les essais de démonstration. Fournir les graines de pois chiches (BSMR - 736) ainsi que des engrais aux agriculteurs.
Note: Dans cette étude, 20 agriculteurs ont été impliqués. Village: Deolali Pravara, (19.473 ° N 74.6 ° E). - Utilisez les mêmes formulations de pulvérisation et le nombre de sprays que dans l'étape 5.2.
- Sélectionnez le nombre d'agriculteurs pour les essais de démonstration. Fournir les graines de pois chiches (BSMR - 736) ainsi que des engrais aux agriculteurs.
- Observez l'effet de la pulvérisation de mycoinsecticide, le cas échéant, sur les feuilles de pois de pigeon.
- Recueillir les arthropodes résiduaires du sol et les insectes habités par les feuilles 1 jour après chaque traitement dans les parcelles non traitées et dans les parcelles traitées avec M. anisopliae .
- Recueillir les arthropodes résiduaires du sol avec des pièges pièges dans les 24 h après le traitement et collecter les insectes habités par les feuilles avec un filet de balayage le matin suivant le traitement ( c.- à-d. 15 à 18 heures après le traitement).
- Conservez-les individuellement dans des boîtes en plastique cylindriques de diamètre 3,5 cm et des hauteurs de 4,0 cm. Vérifiez quotidiennement les insectes et les nourrissez avec les aliments appropriés.
- Notez la présence de M. anisopliae , si vous le souhaitez, et isolez le champignon.
7. Identification des paramètres de contrôle de la qualité
- Vérifier la viabilité des spores en mesurant la germination des spores sur PDA à 28 °; C.
- Mesurez les activités de l'enzyme de dégradation des cuticules, telles que la chitinase, la chitine désacétylase, la chitosanase, la protéase et la lipase, produites dans les milieux YPG et chitine, comme décrit précédemment 15 .
- Déterminer le pourcentage de mortalité de H. armigera dans un essai biologique de laboratoire 15 .
- Utiliser des marqueurs moléculaires, comme un modèle PCR-RFLP de Chitinases ( Chit 1 , 2 et 4 ) et des gènes de protease ( Pr1A ), comme attributs de virulence pour M. anisopliae .
- Extraire l'ADN génomique de la biomasse du mycélium en utilisant un kit d'isolement d'ADN 15 . PCR-amplifier les fragments de gène Chit1 et Chit2 à l'aide d'ADN génomique en tant que modèle, avec les paires d'amorces Chit1F / Chit1R (CTCTGCAGGCCACTCTCGGT / AGCCATCTGCTTCCTCATAT) et Chit2F / Chit2R (GACAAGCACCCGGAGCGC / GCCTTGCTTGACACATTGGTAA). Pour Chit4 , utilisez la paire d'amorces Chit4F / Chit4R (ATCCGGAGAGCACGGCTAC / CTTGGATC CGTCCCAGTTG).
- Pour l'amplification du gène Pr1A, utilisez la paire d'amorces METPR2 et METPR5 (AGGTAGGCAGCCAGACCGGC / TGCCACTATTGGCCGGCGCG).
- Effectuer la digestion de restriction 19 du gène Chit1 avec BsaJI, BstUI et ScrFI; du gène Chit2 avec AluI, HpyCH4IV, et HpyCH4V et du gène Chit4 avec BstUI, HaeIII, et Mbol. Pour la digestion du gène PR1A, utilisez Rsa, Ddel et MspI 20.
- Observer le modèle de polymorphisme de longueur de fragment de restriction (RFLP) sur 1,5% de gel d'agarose par électrophorèse pour chaque gène pour la plupart des souches virulentes (> 90% de mortalité); Cela peut être utilisé comme marqueur de virulence pour la sélection de M. anisopliae .
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Representative Results
Au cours des recherches, différentes souches de Metarhizium, Beauveria et Nomuraea ont été isolées par divers procédés d'isolement (données non présentées) 6 , 14 Comme les souches de Metarhizium étaient plus efficaces pour contrôler H. armigera , un ravageur terrible dans les légumineuses 6 , 14 , D'autres isolations ont été ciblées pour isoler les souches de Metarhizium de différents champs de cultures et d'insectes ( tableau 1 ). Le total de 68 isolats de Metarhizium obtenus a été identifié par des caractéristiques culturelles et morphologiques et par le séquençage ITS 1-5.8S-ITS 4. Sur la base de la mortalité> 90% de H. armigera dans les essais biologiques de laboratoire, 12 isolats de Metarhizium ont encore été testés pour la production de spores, la viabilité, LC 50 , LT 50 et ST 50 . Le tableau 2 décrit les donnéesPour 3 isolats potentiels, M34311, M34412 et M81123; M34412 a été considéré comme l'isolat le plus performant.
Parmi les substrats testés, comme le riz, le sorgho, le maïs et le blé, le riz a soutenu la sporulation maximale dans le cas des isolats de Metarhizium (60-75 g de spores / kg; 4-4.4 x 10 10 spores / g de poudre de spores) .
Au cours de l'essai sur le terrain pour le contrôle de H. armigera dans les pigeons, 78,0% et 70,9% d'efficacité ont été obtenus avec l'huile de M. anisopliae M34412 et les formulations aqueuses, respectivement . On a constaté que les dégâts des gousses dans les parcelles traitées par M. anisopliae étaient moins élevés (8,76%) que dans les parcelles de contrôle non traitées (23,63%) et les parcelles traitées chimiquement (10,24%). Le rendement moyen (q / ha) dans le témoin non traité était de 7,31 q / ha, ce qui était inférieur à celui du traitement par M. anisopliae M34412 (14,04 q / ha). Le traitement par produit chimique a donné un rendement de 12,78 q / ha ( tableau 3 ).
Les observations enregistrées pour les symptômes de phytotoxicité ont révélé qu'aucun traitement n'a montré d'effet phytotoxique sur la culture du pigeon après 3 pulvérisations de formulation de M. anisopliae . Sur 57 arthropodes recueillis sur le sol (criquet et araignées), aucun n'a été infecté. Sur 590 arthropodes collectifs habités, deux individus de l'ordre, Heteroptera (= 0,3% des arthropodes collectés) ont été infectés par M. anisopliae ( tableau 4 ). Ni les araignées ni les Coccinellides n'ont succombé au champignon.
| Sol (58 isolats) | ||
| Isoler N ° | Surgir | Nombre d'isolats |
| M1311, M1322, M1333, M2104, M2305, M2416, M2427, M2508, M42014, M45115, M45216, M45317, M79120, M79221, M79322 | Tomate | 15 |
| M3419, M34210, M34311, M34412, M34513, M171264 | Nouilles | 6 |
| M81123, M91124, M91225, M91326, M91528, M91427, M91629, M91730, M91831, M91932, M111145 | Canne à sucre | 11 |
| M101133, M101234, M101335, M101436, M101537, M101638, M101739, M101840, M101941, M102042, M102143, M102244 | Brinjal | 12 |
| M51118, M51219 | Gombo | 2 |
| M131150, M141151, M141252, M151153 | Pigeon | 4 |
| M121146, M121247, M121348, M121449 | Pois chiche | 4 |
| M183365 | Coton | 1 |
| M193166 | Jawar | 1 |
| Hôte d'insectes (10 isolats) | ||
| M16255, M16356, M16457, M16558, M16659 | Pommade à la graisse grise | 5 |
| M16154, M16760 | Insecte de canne à sucre | 2 |
| M16861 | Grug blanc à la canne à sucre | 1 |
| M16962 | Caoutchouc-coléoptère | 1 |
| M161063 | Sugarcane-Pyrilla perpussila | 1 |
Tableau 1. Origine des souches de Metarhizium . Les 68 souches de Metarhizium ont été isolées de différents champs de culture (58 souches) et des insectes mycosés des champs de culture (10 souches).
| Isoler | Rendement (g / kg de riz) | Viabilité (%) | LC 50 (x 103 spores / mL) | LT 50 (jours) | Mortalité (%) | |
| Moyenne ± SD | Moyenne ± SD | (Limite Fiducial) | (Limite Fiducial) | (Limite Fiducial) | ||
| M34311 | 60,00 ± 2,64a | 92,00 ± 2,64a | 2,47 (2,26-2,69) | 2 (0,4-10,3) | 3,5 (3,2-3,7) | 96,67 |
| M34412 | 67,00 ± 3,46b | 97,00 ± 1,73a | 2.3 (2.11-2.52) | 1,4 (0,1-1,9) | 3.3 (3.0-3.6) | 96,67 |
| M81123 | 75.00 ± 3.60c | 93,00 ± 1,73a | 2,65 (2,43-2,90) | 5,7 (1,2-26,7) | 3.3 (3.1-3.6) | 95.56 |
| Les chiffres suivis par la même lettre dans la colonne ne sont pas statistiquement différents. | ||||||
| ST 50 , temps requis pour la sédimentation de 50% de spores dans Tween 80 à 0,1% (p / v). | ||||||
| Les chiffres suivis par la même lettre dans la colonne ne sont pas statistiquement différents. SD, écart type. T80, Tween 80 (0,1%, p / v). | ||||||
| LC 50 , la concentration médiane létale des spores calculée pour causer une mortalité de 50% de H. armigera après 14 jours. | ||||||
| LT 50 , le temps mortel médian des spores calculé pour provoquer une mortalité de 50% de H. armigera . | ||||||
Tableau 2. Sélection de trois isolats de Metarhizium les plus performants. H. armigera 3 rd -instar larves.
| Essai sur le terrain $ | ||
| Traitement | % Efficacité * | Rendement (q / ha) |
| M. anisopliae aqueux M34412 (5x 10 12 spores / ha) 500L | 70,93 ± 4,19 | 14.04 |
| Formulation d'huile ( M. anisopliae ) (5x 10 12 spores / ha) 3 L | 78,02 ± 4,61 | 15.53 |
| Pesticide chimique / pratique des agriculteurs (2 ml / L, 500 L / ha) | 63,43 ± 0,85 | 12,78 |
| Contrôle non traité | - | 7.31 |
| Essai de démonstration dans (Programme participatif des agriculteurs) $$ | ||
| Traitement | % Dégâts Pod | Rendement (q / ha) |
| Formulation aqueuse ( M. anisopliae ); Superficie 4,2 ha | 15,9 ± 1,26 | 10.75 |
| Formulation d'huile ( M. anisopliae ); Superficie 0,4 ha | 17,74 | 12,5 |
| La pratique des agriculteurs; Zone 11ha | 22,72 ± 3,37 | 7,55 |
| Culture irriguée | ||
| $ Design de blocs aléatoires | ||
| * Après Henderson et Tilton (1955) | ||
| # HaNPV, nucléopolyhedrovirus de H. armigera | ||
| $$ NUn nombre d'agriculteurs impliqués dans les essais de démonstration étaient 20. Les graines de pois de pigeon (BSMR - 736) ont été fournies avec des engrais pour les agriculteurs. Village: Deolali Pravara, Tal. Rahuri. Dist. A'Nagar (MS) (19,473 ° N 74,6 ° E) | ||
Tableau 3. Performance sur le terrain de la souche M. anosopliae (M34412) contre H. armigera . L'efficacité de différentes formulations de M. anisopiae a été comparée aux traitements chimiques contre les pesticides contre l'infestation par H. armigera chez les pois chiches dans des conditions de terrain.
| Paramètre | Champ 1 | Domaine 2 | Champ 3 |
| Taille du parcelle (m) | 12 x 17 | 10 x 10 | 10 x 15 |
| Répliques | 2 | 2 | 2 |
| # Arthropodes issus de pièges à pièges testés | 20 | 22 | 15 |
| % Infecté avec M. anisopliae (trappes pièges) | ND | ND | ND |
| # Arthropodes provenant de la collecte du net de balayage testé | 193 | 171 | 226 |
| % Infecté avec M. anisopliae (collection net de balayage) | ND | ND | 0,9 |
| ND, non détecté Champ 1, collège de l'agriculture, Pune; Champ 2, ONG 1, Tulapur, Pune; Champ 3, ONG 2, Aalandi, Pune. |
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Discussion
Au cours des années 1880, la première tentative a été faite pour utiliser Metarhizium pour contrôler le scarabée, Anisoplia austriaca et le curculio de betterave à sucre, Cleonis punctiventris 21 . Dans ce protocole, l'une des conditions préalables était d'isoler une souche virulente, soit du sol, soit d'insectes infectés. En effet, d'autres paramètres, tels que LC 50 , LT 50 et ST 50 , ont contribué de manière significative à la rentabilité du produit 22 , 23 . Pour l'optimisation de la production de spores, un équilibre délicat entre le nombre de spores, la viabilité et la virulence a été maintenu 24 .
Étant donné que l'agriculture est un produit à fort volume et peu coûteux, la perception de la qualité, l'acceptabilité par les utilisateurs finaux et la durée de conservation des spores sont les principales préoccupations. La spécificité de l'hôte est avantageuse pour éviter les effets non ciblés= "Xref"> 14. L'évitement de la sous-culture répétée sur le milieu artificiel et le passage occasionnel à travers l'hôte des insectes a maintenu la virulence et l'efficacité des spores de Metarhizium dans le champ 22 . L'approche présentée présente des limites: la préparation est plus efficace lorsque le seuil économique est de ~ 2-3 larves par plante, et la germination des spores est maximale en présence d'une humidité élevée et de températures relativement basses.
Ici, la préparation fongique est efficace après contact, tandis que les préparations bactériennes (Bt) et les préparations virales (-HaNPV) ne sont efficaces que lorsqu'elles sont digérées. En ce qui concerne les paramètres de contrôle de la qualité, en plus de la viabilité des spores, pour la première fois, il a été suggéré que les marqueurs biochimiques et moléculaires basés sur les enzymes dégradant les cuticules et les schémas de digestion des restrictions spécifiques des mêmes gènes enzymatiques peuvent assurer leur efficacité le champ. Le contrôle de la qualitéLes paramètres suggérés sont: (a) la viabilité des spores, mesurée en germination des spores (devrait être> 90% sur PDA après 16 h à 28 ° C et 70-80% HR); (B) le pourcentage de mortalité de H. armigera (devrait être> 90%, avec 1 x 10 7 spores dans l'essai biologique du laboratoire); (C) l'activité chitinase dans le milieu chitine après 72 h (devrait être> 3,5 x 10 -3 U / mL); Et (d) le modèle PCR-RFLP des gènes de la chitinase. Ce manuscrit a essentiellement décrit les protocoles, de l'isolement d'un champignon entomopathogène à la génération de données d'efficacité contre le parasite cible dans le domaine. C'est l'une des conditions préalables à l'inscription de toute formulation de biopesticide avec le Central Insecticide Board of India et éventuellement à des fins de commercialisation.
La série d'expériences détaillées ici sera utile pour le développement d'un myco-insecticide potentiel. En outre, après l'extraction des spores, la biomasse mycélienne des déchets peut être utilisée pourLa promotion de la croissance des plantes ou pour l'isolement des polymères de chitosane ou de glucosamine pour les applications de soins de santé.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent la contribution des collaborateurs du programme de collaboration Indo-Suisse en biotechnologie (ISCB) du Département de la biotechnologie, de New Delhi et de la Direction du développement et de la coopération à Berne (Suisse). Les contributions des étudiants du projet et du personnel impliqués dans le développement du mycoinsecticide, y compris Vandana Ghormade, Pallavi Nahar, Priya Yadav, Shuklangi Kulkarni, Manisha Kapoor, Santosh Chavan, Ravindra Vidhate, Shamala Mane et Abhijeet Lande, sont reconnues. EKP et SGT remercient la Commission des subventions universitaires, l'Inde et le Conseil de la recherche scientifique et industrielle (CSIR), en Inde, respectivement, pour les bourses de recherche. MVD reconnaît le soutien du Conseil de recherche industrielle et scientifique, New Delhi pour le Emeritus Scientist Scheme. Les auteurs sont reconnaissants au ministère de la Biotechnologie, à New Delhi, en Inde pour le soutien financier dans le cadre des programmes ISCB et SBIRI. Nous remercionsCritiques pour leurs contributions.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Hi-Media | RM666 | Reagent |
| Ammonium sulphate | Thomas Baker | 11645 | Reagent |
| DNA analyzer | Applied biosystem | ABI prism 3730 | Instrument |
| DNA islation kit | Qiagen | 69104 | Reagent |
| Dodine | Sigma | 45466 | Reagent |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28604 | Reagent |
| Glucose | Hi-Media | GRM077 | Reagent |
| Knapsac sparyer | Kaypee | HY-16L (1004) | Instrument |
| Peptone | Hi-Media | RM006-500G | Reagent |
| Polypropylene vials | Laxbro | SV-50 | Plasticware |
| Potato dextrose agar (PDA) | Hi-Media | M096-500G | Reagent |
| Tween-80 | SRL | 28940 | Reagent |
| Ultra low volume sparyer | Matabi | INSECDISK | Instrument |
| Unicorn-bags | Unicorn | UP-140024-SMB | Autoclavalbe bag for SSF |
| Yeast extract | Hi-Media | RM027-500G | Reagent |
| Chromas 2.1 | software |
References
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