Summary
هنا، وتبين لنا نهجا الأنزيمية لعزل خلايا الكبد الأولية من الفئران الكبار، ونحن تصف الكمي لاستجابة التهابية باستخدام ELISA وفي الوقت الحقيقي PCR.
Abstract
الكبد يلعب دورا حاسما في تنظيم الالتهابات. في أمراض الكلى المزمنة على وجه الخصوص، حيث يتفاعل الكبد ردا على الوسط اليوريمي، الاكسدة، endotoxemia وإزالة انخفضت تعميم السيتوكينات proinflammatory من خلال إنتاج عدد كبير من المواد المتفاعلة في المرحلة الحادة. أدوات تجريبية لدراسة التهاب والدور الأساسي لخلايا الكبد هي أساسية لفهم التنظيم ومساهمة السيتوكينات الكبد إلى مرحلة الاستجابة الحادة النظامية وسيناريو لفترات طويلة الموالية للالتهابات، وخصوصا في بيئة معقدة مثل مرض الكلى المزمن. منذ دراسة آليات معقدة من التهاب في الجسم الحي لا تزال صعبة، والموارد كثيفة، وعادة ما يتطلب استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا، وتقدم خلايا الكبد معزولة الأولية أداة قوية لاكتساب رؤى الآلية في الاستجابة المرحلة الحادة الكبدية. لأن هذا في المختبر تقنية ملامح التكاليف المعتدلة، وإعادة عاليةالطاقة الانتاجية والمعرفة التقنية المشتركة، يمكن للخلايا الكبد معزولة الأولية أن تستخدم أيضا بسهولة كنهج الفرز. هنا، نحن تصف طريقة القائم على الأنزيمية لعزل خلايا الكبد الفئران الأولية، وصفنا تقييم استجابة التهابية في هذه الخلايا باستخدام ELISA والكمي في الوقت الحقيقي PCR.
Introduction
مرض الكلى المزمن (CKD) يمكن تعريفها بأنها حالة من الالتهاب الحاد والمزمن 1. في المرضى الذين يعانون من كد، ومستويات المصل من هرمون الليفية عامل النمو phosphaturic 23 (FGF23) يرتفع تدريجيا من أجل الحفاظ على الفوسفات في الدم التوازن 2. وترتبط زيادة مستويات FGF23 المصل بشكل مستقل مع معدلات الاعتلال والوفيات القلب والأوعية الدموية لدى المرضى الذين بدأوا العلاج غسيل الكلى 3، 4. وعلاوة على ذلك، أظهرت العديد من الدراسات السريرية وجود علاقة قوية بين مستويات FGF23 مرتفعة ومستويات مصل البروتين سي التفاعلي (CRP)، انترلوكين 6 (IL-6) وورم α عامل نخر (TNFα) 5، 6. وعلاوة على ذلك، في دراسة تجريبية، قمنا في الآونة الأخيرة أظهرت أن FGF23 يمكن أن تستهدف مباشرة خلايا الكبد ويسبب استجابة التهابية من خلال زيادة البروتين وIL-6 صرودوكشن في الكبد 7. وبالتالي، FGF23 قد يكون بمثابة عامل المتداولة التي تساهم في التهاب النظامية في CKD.
في 70 في وقت مبكر، وكانت خلايا الكبد الأولية معزولة ودرس لأول مرة 8. ومنذ ذلك الحين استخدمت خلايا الكبد مثقف الابتدائي على نطاق واسع لدراسة معالجة الأيض، وظيفة الهرمونية، استقلاب الدواء وسمية وكذلك الحصانة والاستجابات الالتهابية 9 و 10. ووصف البروتوكولات السابقة أساسا العزلة الأنزيمية من خلايا الكبد الأولية من أنسجة الكبد البشري 11 و 12. بينما نموذجا ممتازا، وهذا يترك من القدرة على دراسة كيفية التلاعب الجيني يؤثر على آليات إشارات الكبد معقدة وكذلك العواقب الوظيفية على أنواع مختلفة من المحفزات. في ما يلي، وصفنا عزل خلايا الكبد الأولية الفئران. والجدير بالذكر، يمكن تحليل تأثير عدة وسطاء للاستجابة في المرحلة الحادة الكبدية، مثل lipopolysaccharide في (LPS)، IL-6 و FGF23 في وسيلة سهلة وسريعة وقابلة للتكرار بطريقة 13.
هنا، نقدم بروتوكول لعزل الأنزيمية من خلايا الكبد من فئران بالغة، وعلينا أن نبرهن على المحرضات التي أنشئت من التهاب، مثل LPS وIL-6، وكذلك وسطاء التهابات جديدة مثل FGF23، يمكن أن تحفز مباشرة التعبير وإفراز السيتوكينات الالتهابية، مثل البروتين وIL-6 في خلايا الكبد مثقف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوانية والإجراءات التجريبية من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من كلية الحقوق بجامعة ميامي ميلر للطب.
1. إعداد
- سخن وسائل الاعلام نضح الكبد وهضم وسائل الإعلام في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
- انشاء مضخة نضح (30 مل / دقيقة). بعناية تعبئتها بشكل مسبق نظام أنابيب المضخة مع وسائل الاعلام نضح الكبد. تجنب أي فقاعات هواء في نظام وإعداد المجهر المجسم.
- أطباق زراعة الخلايا معطف باستخدام نوع الكولاجين أنا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
2. الكبد الانتعاش
- تخدير الماوس المانحة باستخدام الأوكسجين / استنشاق الأيزوفلورين (الأيزوفلورين 4٪ / 2 لتر / دقيقة الأكسجين).
- الحفاظ على التخدير عن طريق خفض الأيزوفلورين إلى 2-2.5٪ أو عن طريق حقن الكيتامين (100 ملغم / كغم من وزن الجسم داخل الصفاق) وزيلازين (10 ملغ / كغ من وزن الجسم intraperitoneally). ويفضل التخدير الأيزوفلورين المستمر منذ الكيتامين يخفض ضغط الدم ويمكن أن يسبب تسمم الكبد.
- ضع الماوس تخدير على وسادة ماصة. إصلاح الأطراف الماوس، مع شريط لاصق.
- حلاقة وتطهير البطن من الفأرة وإجراء عملية فتح البطن بطني من العانة إلى الحدود الجمجمة الكبد باستخدام مقص جراحي مع حادة / نصائح صريحة. شق جدار البطن لكلا الجانبين، الذيلية من الحجاب الحاجز.
- فضح الوريد الأجوف السفلي (IVC) عن طريق نقل بعناية الأمعاء إلى الجانب الأيمن. بعناية تشريح الأنسجة الدهنية في جميع أنحاء IVC باستخدام معقم مسحات القطن طرف وملقط غيض الزاوية.
- شق الحجاب الحاجز فوق الكبد وفتح التجويف الصدري من قبل اثنين من الشقوق الجانبية باستخدام مقص جراحي غرامة مع / نصائح حادة حادة. Ligate في IVC الصدري باستخدام الحرير الجراحية (5/0).
- يقني؛ يدخل القنية في IVC infrarenal باستخدام القسطرة الرابع محمية، وإزالة بعناية الإبرة،توصيل مضخة نضح وبدء perfusing الكبد. إذا أجريت بشكل صحيح، يجب الكبد تبدأ على الفور لشحب وتنتفخ.
- المسح الشامل للالوريد البابي مما يتيح تصريف مناسبة من الدم والتروية الوسائط باستخدام مقص جراحي غرامة.
- يروي الكبد مع ما يقرب من 30 مل من وسائل الاعلام نضح الكبد، ومن ثم التبديل إلى الكبد الهضم وسائل الإعلام (30 مل). إيقاف مضخة نضح وإزالة قنية مرة نضح كاملة.
- فضح بلطف المنطقة الوسطى من الكبد وتحديد الأنسجة التي تربط تربط بين فصوص الكبد. الاستيلاء على الألياف التي تربط وسط وبعناية تشريح جميع أنسجة عقد الكبد في مكان وإزالة بلطف الكبد.
- على الفور نقل الكبد في أنبوب مخروطي 50 مل البولي بروبلين تحتوي على 15 مل من الكبد الهضم وسائل الإعلام.
ملاحظة: ليس هناك خط زمني محدد لهذه الخطوة. بعد نضح، يبقى الكبد في وسائل الإعلام هضم لنقل إلى الخلية هود الثقافة العقيمة. كل ليالييجب أن يتم تنفيذ الخطوات التي تبعت في بيئة معقمة.
3. عزل وعلاج الخلايا
- داخل الخلية هود الثقافة، ونقل الكبد من 50 مل أنبوب البولي بروبلين مخروطي يحتوي على وسائل الاعلام الهضم في طبق نسيج الثقافة العقيمة.
- باستخدام ملقط معقم، المسيل للدموع بلطف فصوص أربعة من الكبد. إذا أجريت بشكل صحيح، ينبغي أن يصبح الهضم المتوسطة عكر بسبب عزل خلايا الكبد من الكبد.
- باستخدام 25 مل ماصة معقمة غيض، تصفية المتوسطة الهضم العكرة من خلال 70 ميكرون خلية النايلون مصفاة في أنبوب جديد مخروطي 50 مل البولي بروبلين لإزالة جزيئات الأنسجة عسر الهضم والحطام الخلية.
- كرر الخطوات من 3.2 و 3.3 العقيمة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). هذا يساعد في إزالة أي خلايا الكبد المتبقية من الكبد.
- أجهزة الطرد المركزي في 50 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. نضح طاف تحتوي على حطام خلية الزائد وبلطف اعادة تعليق الخلايا في 25 مل 1X الباردويليامز المتوسطة هاء
- باستخدام 25 مل ماصة معقمة غيض، تصفية اعادة تعليق من خلال جديدة 70 ميكرون خلية النايلون مصفاة إلى مل أنبوب البولي بروبلين مخروطي 50 لتحقيق وقف أنظف.
- كرر الخطوات من 3.5 و 3.6 لمدة ثلاث يغسل إضافية باستخدام البارد ويليامز المتوسطة E 1x إلى الحصول على تعليق خلية أكثر وضوحا.
- بعد الخطوة غسل النهائي، نضح طاف لإزالة الحطام الخلية الزائد. اعادة تعليق والخلايا مرشح في 25 مل دافئ وليامز "الإعلام E 1X يحتوي على الذوبان الكبدية الابتدائي والمكملات الطلاء من خلال جديدة 70 ميكرون خلية النايلون مصفاة إلى مل أنبوب البولي بروبلين مخروطي 50.
- عدد الخلايا داخل تعليق خلية مل 25 باستخدام عدادة الكريات. في المتوسط نتوقع 15-20000000 الخلايا في الكبد الكبار. تحديد بقاء الخلية باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق.
- لوحة الخلايا في 2 مل من ويليامز وسائل الإعلام E 1X يحتوي على الذوبان الكبدية الابتدائي والمكملات الطلاء على الكولاجين المغلفة م 6-جيداكتلة الثقافة ليرة لبنانية (9 × 10 5 خلايا لكل بئر).
- بعد 4 ساعات، وتغيير وسائل الاعلام ويليامز 'وسائل الإعلام E 1X التي تحتوي على ملاحق صيانة الكبدية الأولية.
- بعد 24 ساعة، والمصل تجويع الخلايا مع Dulbecco ومتوسطة النسر المعدلة (DMEM) وسائل الاعلام 1X لمدة 6 ساعات.
- علاج الخلايا مع برنامج تلفزيوني كما مركبة، FGF23 (25 نانوغرام / مل)، LPS (100 ميكروغرام / مل) أو IL-6 (50 نانوغرام / مل) في المصل خالية المتوسطة واحتضان لمدة 24 ساعة.
4. عزل الحمض النووي الريبي
- تحضير الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة عمود الدوران التجارية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
5. توليد كدنا] من الحمض النووي الريبي معزولة عن طريق النسخ العكسي
- إضافة 200 نانوغرام من عينة الحمض النووي الريبي معزولة إلى أنبوب PCR.
- إضافة 14 ميكرولتر من خالية من نوكلياز داخلية H 2 O لPCR أنبوب من الخطوة 5.1.
- إضافة 4 ميكرولتر من الناسخ العكسي لأنبوب PCR من الخطوة 5.1.
- اعادة تعليق محتويات بلطف لجعل الخليط متجانسا. أجهزة الطرد المركزي بلطف. وضع أنبوب PCR التي تحتوي على الخليط في thermocycler. تشغيل thermocycler لعكس النسخ: 1 دورة من 25 درجة مئوية (5 دقائق)، 42 ° C (30 دقيقة)، 85 ° C (5 دقائق)، ثم عقد في 4 درجات مئوية. سوف يكون المنتج النهائي للكدنا] المرجوة.
6. تحليل الخلايا بواسطة الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QPCR)
- إعداد لوحة 96-جيدا.
- وضع جميع مكونات رد فعل QPCR على الجليد: 1 ميكرولتر كدنا]، 0.25 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام، 0.25 ميكرومتر التمهيدي العكسي، 5 ميكرولتر SYBR الأخضر، 3.5 ميكرولتر PCR الصف المياه إلى وحدة تخزين ما مجموعه 10 ميكرولتر. باستخدام SYBR الخضراء، وإعداد مزيج الرئيسي لتشغيل جميع العينات في ثلاث نسخ.
- مرة واحدة مزيج الرئيسي اكتمال، دوامة لجعل متجانسة. قسامة 9 ميكرولتر من QPCR مزيج الرئيسي في كل بئر من لوحة 96-WLL. بعد، إضافة بعناية 1 ميكرولتر من [كدنا في كل بئر. سيصبح إجمالي حجم رد الفعل 10 ميكرولتر.
- بعد تحميل كاملة، وختم لوحة 96-جيدا مع البصريةفيلم لاصقة وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لوحة 96-جيدا (50 x ج لمدة 1 دقيقة).
- عينات تشغيل في صك في الوقت الحقيقي-PCR. وضع ختم لوحة 96-جيدا في ريال مدريد أداة الوقت-PCR وتشغيل عينات حسب توصيات الشركة الصك. يتم تضمين أمثلة من الدورات العادية والسريعة أدناه.
- لالمعلمات الدراجات القياسية، استخدم ما يلي: تمسخ الأولي في 94 درجة مئوية لمدة 120 ثانية، ثم 40 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية، ثم اضغط اختياريا في 4 درجات مئوية.
- لالمعلمات ركوب الدراجات بسرعة: استخدم ما يلي: تمسخ الأولي في 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، ثم 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان، 58 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، ثم 72 درجة مئوية لمدة 10 ثانية.
- الرجوع إلى دليل أداة لتوجيهات بشأن كيفية تحليل البيانات.
7. تحليل Supernatants خلية بواسطة ELISA
ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- الاستغناء عن 398 ميكرولتر من مخفف في أنابيب منفصلة. ماصة 2 ميكرولتر من عينة الخلية طاف في أنبوب مخفف 398 ميكرولتر. وهذا سيوفر أضعاف التخفيف من 200.
- كرر الخطوة 7.1.1 لكل عينة لفحصها.
- ماصة 100 ميكرولتر من 200 أضعاف العينة المخففة ومعيار في آبار من لوحة 96-جيدا.
- احتضان لوحة 96-جيدا في درجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة على شاكر صفيحة ميكروسكوبية 150 دورة في الدقيقة.
- غسل الآبار 5 مرات مع حل العازلة 1X غسل. وبمجرد الانتهاء من غسل الماضي، وإزالة جميع محلول الغسيل المتبقية مع ورقة ماصة.
- إضافة 500 ميكرولتر من كاشف HRP-المترافقة في كل بئر.
- كرر الخطوات من 7.2.2 - 7.2.3.
- ماصة 100 ميكرولتر من tetramethylbenzidine (TMB) كاشف في كل بئر من لوحة 96-جيدا.
- المزيج بلطف لوحة 96-جيدا في درجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على صفيحةشاكر في 150 دورة في الدقيقة. وقف رد الفعل بإضافة مباشرة 100 ميكرولتر من توقف حل كل بئر وتخلط بلطف. مرة واحدة يتم إضافة الحل محطة اللون يجب أن تتحول الصفراء. هذا يعلم أن الحل محطة كان مختلطا بشكل صحيح.
- باستخدام لوحة القارئ عيار مكروي، وتحديد الكثافة البصرية في 450 نانومتر خلال 5 دقائق الأولى.
- حساب جدول متوسط قيم الامتصاصية (A 450) لكل عينة ولكل معيار.
- تجميع منحنى القياسية بالتآمر المتوسط بقيمة 450 لكل معيار ضد تركيزه القياسي في نانوغرام / مل على الرسم البياني الخطي. السماح للمحور س لتمثيل تركيز والمحور الصادي لتمثيل 450 القيم.
- الاستفادة من يعني 450 من كل عينة المخفف، وتحديد تركيز البروتين المطلوب في نانوغرام / مل من المنحنى القياسي.
- مضاعفة تركيز العينة التي كتبها التخفيف الواقعص. وهذا سوف يسمح لتحديد تركيز الفعلي للبروتين المطلوب في نموذج خلية طاف.
- رسم الجدول شيدت من العينات في الرسم البياني خط. اذا انخفضت OD 450 القيم خارج المنحنى القياسي، يجب تخفيف العينات بشكل مناسب واختبارها من جديد.
- تطبيع النتائج إلى 500،000 الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
علم الانسجة
وصفت الممثلة صور المجهر الضوئي من الخلايا المعزولة ومثقف الابتدائي في الشكل 1A. يوضح تحليل Immunocytochemical أن خلايا الكبد معزولة تعبر عن درجة عالية من الزلال (الحمراء)، وكذلك نمو الخلايا الليفية مستقبلات عامل 4 (FGFR4) (الخضراء). هي ملطخة النوى مع 4 "، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) (الأزرق). (الشكل 1B).
الكمي في الوقت الحقيقي PCR
تم علاج خلايا الكبد معزولة الأولية مع FGF23 (25 نانوغرام / مل) LPS (100 ميكروغرام / مل) أو IL-6 (50 نانوغرام / مل) لمدة 24 ساعة ومستويات مرنا من البروتين و IL-6 تم تحليلها من قبل الكمي في الوقت الحقيقي PCR . FGF23، LPS وIL-6 زيادة كبيرة في التعبير عن بروتين سي التفاعلي و IL-6. (الشكل 2A)
= "1"> ELISA
وقد تم تحليل supernatants ثقافة خلية من خلايا الكبد الأولية معزولة بواسطة ELISA لمستويات بروتين سي التفاعلي. وتماشيا مع تحليلنا PCR الكمي في الوقت الحقيقي، LPS، IL-6 وكذلك العلاجات FGF23 زيادة كبيرة في مستويات بروتين سي التفاعلي في supernatants خلية بالمقارنة مع الخلايا المعالجة برنامج تلفزيوني. (الشكل 2B)
الشكل 1: (أ) مرحلة تباين الصورة المجهرية للخلايا الكبد الأولية الفئران المعزولة. بعد 24 ساعة من الطلاء، والخلايا يحمل شكل يشبه مسدس، وغالبا ما تظهر ثنائية الأنوية. (شريط مقياس = 100 ميكرون). يكشف (B) المناعي التحليل المجهري أن غالبية الخلايا المعزولة تعبر عن الزلال (الحمراء)، علامة-الكبدية محددة. خلايا أيضا التعبير عن غاية FGFR4 (الخضراء). دابي البقع نوى. التكبير الأصلي 40عاشرا (مقياس بار = 50 ميكرون). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الكمي في الوقت الحقيقي تحليل PCR لالمعزولة الفئران خلايا الكبد الأولية لتحديد ما CRP و IL-6 التعبير. (A) LPS، IL-6 و FGF23 العلاجات زيادة مستويات مرنا من البروتين بالمقارنة مع الخلايا المعالجة برنامج تلفزيوني. (يتم التعبير عن القيم كما تغير أضعاف ± SEM؛ ف <0.01، ن = 3 العزلة مستقلة). (ب) خلايا تعامل مع LPS، IL-6 أو إظهار FGF23 أيضا زيادة كبيرة في مستويات مرنا من IL-6 بالمقارنة مع العلاجات برنامج تلفزيوني. (يتم التعبير عن القيم كما تغير أضعاف ± SEM؛ ف <0.001، ن = 3 العزلة مستقلة) (C) الكمي لمستويات بروتين CRP فيsupernatants من خلايا الكبد الأولية الفئران المعزولة عن طريق فحص انزيم مرتبط المناعي (ELISA). LPS، IL-6 و FGF23 زيادة كبيرة في مستويات بروتين CRP بالمقارنة مع العلاجات برنامج تلفزيوني. وتمثل القيم تركيزات بروتين سي التفاعلي في ملغم / ديسيلتر في 500،000 الخلايا. (ف <0.05، ن = 3 العزلة مستقلة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عزل خلايا الكبد الأولية من الفئران هو أداة سريعة وغير مكلفة ويمكن الاعتماد عليها لدراسة الاستجابات الالتهابية خارج الحي. إذا أجريت بشكل صحيح، النتائج التي يمكن أن تتولد بسهولة ومستنسخة في الوقت المناسب وبطريقة فعالة من حيث التكلفة. وينبغي تقييم النقاط التالية بعناية من أجل ضمان العزلة الناجحة.
وينبغي إجراء شق جراحي وإقناء؛ إدخال القنية من IVC تحت التخدير العام وليس بعد القتل الرحيم. وهناك الشباب، محقق عديم الخبرة تحتاج إلى مزيد من الوقت في البداية للتعرف على السمات التشريحية للبطن الفئران وإجراء إقناء؛ إدخال القنية الصحيح. الحفاظ على الحيوانات المانحة على قيد الحياة حتى يبدأ نضح، وسوف تزيد بشكل كبير من بقاء الخلايا المعزولة. يجب أن يتم تنفيذ عملية ربط للIVC فوق والكبد لأنه سيؤدي إلى زيادة كبيرة في محصول خلايا الكبد معزولة. بدلا من ذلك، المشبك الصغير الجراحية يمكن أن توضع على الوريد الأجوف السفلى.ومع ذلك، وبعد بضع الصدر، والحيوان تصبح المتوفى في غضون بضع دقائق. وبالتالي يجب أن يتم تنفيذ كل الخطوات اللاحقة على الفور للتأكد من أن الكبد يحافظ على تدفق الدم الكافي حتى بدء الارواء. لإقناء؛ إدخال القنية، واستخدام القسطرة الوريدية قابل للسحب ينصح بشدة. بعد cannulating في IVC، إبرة القسطرة يمكن سحب بعناية، مما يقلل من خطر ثقب السفينة. الخطوة الحاسمة الأخيرة هي ربط نظام نضح إلى القسطرة. بعد إزالة الإبرة من القسطرة، يجب الدم تستنزف من نهاية القسطرة قبل توصيله إلى مضخة نضح. هذه الخطوة تقلل من خطر الهواء الصمات، الذي يمكن أن يسبب انخفاض كبير في كمية وكذلك نوعية خلايا معزولة.
وما أن يبدأ نضح، ينبغي أن الكبد على الفور ومتجانس تغيير لونه من الأحمر إلى الأصفر الشاحب. والأجزاء المتبقية الأحمر تشير insufficنضح ient أو وجود الهواء الصمات. يجب مرارا إجراء الغسيل وتنقية الخلايا المعزولة. وهذا يضمن إزالة فعالة من حطام خلية الزائد. وخلايا الكبد معزولة صحية الالتزام ضمن ح 4 الأولى من يجري مطلي. ومن هنا، وسائل الإعلام تصفيح يمكن تغيير إلى وسائل الإعلام الصيانة في هذه المرحلة الزمنية. بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها، وسوف تظهر الخلايا في شكل أكثر سداسية مع نواة بارزة. خلايا الكبد يمكن أيضا أن تكون ثنائية النووية (الشكل 1A). تحبيب أو blebbing الخلوية هو مؤشر لعزل الفقيرة. إذا خلايا الكبد بشكل مستمر لا تلتزم بشكل صحيح أو لا يزال بقاء الخلية منخفض، يجب أن تتغير كمية وسائل الإعلام الهضم استخدامها لنضح. وهذا ينبغي تجنب الإفراط أو underdigestion من أنسجة الكبد.
إذا كنت بحاجة لعائدات أعلى من الخلايا، ونضح تقدمي عبر الوريد البابي لا يمكن أن يؤديها. Klaunig وآخرون. قد أظهرت أن هذه التقنية معينة يمكن أن يزيد محصول الخلية. بديلernatively، يمكن تطبيقها بعد الوريد البابي إقناء؛ إدخال القنية الشبك متقطعة من IVC. سيؤدي هذا إلى زيادة دورية لضغط خلال نضح ويفترض أيضا أن زيادة العدد الكلي للخلايا معزولة. الوقت نضح وكذلك معدل نضح قد يتعين تعديل 14. نحن، ومع ذلك، لم تؤد بروتوكولات نضح بديلة.
بعد أول العزلة الناجحة، ينبغي إجراء المناعية-الكبدية محددة (على سبيل المثال لالزلال) لضمان نقاء العزلة (الشكل 1B). بعد 24 ساعة من العزلة، خلايا الكبد يجب أن المصل تجويع لمدة 4 إلى 8 ساعات وبعد ذلك يستخدم لعلاج. عند دراسة استجابة المرحلة الحادة، وخلايا يمكن علاجها مع LPS، والذي يعرف للحث على التهاب عبر تول مثل مستقبلات 4 و NF كيلوبايت 15. السيتوكينات الموالية للالتهابات، مثل IL-6، توسط آثارها من خلال انترلوكين مستقبلات 16.وعلاوة على ذلك، قمنا في الآونة الأخيرة أظهرت أن FGF23 يمكن تنشيط FGFR4 وPLCγ / الكالسينيورين / NFAT مسار وتحفز استجابة التهابية في الكبد 7 و 17. لضمان النسخ والترجمة من الجينات المستهدفة كافية، يجب أن تعامل الخلايا لمدة 24 ساعة. عزل مرنا وتحليل التوالي في التعبير الجيني باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي PCR مع إليسا من supernatants خلية يقدم معلومات قوية التي يمكن بسهولة أن تتكرر. وهذا يسمح للتحقيق من وسطاء الموالية للالتهابات جديدة، مستقبلاته الكبدية وآليات إشارات المصب متتالية بهم. والخلايا الأولية معزولة، وخاصة من الحيوانات المعدلة وراثيا تقديم نتائج متفوقة بالمقارنة مع خطوط الخلايا السرطانية عامة مثل خلايا HepG2 وHep3B. نظرا لبساطته، وهذا النهج يمكن أن تستخدم أيضا لفحوصات للتحقيق في تأثير الأدوية الجديدة. ومع ذلك، ودراسة الدوائية معقدة أو patho-physioloوسوف تتطلب آليات gical التجارب تأكيدي إضافية، وذلك أساسا في الإعداد في الجسم الحي.
لم نقم بإجراء دراسات على المدى الطويل منذ خلايا الكبد معزولة تميل إلى dedifferentiate في غضون بضعة أيام. ومع ذلك، يمكن التغلب على ذلك من خلال تقنيات زراعة الخلايا الخاصة، كما ذكرت من قبل الآخرين 18. وتشمل هذه الكولاجين التكوين المزدوج هلام، الكروية الكبدية، وشارك في الثقافة مع الخلايا البطانية، وmicropatterned المشترك الثقافات مع الخلايا الليفية 3T3-J2. معا، وعزل خلايا الكبد الكبار الفئران الابتدائية يوفر أداة قوية للعلماء المهتمين في الايض، والتهاب، والحصانة واستجابة الكبدية للأدوية والسموم. ويتميز هذا الجدوى بسيط، والتكاليف المعتدلة والتكاثر السريع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم تضارب المصالح إلى إعلان.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01HL128714 إلى CF) و (F31DK10236101 إلى KS)، وجمعية القلب الأمريكية (قوات التحالف وAG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer | Falcon | 352350 | |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381412 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
| 100 6-inch Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | |
| 1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2 | Becton Dickinson | 329420 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style | Corning | 353003 | |
| 6 well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| 5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards) | LOOK | SP115 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Minipuls 3 Perfusion Pump | Gilson | F155007 | |
| Hemacytometer Kits, Propper | VWR | 48300-474 | |
| Hemacytometer Cover Glasses, Propper | VWR | 48300-470 | |
| Surgical Scissers - Sharp/Blunt | F.S.T. | 14001-12 | |
| Iris Scissors-ToughCut Straight | F.S.T. | 14058-11 | |
| Dumont SS-45 Forceps | F.S.T. | 11203-25 | |
| Student Tissue Forceps | F.S.T. | 991121-12 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetic acid solution, 2.0 N | Sigma | A8976-100ML | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL) | VEDCO | 50989-161-06 | |
| Xylazine 100 mg/mL | AnaSed Injection | 139-236 | |
| Willams' Medium E (1x) | gibco | 12551-032 | |
| Liver Perfusion Medium (1x) | gibco | 17701-038 | |
| Liver Digest Medium (1x) | Life Technologies | 17703034 | |
| Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | Life Technologies | CM3000 | |
| Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | Life Technologies | CM4000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4 | ThermoFisher scientific | 10010031 | |
| Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Trypan Blue Solution | VWR | 45000-717 |
References
- Silverstein, D. M. Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and cardiovascular disease. Pediatr Nephro. 24 (8), 1445-1452 (2008).
- Isakova, T., et al. Fibroblast growth factor 23 is elevated before parathyroid hormone and phosphate in chronic kidney disease. Kidney Int. 79 (12), 1370-1378 (2011).
- Faul, C., et al. FGF23 induces left ventricular hypertrophy. J Clin Invest. 121 (11), 4393-4408 (2011).
- Gutiérrez, O. M., et al. Fibroblast growth factor 23 and mortality among patients undergoing hemodialysis. N England J Med. 359 (6), 584-592 (2008).
- Munoz Mendoza, J., et al. Fibroblast growth factor 23 and Inflammation in CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 7 (7), 1155-1162 (2012).
- Hanks, L. J., Casazza, K., Judd, S. E., Jenny, N. S., Gutiérrez, O. M. Associations of Fibroblast Growth Factor-23 with Markers of Inflammation, Insulin Resistance and Obesity in Adults. PLoS ONE. 10 (3), e0122885 (2015).
- Singh, S., et al. Fibroblast growth factor 23 directly targets hepatocytes to promote inflammation in chronic kidney disease. Kidney Int. , 1-12 (2016).
- Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
- Moshage, H. J., et al. The effect of interleukin-1, interleukin-6 and its interrelationship on the synthesis of serum amyloid A and C-reactive protein in primary cultures of adult human hepatocytes. Bioch Biophysi Res Commun. 155 (1), 112-117 (1988).
- Soldatow, V. Y., LeCluyse, E. L., Griffith, L. G., Rusyn, I. In vitro models for liver toxicity testing. Toxicol. Res. 2 (1), 23-39 (2013).
- Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure. J Vis Exp. (79), (2013).
- Kegel, V., et al. Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells. J Vis Exp. (109), (2016).
- Moshage, H., et al. Cytokines and the hepatic acute phase response. J Pathol. 181 (3), 257-266 (1997).
- Klaunig, J. E., et al. Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation. In vitro. 17 (10), 913-925 (1981).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Schmidt-Arras, D., Rose-John, S. IL-6 pathway in the liver: From physiopathology to therapy. J Hepatol. 64 (6), 1403-1415 (2016).
- Grabner, A., et al. Activation of Cardiac Fibroblast Growth Factor Receptor 4 Causes Left Ventricular Hypertrophy. Cell Metab. 22 (6), 1020-1032 (2015).
- Shulman, M., Nahmias, Y. Chapter 17, Long-Term Culture and Coculture of Primary Rat and Human Hepatocytes. Methods Mol Biol. 945, 287-302 (2012).
