Summary
Her rapporterer vi de forskellige faser, der er involveret i den videnbaserede udvikling af et effektivt mycoinsekticid, herunder isolering, identifikation, screening og udvælgelse af "best fit" entomopathogenic svampen, Metarhizium anisopliae , til bekæmpelse af skadedyr i landbruget .
Abstract
En stor bekymring ved udviklingen af kommercielle mycoinsecticider er killhastigheden sammenlignet med kemiske insekticider. Isolering og screening til udvælgelsen af en hurtigtvirkende, stærkt virulent entomopatogen svamp er derfor vigtige trin. Entomopatogene svampe, som Metarhizium, Beauveria og Nomurea , som virker ved kontakt, er bedre egnet end Bacillus thuringiensis eller nukleopolyhedrosisvirus (NPV), som skal indtages af insektspest. I det nuværende arbejde isolerede vi 68 Metarhizium- stammer fra inficerede insekter ved hjælp af en jordfortyndings- og agnemetode. Isolaterne blev identificeret ved amplifikation og sekventering af ITS1-5.8S-ITS2 og 26S rDNA-regionen. Den mest virulente stamme af Metarhizium anisopliae blev udvalgt baseret på median dødelig koncentration (LC 50 ) og tid (LT 50 ) opnået i insekt bioassays mod III-instar larver af Helicoverpa armigera.Masseproduktionen af sporer ved den udvalgte stamme blev udført med fermentering i fast tilstand (SSF) under anvendelse af ris som et substrat i 14 dage. Sporer blev ekstraheret fra sporuleret biomasse ved anvendelse af 0,1% tween-80, og forskellige formuleringer af sporer blev fremstillet. Feltforsøg af formuleringerne til kontrol af en H. armigera- angreb i duetter blev udført ved randomiseret blokdesign. Infestationskontrolniveauerne opnået med olie og vandige formuleringer (henholdsvis 78,0% og 70,9%) var bedre end 63,4% opnået med kemisk pesticid.
Introduction
Fra indførelsen af organiske chlorpesticider i 1940'erne i Indien er brugen af pesticider steget mange gange 1 , hvor afgrøde skadedyr stadig koster milliarder rupier 2 årligt med hensyn til udbyttetab i landbrugsproduktionen. Den udbredte og ikke-dømmende anvendelse af syntetiske pesticider er en kontinuerlig trussel mod miljøet og menneskers sundhed 1 . Den utilsigtede brug af pesticider fører til rester i jorden og udtømning af naturligt skadedyr. Det tjener også som et kraftigt valgpres for at ændre den genetiske sminke af en skadedyrsbekæmpelse, hvilket fører til udvikling af resistens 1 . På trods af de enorme fordele ved den grønne revolution, som krævede høje input, som gødninger og pesticider, er skadedyr fortsat en stor biotisk begrænsning. Et generelt skøn over registrerede årlige afgrøde i Indien og i verden er USD 12 miaEf "> 2 og USD 2.000 milliarder 3 henholdsvis.
Når kemiske pesticider har skadelige virkninger, når de bruges til bekæmpelse af skadedyr, bliver det afgørende at søge alternative metoder, der er økologisk sunde, pålidelige, økonomiske og bæredygtige. Biologisk kontrol giver et passende alternativ og omfatter anvendelse af parasitter, rovdyr og mikrobielle patogener 4 . Svampe er for eksempel kendt for at inficere en bred vifte af skadedyrsskadedyr, herunder lepidopteraner, hymenopteraner, coleopteraner og dipteraner, der ofte resulterer i naturlige epizootier. I modsætning til andre bakterielle og virale insektkontrolmidler er handlingsmåden af insektpatogene svampe endvidere ved kontakt 5 . Disse svampe omfatter en heterogen gruppe på over 100 slægter, med ca. 750 arter rapporteret blandt forskellige insekter. De vigtige svampepatogener er: Metarhizium sp., Beauveria sP., Nomuraea rileyi , Lecanicillium lecanii og Hirsutella sp. For at nævne nogle få 6 . M. anisopliae (Metchnikoff) Sorokin er den anden mest anvendte entomopatogene svamp i biokontrol. Det er kendt at angribe over 200 arter af insekter 7 .
I denne undersøgelse præsenteres forskellige stadier involveret i den videnbaserede udvikling af et mycopesticid ved anvendelse af M. anisopliae . Dette omfatter: 1) identifikation af en kilde ( dvs. jord eller mycosed insekter) til virulent entomopathogener, 2) entomopathogen identifikation og udvælgelse, 3) strategier for at opretholde deres virulente natur og effektivitet i laboratorie bioassay og på området 4 ) Den omkostningseffektive formulering af infektive propagler, 5) udviklingen af unikke kvalitetsstyringsparametre til virulent præparation, og 6) bioprospektering og værditilsætning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering af Entomopathogene Svampe
- Jordfortyndingsmetode
- Saml jordprøver og mycosed insekter fra forskellige afgrødefelter ( tabel 1 ). Isolér de entomopatogene svampe fra jordprøver ved hjælp af jordfortyndingspletteringsmetoden 8 .
Bemærk: I denne undersøgelse blev prøver opsamlet fra Pune (18 ° 31'13'N, 73 ° 51'24''E) og Buldhana (19 ° 58'36''N 76 ° 30'30''E ) Distrikter, Maharashtra, Indien. - Væg 10 g af hver jordprøve og tilsæt dem separat til 90 ml sterilt 0,1% (w / v) Tween-80.
- Bland grundigt prøverne ved hjælp af en magnetisk omrører i 60 minutter for at frigøre sporer klæbet til jordpartikler.
- Efter blanding spredes 100 til 200 μl alikvoter fra hver prøve på selektivt medium indeholdende (g / L): pepton, 10; Glucose, 20; Agar, 18; Streptomycin, 0,6; Tetracyclin, 0,05; cycLohexamid, 0,05; Og dodin, 0,1 ml; PH 7,0 9 . Inkuber pladerne ved 28 ° C i 3-7 dage.
- Vælg og subkultur de individuelle sporulerende kolonier på det samme medium for at opnå rene kulturer.
- Saml jordprøver og mycosed insekter fra forskellige afgrødefelter ( tabel 1 ). Isolér de entomopatogene svampe fra jordprøver ved hjælp af jordfortyndingspletteringsmetoden 8 .
- Fra mycosed insekter
- Saml de mycosed insekter fra marken.
Bemærk: En hård larvallegeme er sandsynligvis smittet med entomopatogene svampe. Med bakteriel eller viral infektion er den døde insekt krop blød. - Saml levende insekter med unormal adfærd, dårlig koordinering og rykkende bevægelser.
- Hold insekterne til døden og overfør dem derefter til fugtige kamre for yderligere mykose og sporulation, hvis nogen, ved 28 ° C og 70-80% RH.
- Sporer sporerne fra sporulerende kadavere på det ovennævnte selektive medium og opnår rene kulturer ved yderligere subkultivering 2-3 gange på det samme medium.
- Saml de mycosed insekter fra marken.
- Agn metode
- I enHætteglas (3,85 x 6,0 cm) indeholdende 60 g jordprøve, tilsæt 4 rismarmarver ( Corcyra cephalonica ) og opbevar hætteglassene ved 25 ± 2 ° C i 14 dage.
- Drej hætteglassene på hovedet hver dag. Efter 14 dage skærm jordprøverne for tilstedeværelsen af mycosed rismoth larver. Isolér den entomopatogene svampe ved streaking sporer fra sporulerende kadavere på selektivt medium.
- Efter opnåelse af rene kulturer overfør isolaterne til kartoffel dextrose agar (PDA) skråninger og inkuber ved 28 ° C og 70-80% RH i 7 dage for at muliggøre sporulering. Efter sporulation opretholdes moderkulturer ved 8 ° C indtil brug.
2. Identifikation af entomopatogene svampe
- Identificere entomopatogene svampe ved at observere morfologiske egenskaber ( dvs. aseksuel spore størrelse og form og arrangementet af sporer på conidiophores); Isolater af 3 hovedgenera, Metarhizium , Beauv Eria og nomuraea , kan identificeres.
- Til molekylær identifikation af Metarhizium- stammer ekstraherer det genomiske DNA fra mycelbiomassen ved anvendelse af et DNA-isoleringskit; Følg producentens anvisninger (se materialebordet ). Kontroller kvaliteten af genomisk DNA ved at udføre elektroforese på en 0,8% agarosegel.
- PCR-amplificere ITS1-5.8S-ITS2 og 26S rDNA-regionen. Brug genomisk DNA som en skabelon med ITS1 fremad (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) og ITS4 reverse (TCCTCCGCTTATTGATATGC) primere 10 .
- Gel-eluere og oprense amplikonerne med forventet størrelse, ved anvendelse af et gelekstraktionskit; Følg producentens anvisninger (se materialebordet ). Kvantificer den oprensede amplicon og sekvens.
- Læs og rediger sekvenserne ved hjælp af softwaren og udfør en BLAST-søgning af nukleotidsekvenserne i NCBI GenBank databibliotek for at analysere den tætte homologi= "Xref"> 11.
- Indsæt sekvenserne af identificerede entamopatogene isolater til NCBI GenBank-databasen for at hente tiltrædelsesnumrene.
3. Screening af metarhiziumisolater mod H. armigera
- Insektopdræt
- Etablere den oprindelige kultur af H. armigera ved at indsamle sunde larver og pupper fra insektet fra marken.
- Til opdræt vokser larverne individuelt i sterile polypropylenhætteglas (3,85 x 6,0 cm, 50 ml kapacitet) indeholdende stykker okra desinficeret med 0,5% (volumen / volumen) natriumhypochlorit i 10 min 12 .
- Saml insektægene under opdræt og overfladesterilisere dem med 0,5% (volumen / volumen) natriumhypochlorit.
- Vedligeholde larverne ved 25 ± 2 ° C og 65 ± 5% RH.
- Insekt bioassay
Bemærk: For insekt bioassay er produktionen af sporer,Og feltpræstationsundersøgelser blev de første subkulturer af Metarhizium- stammer fra mycosed H. armigera larver anvendt, medmindre andet er angivet.- For insekt bioassays, brug III-instar larver af H. armigera .
- Dip et sæt 30 larver i triplicat individuelt ind i en 10 ml sporesuspension af Metarhizium- isolater (1 x 10 7 sporer / ml, medmindre andet er nævnt, levedygtighed> 90%) i 5 s.
- Efter behandling overføres hver larve individuelt til et separat sterilt hætteglas for at undgå kannibalisme. Til hvert hætteglas tilføjes fugtigt Whatmann filterpapir nr. 1 og et stykke desinficeret okra som foder. Skift papir og feed på alternative dage.
- Hold larverne ved 25 ± 2 ° C, 65 ± 5% RH og 16: 8 lys: mørke i 14 dage eller indtil de dør.
- Overfør de døde larver til sterile petriplader, der indeholder fugtige bomuldspapirer og opbevar dem ved 28 ° C og 70-80% RH i 3-7 dage for at tillade mycelia og sporeDannelse over cadavers.
- Til kontrol skal du behandle et sæt 30 larver i triplicat med 0,1% (w / v) Tween-80 i sterilt destilleret vand.
- Udfør alt eksperiment i triplicat under anvendelse af frisklavede sporesuspensioner. Indsamle og pulje dataene om procent dødelighed fra tre eksperimenter for at få gennemsnitsværdier. Beregn den korrigerede procentdødelighed ved hjælp af Abbots formel 13 .
- Udfør eksperimenterne ved hjælp af et randomiseret komplet blokdesign (RCBD) layout med hver behandling, der indeholder et sæt 30 larver i tre eksemplarer. Baseret på procent dødelighed mod H. armigera , vælg Metarhizium isolater til yderligere screening af det bedste isolat til kommerciel produktion.
- Vælg de isolater, der demonstrerer> 90% dødelighed mod H. armigera III-instar larver.
Bemærk: Her blev 12 isolater valgt. - Bestem LT 50 af disse isolater og vælg isolaterne demonstRating det hurtigste drab (på kortere tid).
Bemærk: Her blev 5 isolater udvalgt blandt de 12 mest potente isolater. - Bestem LC 50- værdierne for de valgte isolater ved hjælp af fire forskellige koncentrationer (dvs. 1 × 10 3 , 1 × 10 5 , 1 × 10 7 og 1 × 10 9 sporer / ml) sporesuspension.
- Bestem LC 50 af metarhiziumisolaterne mod III- instarlarver af H. armigera for at øge muligheden for at identificere forskellen i virulens af isolater med høje dødelighedsværdier, som kan gå uopdagede, hvis kun en enkeltdosis anvendes.
4. Fremstilling af Sporer af en Metarhizium Isolat til Field Performance Studies
- Fremstilling af Metarhiziumsporer af SSF
- For SSF fremstilles inokulumet ved at tilsætte 2 x 107 sporer af Metarhizium isolaterne til200 ml YPG (0,3% gærekstrakt, 0,5% pepton og 1,0% glucose) medium. Inkubér kolberne ved 28 ° C under omrystning (180 omdr./min.) I 48 timer.
- Til masseproduktion af sporer af SSF, brug ris som et substrat, medmindre andet er angivet.
- Til SSF, fyld autoklaverposer (type / 14 med et enkelt mikroventilfilter på 0,5 μm, 2 kg kapacitet, 64 × 36 cm) med 2 kg ris. Tilsæt 1000 ml destilleret vand til risen i poserne og blød natten over 14 . Autoklaver poserne med den gennemblødte ris ved 121 ° C i 45 minutter 15 .
- Inokulere poser med 48-h-gammelt mycel-inokulum (10% inokulum, 200 ml for 2 kg ris) og inkuber ved 28 ° C og 70-80% RH i 14 dage.
- Høst sporene ved hjælp af væskeudtræk ved anvendelse af 0,1% Tween-80. Til dette tilføjes indholdet af posen til 0,1% Tween-80 (3 liter pr. 1 kg ris), blandes grundigt, adskilles sporerne fra væsken ved centrifugering og tørrer ved 37 ° C i 2 dage. < / Li>
- Alternativt tørres sækkene indeholdende ris med sporerne og nogle mycelier ved 37 ° C i 2 dage for at reducere fugtindholdet (<20%). Høst sporene ved hjælp af en mejetærsker eller vibro-sifter.
- Viability studier
- Bestem procentuel levedygtighed af de høstede sporer ved anvendelse af forskellige metoder 15 . Til dette fremstilles sporesuspensionerne i 0,1% (vægt / volumen) Tween-80 og justerer tællingen til 1 x 10 3 sporer / ml.
- Spread suspensions (0,1 ml) på PDA plader i triplicat og inkuber ved 28 ° C og 70-80% RH i 72 timer.
- Tæller manuelt de isolerede kolonier og bestem det samlede levedygtige antal for den pågældende prøve.
- Spore sedimentation rate
- Til en ensartet dosering er den homogene sporesuspension påkrævet; Bestemme spore sedimentation satser for Metarhizium isolater som beskrevet"Xref"> 16. Kontroller sedimentationshastighederne for sporer i 0,2 M ammoniumsulfat og 0,1% Tween-80.
- Juster sporesuspensionens telling til ~ 7 × 107 sporer / ml for at opnå en initial absorbans på 0,6 ved 540 nm. Lad kuvetterne stå uforstyrret i 6 timer for at sporerne kan slå sig ned.
- Optag absorbansen i op til 6 timer. Udtryk sedimentationshastigheden i procent og beregne den tid, der kræves for 50% sedimentation (ST 50 ). Gentag eksperimentet tre gange under anvendelse af frisklavede sporesuspensioner.
5. Field Performance Studies af evnen til den valgte M. anisopliae Isolere til kontrol H. armigera i duerterter
- Hærdbar pulverformulering af M. anisopliae M 34412 sporer
- Forbered den 2,5-5% befugtelige pulverformulering ved at blande sporerne med talkum.
- Juster den endelige levedygtige tæller (TVC) til 1 x 10 12 spoRes per kg formulering.
- Field performance undersøgelser af M. anisopliae M 34412 sporer
- For feltpræstationsundersøgelser af evnen af det valgte M. anisopliae- isolat til at kontrollere H. armigera- angreb i duerter , brug en RCBD med fire replikationer.
Bemærk: Her udføres på Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth (MPKV), Rahuri (19.3927 ° N, 74.6488 ° E). - Brug to forskellige sprayformuleringer, en oliesammensætning af sporer (5 x 10 12 sporer / 3 liter diesel: solsikkeolie, 7: 3) og en vandig formulering i Tween-80 (0,1%). Sprøjt olieformuleringen med en ultra-lav volumen (ULV) sprøjte (70 min, 3 l / ha) den vandige formulering med en ryggsæksprøjte (5 x 10 12 sporer, 500 L / ha).
Bemærk: Her registreres larvalpopulationerne en dag før sprayen og 3 og 7 dage efter påføringen af hver spray til 5 tilfældigt udvalgte planter. Den samlede befolkning var tOmformet til kvadratroden af n + 1 til den statistiske analyse.- I henhold til landbrugspraksis for duftens afgrøde udføres den første sprøjtning mellem 10 og 15 d efter æglægning og 2 gange med 14 dages interval. Udfør sprøjtningen mellem kl. 16.00 og 18.00 h. IST. Overvåg vindretningen og om nødvendigt bruge kludgardiner for at undgå sporing af sporer til naboområder.
- Til sammenligning spray de kemiske insekticider med en håndkompressionssprøjte.
- Bestem persistensens vedholdenhed i marken ved at samle H. armigera larverne 0, 3, 5, 7 og 14 dage efter sprøjtningen.
- Hold disse larver under observation i 14 dage og efter døden, overfør dem til et plastikflaske, der indeholder fugtigt filterpapir. Inkuber ved 25 ± 2 ° C og 70 ± 10% RH for at observere mykose.
- Bestem persistensens vedholdenhed på larvalpopulationen baseret på p Stigende dødelighedsdata fra larverne, der er samlet fra feltet efter sprøjtning.
- Evaluere feltstudierne på basis af procent effekt 17 , procent pod skade og procent udbytte 18 .
Bemærk: Der blev registreret data for parametrene, såsom temperatur, fugtighed, vindhastighed (km / h), solskin (h), nedbør (mm), regnfulde dage og fordampning (mm) under en prøve på en Landbrugsuniversitet (Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth, Rahuri, 19.3927 ° N, 74.6488 ° E).
- For feltpræstationsundersøgelser af evnen af det valgte M. anisopliae- isolat til at kontrollere H. armigera- angreb i duerter , brug en RCBD med fire replikationer.
- Landbrugernes deltagelsesprogram
- Vælg antal landmænd til demonstrationsforsøg. Tilfør dyve ærter frø (BSMR - 736) sammen med gødning til landmændene.
Bemærk: I denne undersøgelse var 20 landbrugere involveret. Landsby: Deolali Pravara, (19.473 ° N 74.6 ° E). - Brug samme sprayformuleringer og antal sprøjter som i trin 5.2.
- Vælg antal landmænd til demonstrationsforsøg. Tilfør dyve ærter frø (BSMR - 736) sammen med gødning til landmændene.
- Overhold effekten af mycoinsecticidspray, hvis det er tilfældet, på duftens blade.
- Indsamle jordboende leddyr og bladbeboende insekter 1 dag efter hver behandling i de ubehandlede områder og i de tomter, der er behandlet med M. anisopliae .
- Saml jordbypedyrdyr med faldgrop inden for 24 timer efter behandling og saml de bladbeboende insekter med et fejnettet om morgenen efter behandlingen ( dvs. ca. 15-18 timer efter behandling).
- Opbevar dem individuelt i cylindriske plastkasser med diameter 3,5 cm og højder 4,0 cm. Kontroller insekterne dagligt for infektion og fodre dem med passende mad.
- Optag tilstedeværelsen af M. anisopliae , hvis overhovedet, og isoler svampen.
7. Identifikation af kvalitetsstyringsparametre
- Kontroller sporbarhedens evne ved at måle spore spiring på PDA ved 28 °; C.
- Måle cuticle nedbrydning enzym aktiviteter, såsom chitinase, chitin deacetylase, chitosanase, protease og lipase, produceret i YPG og chitin medier, som beskrevet tidligere 15 .
- Bestem procentuel dødelighed af H. armigera i et laboratorie bioassay 15 .
- Brug molekylære markører, såsom et PCR-RFLP-mønster af chitinaser ( chit 1 , 2 og 4 ) og protease ( Pr1A ) gener, som virulensattributter for M. anisopliae .
- Ekstraher det genomiske DNA fra myceliebiomassen ved anvendelse af et DNA-isoleringskit 15 . PCR-amplificerer Chit1- og Chit2 -genfragmenterne ved anvendelse af genomisk DNA som en skabelon med primerpar Chit1F / Chit1R (CTCTGCAGGCCACTCTCGGT / AGCCATCTGCTTCCTCATAT) og Chit2F / Chit2R (GACAAGCACCCGGAGCGC / GCCTTGCTTGACACATTGGTAA). For Chit4 , brug primerparet Chit4F / Chit4R (ATCCGGCAGCACGGCTAC / CTTGGATC CGTCCCAGTTG).
- For amplifikationen af Pr1A-genet, anvend METPR2- og METPR5-primerparet (AGGTAGGCAGCCAGACCGGC / TGCCACTATTGGCCGGCGCG).
- Udfør begrænsningsfordøjelsen 19 af Chit1- genet med BsaJI , BstUI og ScrFI ; Af Chit2- genet med AluI , HpyCH4IV og HpyCH4V og af Chit4- genet med BstUI , HaeIII og MboI . Til fordøjelsen af Pr1A genet, brug RsaI , Ddel og MspI 20 .
- Overhold limfragmentlængde polymorfisme (RFLP) mønster på 1,5% agarosegel ved elektroforese for hvert gen for de fleste virulente stammer (> 90% dødelighed); Dette kan bruges som virulensmarkør til udvælgelsen af M. anisopliae .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under undersøgelserne blev forskellige stammer af Metarhizium, Beauveria og Nomuraea isoleret ved forskellige isoleringsmetoder (data ikke vist) 6 , 14 Da metarhiziumstammer blev fundet mere effektive til at kontrollere H. armigera , et frygteligt skadedyr i pulser 6 , 14 , Blev yderligere isolationer rettet mod at isolere metarhiziumstammer fra forskellige afgrødefelter og insekter ( tabel 1 ). De samlede 68 Metarhizium isolater opnået blev identificeret ved kulturelle og morfologiske egenskaber og ved ITS 1-5,8S-ITS 4 sekventering. Baseret på> 90% dødeligheden af H. armigera i laboratorie bioassays blev 12 Metarhizium isolater yderligere testet for spore produktion, levedygtighed, LC 50 , LT 50 og ST 50 . Tabel 2 beskriver dataeneFor 3 potentielle isolater, M34311, M34412 og M81123; M34412 viste sig at være det bedste isolat.
Blandt de testede substrater, såsom ris, sorghum, majs og hvede støttede ris den maksimale sporulering for Metarhizium- isolater (60-75 g sporer / kg, 4-4,4 x 10 10 sporer / g sporepulver) .
Under feltforsøg til kontrol af H. armigera i duerter blev der opnået 78,0% og 70,9% effektiviteter med henholdsvis M. anisopliae M34412 olie og vandige formuleringer . Podskaden i M. anisopliae-behandlede tomter viste sig at være mindre (8,76%) end i de ubehandlede kontrolplots (23,63%) og de kemisk behandlede plot (10,24%). Gennemsnitligt udbytte (q / ha) i den ubehandlede kontrol var 7,31 q / ha, hvilket var mindre end det efter M. anisopliae M34412 behandling (14,04 q / ha). Behandling med kemikalie gav et udbytte på 12,78 q / ha ( tabel 3 ).
Observationerne registreret for fytotoksicitetssymptomer viste, at ingen behandlinger viste en fytotoksisk virkning på duftens afgrøde efter 3 sprøjter af M. anisopliae formulering. Ud af 57 indsamlede jordboende leddyr (markcrickets og edderkopper) blev ingen inficeret. Af 590 indsamlede baldakinbeboeder ledede to individer af ordren Heteroptera (= 0,3% af de samlede arthropoder) at være inficeret med M. anisopliae ( tabel 4 ). Hverken edderkopper eller coccinellider bukkede under svampen.
| Jord (58 isolater) | ||
| Isolér nr. | Afgrøde | Antal isolater |
| M1311, M1322, M1333, M2104, M2305, M2416, M2427, M2508, M42014, M45115, M45216, M45317, M79120, M79221, M79322 | Tomat | 15 |
| M3419, M34210, M34311, M34412, M34513, M171264 | Custard æble | 6 |
| M81123, M91124, M91225, M91326, M91528, M91427, M91629, M91730, M91831, M91932, M111145 | Sukkerrør | 11 |
| M101133, M101234, M101335, M101436, M101537, M101638, M101739, M101840, M101941, M102042, M102143, M102244 | brinjal | 12 |
| M51118, M51219 | okra | 2 |
| M131150, M141151, M141252, M151153 | Duetærte | 4 |
| M121146, M121247, M121348, M121449 | kikært | 4 |
| M183365 | Bomuld | 1 |
| M193166 | Jawar | 1 |
| Insektværten (10 isolater) | ||
| M16255, M16356, M16457, M16558, M16659 | Pigeon-ætset snitorm | 5 |
| M16154, M16760 | Sugarcane-mealy bug | 2 |
| M16861 | Sukkerrør-hvid grub | 1 |
| M16962 | Sukkerrør-bille | 1 |
| M161063 | Sukkerrør-Pyrilla perpussila | 1 |
Tabel 1. Oprindelse af Metarhizium stammer. 68 Metarhizium stammerne blev isoleret fra forskellige afgrødefelter (58 stammer) og mycosed insekter fra afgrødefeltene (10 stammer).
| Isolere | Udbytte (g / kg ris) | Levedygtighed (%) | LC 50 (x 103 sporer / ml) | LT 50 (dage) | Dødelighed (%) | |
| Middel ± SD | Middel ± SD | (Fiducial Limit) | (Fiducial Limit) | (Fiducial Limit) | ||
| M34311 | 60.00 ± 2.64a | 92,00 ± 2.64a | 2,47 (2,26-2,69) | 2 (0,4-10,3) | 3,5 (3,2-3,7) | 96,67 |
| M34412 | 67.00 ± 3.46b | 97.00 ± 1.73a | 2,3 (2,11-2,52) | 1,4 (0,1-1,9) | 3,3 (3,0-3,6) | 96,67 |
| M81123 | 75.00 ± 3.60c | 93.00 ± 1.73a | 2,65 (2,43-2,90) | 5,7 (1,2-26,7) | 3,3 (3,1-3,6) | 95,56 |
| Tal efterfulgt af det samme bogstav i kolonnen er ikke statistisk anderledes. | ||||||
| ST 50, tid, der kræves til sedimentering af 50% sporer i 0,1% (w / v) Tween 80. | ||||||
| Tal efterfulgt af det samme bogstav i kolonnen er ikke statistisk anderledes. SD, Standardafvigelse. T80, Tween 80 (0,1%, vægt / volumen). | ||||||
| LC 50 , den gennemsnitlige letale koncentration af sporer beregnet til at forårsage 50% mortalitet af H. armigera efter 14 dage. | ||||||
| LT 50 , den gennemsnitlige dødelige tid for sporer beregnet til at forårsage 50% dødelighed af H. armigera . | ||||||
Tabel 2. Udvælgelse af tre bedste resultater Metarhizium isolater. H. armigera 3 rd- instar larver.
| Feltforsøg $ | ||
| Behandling | % Effektivitet * | Udbytte (q / ha) |
| Vandig M. anisopliae M34412 (5x 10 12 sporer / ha) 500L | 70,93 ± 4,19 | 14.04 |
| Olieformulering ( M. anisopliae ) (5x10 12 sporer / ha) 3 L | 78,02 ± 4,61 | 15,53 |
| Kemisk pesticid / Farmers praksis (2ml / L, 500 L / ha) | 63,43 ± 0,85 | 12.78 |
| Ubehandlet kontrol | - | 7,31 |
| Demonstrationstest i (Farmers Participatory Program) $$ | ||
| Behandling | % Pod skade | Udbytte (q / ha) |
| Vandig formulering ( M. anisopliae ); Areal 4.2 ha | 15,9 ± 1,26 | 10,75 |
| Olieformulering ( M. anisopliae ); Areal 0,4 ha | 17.74 | 12.5 |
| Farmers praksis; Område 11ha | 22,72 ± 3,37 | 7,55 |
| Vandet afgrøde | ||
| $ Randomized Block Design | ||
| * Efter Henderson og Tilton (1955) | ||
| # HaNPV, H. armigera nukleopolyhedrovirus | ||
| $$ NUmber af bønder involveret i demonstration forsøg var 20. Duen ærter frø (BSMR - 736) blev leveret sammen med gødning til landmændene. Landsby: Deolali Pravara, Tal. Rahuri. Dist. A'Nagar (MS) (19.473 ° N 74.6 ° E) | ||
Tabel 3. Feltydelse af M. anosopliae (M34412) stamme mod H. armigera . Effekten af forskellige formuleringer af M. anisopiae blev sammenlignet med kemiske pesticidbehandlinger mod H. armigera- angreb i duetærter under markbetingelser.
| Parameter | Felt 1 | Felt 2 | Felt 3 |
| Plottestørrelse (m) | 12 x 17 | 10 x 10 | 10 x 15 |
| gentagelser | 2 | 2 | 2 |
| # Arthropoder fra slaggfælder testet | 20 | 22 | 15 |
| % Inficeret med M. anisopliae (pitfall fælder) | ND | ND | ND |
| # Arthropoder fra fejning netto samling testet | 193 | 171 | 226 |
| % Inficeret med M. anisopliae (feje netopsamling ) | ND | ND | 0,9 |
| ND, Ikke detekteret Felt 1, landbrugskollegiet, Pune; Felt 2, NGO 1, Tulapur, Pune; Felt 3, NGO 2, Aalandi, Pune. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I løbet af 1880'erne blev det første forsøg på at bruge Metarhizium til at kontrollere scaraberbenet , Anisoplia austriaca og sukkerroercurculio, Cleonis punctiventris 21 . I denne protokol var en af forudsætningerne at isolere en virulent stamme, enten fra jorden eller fra inficerede insekter. Faktisk har andre parametre, såsom LC 50 , LT 50 og ST 50 , bidraget væsentligt til omkostningseffektiviteten af produktet 22 , 23 . Til optimering af sporeproduktionen blev en delikat balance mellem antal spor, levedygtighed og virulens bevaret 24 .
Da landbruget er et produkt med høj volumen og lave omkostninger, er kvaliteten af opfattelsen, accept af slutbrugerne og holdbarhed for sporer de største bekymringer. Værtsspecificitet er fordelagtig for at undgå ikke-mål-effekter= "Xref"> 14. Undgåelse af gentagen subkultur på kunstigt medium og lejlighedsvis passage gennem insektværten opretholdt virulensen og effektiviteten af Metarhizium- sporerne i feltet 22 . Den præsenterede tilgang har begrænsninger: Forberedelsen er mere effektiv, når det økonomiske tærskelniveau er ~ 2-3 larver pr. Plante, og spore-spiring er maksimalt i nærværelse af høj fugtighed og relativt lave temperaturer.
Her er svampepreparatet effektivt efter kontakt, mens bakterielle (Bt) og virale præparater (-HaNPV) kun er effektive, når de spaltes. Hvad angår kvalitetskontrolparametre, er der for første gang blevet foreslået, at biokemiske og molekylære markører baseret på nedbrydning af nedbrydende enzymaktiviteter og specifikke restriktionsfordøjelsesmønstre af de samme enzymgener kan sikre effektivitet i marken. Kvalitets-kontrOl parametre foreslået er: a) sporbarhed, målt som spore spiring (bør være> 90% på PDA efter 16 timer ved 28 ° C og 70-80% RH); (B) den procentuelle dødelighed af H. armigera (bør være> 90%, med 1 x 107 sporer i laboratorie bioassay); (C) chitinaseaktiviteten i chitinmediet efter 72 timer (bør være> 3,5 x 10-3 U / ml); Og (d) PCR-RFLP-mønsteret af chitinase-gener. Dette manuskript har i det væsentlige beskrevet protokollerne, fra isolationen af en entomopatogen svamp til dannelsen af effektivitetsdata mod målet skadedyr i marken. Dette er en af forudsætningerne for at registrere enhver biopesticidformulering med Central Insecticide Board of India og til sidst til kommercialisering.
Serien af eksperimenter, der er beskrevet her, vil være nyttige til udvikling af et potentielt mycoinsekticid. Efter udvinding af sporerne kan desuden den myceliale biomasse af affald anvendes tilPlantevækstfremme eller til isolering af chitosan eller glucosaminpolymerer til sundhedsanvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender bidrag fra samarbejdspartnere fra det bioteknologiske institut for indo-schweizisk samarbejde i bioteknologi (ISCB) fra Institut for Bioteknologi, New Delhi og Det Schweiziske Agentur for Udvikling og Samarbejde, Bern, Schweiz. Bidragene fra projektstuderende og personale involveret i udviklingen af mycoinsekticidet, herunder Vandana Ghormade, Pallavi Nahar, Priya Yadav, Shuklangi Kulkarni, Manisha Kapoor, Santosh Chavan, Ravindra Vidhate, Shamala Mane og Abhijeet Lande, anerkendes. EKP og SGT takker University Grants Commission, Indien og Scientific and Industrial Research (CSIR), Indien, henholdsvis for forskning stipendier. MVD anerkender støtten fra Rådet for Industriel og Videnskabelig Forskning, New Delhi for Emeritus Scientist Scheme. Forfatterne er taknemmelige for Institut for Bioteknologi, New Delhi, Indien for den økonomiske støtte under ISCB og SBIRI programmerne. Vi er taknemmelige forKorrekturlæsere for deres input.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Hi-Media | RM666 | Reagent |
| Ammonium sulphate | Thomas Baker | 11645 | Reagent |
| DNA analyzer | Applied biosystem | ABI prism 3730 | Instrument |
| DNA islation kit | Qiagen | 69104 | Reagent |
| Dodine | Sigma | 45466 | Reagent |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28604 | Reagent |
| Glucose | Hi-Media | GRM077 | Reagent |
| Knapsac sparyer | Kaypee | HY-16L (1004) | Instrument |
| Peptone | Hi-Media | RM006-500G | Reagent |
| Polypropylene vials | Laxbro | SV-50 | Plasticware |
| Potato dextrose agar (PDA) | Hi-Media | M096-500G | Reagent |
| Tween-80 | SRL | 28940 | Reagent |
| Ultra low volume sparyer | Matabi | INSECDISK | Instrument |
| Unicorn-bags | Unicorn | UP-140024-SMB | Autoclavalbe bag for SSF |
| Yeast extract | Hi-Media | RM027-500G | Reagent |
| Chromas 2.1 | software |
References
- Aktar, M. W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
- Dhaliwal, G. S., Jindal, V., Mohindru, B. Crop losses due to insect pests: Global and Indian scenario. Indian J Entomol. 77 (2), 165-168 (2015).
- Popp, J., Peto, K., Nagy, J. Pesticide productivity and food security. A review. Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2015).
- van Lenteren, J. C., Manzaroli, G. Evaluation and use of predators and parasitoids for biological control of pests in greenhouses. Integrated pest and disease management in greenhouse crops. Albajes, R., Gullino, M. L., van Lenteren, J. C., Elad, Y. , Kluwer. Dordrecht, The Netherlands. 183-201 (1999).
- Charnley, A. K., Collins, S. A. Entomopathogenic fungi and their role in pest control. The Mycota IV: Environmental and Microbial Relationships. Kubicek, C. P., Druzhinina, I. S. , 2nd, Springer-Verlag. Berlin. 159-187 (2007).
- Deshpande, M. V., et al. Comparative evaluation of indigenous fungal isolates, Metarhizium anisopliae M34412, Beauveria bassiana B3301 and Nomuraea rileyi N812 for the control of Helicoverpa armigera (Hüb.) on pulses. Proceeding of the international workshop on entomopathogenic fungi - a valuable alternative to fight against insect pests. MV, D. eshpande , National Chemical Laboratory. Pune, India. 51-59 (2004).
- Roberts, D. W., Hajek, A. E. Entomopathogenic fungi as bioinsecticides. Frontiers in industrial mycology. Leathan, G. F. , Chapman & Hall. New York, NY. 144-159 (1992).
- Goettel, M., Inglis, G. D. Fungi: Hyphomycetes. Manual of techniques in insect pathology. Lacey, L. A. , Academic Press. USA. 213-245 (1996).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J., et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR-Protocols: A guide to methods and applications. Innis, M. A., et al. , Academic Press, Inc. San Diego. USA. 315-322 (1990).
- Basic Local Alignment Search Tool. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST (2017).
- Ignoffo, C. M., Futtler, B., Marston, N. L., Hostetter, D. L., Dickerson, W. A. Seasonal incidence of the entomopathogenic fungus Spicaria rileyi associated with noctuid pests of soybeans. J Invertebr Pathol. 25 (1), 135-137 (1975).
- Abbott, W. S. A method for computing the effectiveness of an insecticide. J Econ Entomol. 18 (2), 265-267 (1925).
- Nahar, P. Development of biocontrol agents for the control of pests in agriculture using chitin metabolism as target. , PhD thesis submitted to Department of Microbiology, University of Pune 137 (2004).
- Kulkarni, S. A., et al. Comparison of Metarhizium isolates for biocontrol of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) in chickpea. Biocontrol Sci Tech. 18 (8), 809-828 (2008).
- Jeffs, L. B., Khachatourians, G. G. Estimation of spore hydrophobicity for members of the genera Beauveria, Metarhizium, and Tolypocladium by salt-mediated aggregation and sedimentation. Can J Microbiol. 43 (1), 23-28 (1997).
- Henderson, C. F., Tilton, E. W. Tests with acaricides against the brow wheat mite. J Econ Entomol. 48 (2), 157-161 (1955).
- Hassani, M. Development and proving of biocontrol methods based on Bacillus thuringiensis and entamopathogenic fungi against the cotton pests Spodoptera littoralis, Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) and Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae). , PhD thesis submitted to Justus-Liebig-University Giessen, Germany (2000).
- Enkerli, J., Ghormade, V., Oulevey, C., Widmer, F. PCR-RFLP analysis of chitinase genes enable efficient genotyping of Metarhizium anisopliae var. anisopliae. J Invert Pathol. 102 (2), 185-188 (2009).
- Bidochka, M. J., Melzer, M. J. Genetic polymorphism in three subtilisin-like protease isoforms (Pr1A, Pr1B and Pr1C) from Metarhizium strains. Can. J. Microbiol. 46 (12), 1138-1144 (2000).
- McCoy, C. W., Samson, R. A., Boucias, D. G. Entomogenous fungi. Handbook of natural pesticides, Microbial insecticides, Part A. Entomogenous protozoa and fungi. Ignoffo, C. M., Mandava, N. B. , CRC Press. Boca Raton, FL. 151-236 (1988).
- Nahar, P. B., et al. Effect of repeated in vitro sub-culturing on the virulence of Metarhizium anisopliae against Helicoverpa armigera (Lepidoptera Noctuidae). Biocontrol Sci Tech. 18 (4), 337-355 (2008).
- Kapoor, M., Deshpande, M. V. Development of mycoinsecticide for the control of insect pests: Issues and challenges in transfer of technology from laboratory to field. Kavaka. 40, 45-56 (2013).
- Deshpande, M. V. Mycopesticide Production by Fermentation: Potential and Challenges. Crit Rev Microbiol. 25 (3), 229-243 (1999).
