Summary
Her viser vi en enzymatisk metode for å isolere primære hepatocytter fra voksne mus, og vi beskriver kvantifisering av en betennelsesreaksjon ved hjelp av ELISA og real-time PCR.
Abstract
Leveren spiller en avgjørende rolle i reguleringen av systemisk inflammasjon. Ved kronisk nyresykdom i særdeleshet, reagerer leveren i respons til uremisk miljø, oksidativt stress, endotoksemi og redusert clearance av sirkulerende proinflammatoriske cytokiner ved å fremstille et stort antall av akutt-fase reaktanter. Eksperimentelle verktøy for å studere betennelse og den underliggende rolle av hepatocytter er avgjørende for å forstå regulering og bidraget av lever cytokiner til en systemisk akutt faserespons og en forlenget pro-inflammatorisk banen, særlig i en innviklet omgivelser slik som kronisk nyresykdom. Etter å ha studert komplekse mekanismer for betennelse in vivo er fortsatt utfordrende, ressurskrevende og krever vanligvis bruk av transgene dyr, primære isolerte hepatocytter gi et robust verktøy for å få mekanistiske innsikt i lever akutt fase respons. Siden denne in vitro teknikk har moderate kostnader, høy reproducibility og felles teknisk kunnskap, primære isolerte hepatocytter kan også enkelt brukes som en screening tilnærming. Her beskriver vi en enzymatisk-basert metode for å isolere primære muse hepatocytter, og vi beskriver vurderingen av en betennelsesreaksjon i disse cellene ved hjelp av ELISA og kvantitativ real-time PCR.
Introduction
Kronisk nyresykdom (CKD) kan defineres som en tilstand av akutt og kronisk inflammasjon 1. Hos pasienter med CKD, serumnivåer av den phosphaturic hormonet fibroblast vekstfaktor 23 (FGF23) progressivt stige for å opprettholde serumfosfat homeostase 2. Økte serum FGF23 nivåer er uavhengig assosiert med kardiovaskulær sykelighet og dødelighet blant pasienter som begynner hemodialyse behandling tre, fire. Videre har flere kliniske studier har vist en sterk korrelasjon mellom forhøyede nivåer FGF23 og serumnivåer av c-reaktivt protein (CRP), Interleukin-6 (IL-6) og tumornekrosefaktor α (TNFa) 5, 6. Videre, i en eksperimentell studie, vi har nylig vist at FGF23 kan direkte rettet mot hepatocytter og forårsake en betennelsesreaksjon ved å øke CRP og IL-6 production i leveren 7. Derfor, FGF23 kan fungere som en sirkulerende faktor som bidrar til systemisk inflammasjon i CKD.
På begynnelsen av 70-tallet, primære hepatocytter ble isolert og undersøkt for første gang 8. Siden den primære dyrkede leverceller har blitt mye brukt for å undersøke metabolsk behandling, hormonal funksjon, legemiddelmetabolisme og giftighet, så vel som immunresponser og inflammatoriske responser 9, 10. Tidligere protokoller har i hovedsak beskrevet enzymatisk isolering av primære hepatocytter fra menneske levervev 11, 12. Mens en utmerket modell, etterlater denne ut muligheten til å studere hvordan genetisk manipulasjon påvirker komplekse leversignalmekanismer samt funksjonelle konsekvenser ved ulike typer stimuli. I det følgende vil vi beskrive isolering av murine primære hepatocytter. Spesielt kan virkningen av flere mediatorer av den hepatiske akutt fase respons, slik som lipopolysakkarid (LPS), IL-6 og FGF23 analyseres i en enkel, hurtig og reproduserbar måte 13.
Heri presenterer vi en protokoll for den enzymatiske isolering av hepatocytter fra voksne mus, og vi vise at etablerte indusere av inflammasjon, slik som LPS og IL-6, så vel som nye inflammatoriske mediatorer slik som FGF23, kan direkte stimulere ekspresjon og sekresjon av inflammatoriske cytokiner, slik som CRP og IL-6 i dyrkede hepatocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr protokoller og eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of Miami Miller School of Medicine.
1. Forberedelse
- Forvarm lever perfusjon media og leveren fordøye media i et vannbad ved 37 ° C.
- Sett opp en perfusjon pumpe (30 ml / min). forfyll nøye rørsystemet av pumpen med leveren perfusjon media. Unngå luftbobler i systemet og forberede stereomikroskop.
- Coat cellekultur retter med kollagen type I henhold til produsentens protokoll.
2. Lever Recovery
- Anesthetize donor mus ved hjelp av oksygen / isofluran inhalasjon (isofluran 4% / 2 l / min oksygen).
- Opprettholde anestesi ved å senke isofluran til 2-2,5%, eller ved injisering av ketamin (100 mg / kg kroppsvekt intraperitonealt) og xylazin (10 mg / kg kroppsvekt intraperitoneally). Kontinuerlig isoflurananestesi foretrekkes, da ketamin senker blodtrykket og kan føre til hepatotoksisitet.
- Plasser bedøvet musen på en absorberende pute. Fix musens ekstremiteter med teip.
- Barbere og desinfisere magen av musen og utføre en ventral laparotomi fra pubis til hjerne grensen av leveren ved hjelp av kirurgisk saks med skarpe / butt tips. Innsnittet bukveggen til begge sider, kaudal av membranen.
- Expose inferior vena cava (IVC) ved forsiktig å flytte tarmen til høyre side. dissekere fettvev rundt IVC nøye ved hjelp av sterile bomull tips spinner og vinklede tips tang.
- Incise den suprahepatic membran og åpne brysthulen av to laterale snitt bruker gode kirurgiske saks med skarpe / spisse tips. Ligate thorax IVC hjelp kirurgisk silke (5/0).
- Cannulate infrarenale IVC via en skjermet iv kateter, fjernes kanylen forsiktig,koble perfusjon pumpen og starte perfusert leveren. Hvis det utføres riktig, bør leveren umiddelbart begynne å forvelle og svelle.
- Transektet portvenen slik at passende drenering av blod og perfusjon media hjelp av gode kirurgiske saks.
- Perfuse leveren med ca 30 ml lever perfusjon media, og deretter bytte til leveren fordøye media (30 ml). Slå av perfusjon pumpen og fjern kanylen når perfusjon er fullført.
- Forsiktig utsette det sentrale område av leveren og lokalisere forbindelses vev som forbinder de lever fliker. Grab de sentrale sammenhengende fiber og nøye dissekere alle vev som holder leveren på plass, og fjern forsiktig leveren.
- Umiddelbart overføre leveren inn i et 50 ml polypropylen-konisk rør inneholdende 15 ml av leveren fordøye media.
MERK: Det er ingen spesifikk tidslinje for dette trinnet. Etter perfusjon, forblir leveren i fordøye media for transport til et sterilt cellekultur hette. alle subsequent trinn skal utføres i et sterilt miljø.
3. Isolering og behandling av celler
- Innenfor en cellekultur hette, overføre leveren fra 50 ml polypropylen konisk rør som inneholder fordøyelsen medier i et sterilt vev kultur parabolen.
- Ved å bruke steril pinsett, forsiktig rive de fire fliker av leveren. Hvis det utføres riktig, bør fordøyelsen medium blir grumset på grunn isolere hepatocytter fra leveren.
- Ved hjelp av en 25 ml steril pipette, filtreres den uklare fordøyelse medium gjennom et 70 mikrometer nylon celle sil inn i en ny 50 ml polypropylen konisk rør for å fjerne ufordøyd vev partikler og celleavfall.
- Gjenta trinn 3,2 og 3,3 med steril fosfatbufret saltløsning (PBS). Dette hjelper med å fjerne eventuelle gjenværende hepatocytter fra leveren.
- Sentrifuger ved 50 x g i 2 min ved 4 ° C. Aspirer supernatanten inneholdende overskudd av cellerester og forsiktig re-suspendere cellene i 25 ml kald 1xWilliams 'Medium E.
- Ved hjelp av en 25 ml steril pipette, filtrere re-suspensjonen gjennom en ny 70 mikrometer nylon celle sil inn i en 50 ml konisk rør av polypropylen for å oppnå et renere suspensjon.
- Gjenta trinn 3.5 og 3.6 for ytterligere tre vasker bruker kaldt Williams 'Medium E 1x for å få et klarere cellesuspensjon.
- Etter den siste vasketrinn, for å aspirere supernatanten fjerne overskudd av cellerester. Re-suspendere og filtrere cellene i 25 ml varm Williams 'Media E 1x som inneholder primære hepatocytter tining og plating kosttilskudd gjennom en ny 70 mikrometer nylon celle sil inn i en 50 ml polypropylen konisk tube.
- Tell cellene i 25 ml cellesuspensjon ved bruk av et hemocytometer. I gjennomsnitt forventer 15 - 20 millioner celler per voksen leveren. Bestem celleviabilitet ved hjelp av trypanblått farging.
- Plate celler i 2 ml Williams 'Media E 1x som inneholder primære hepatocytter tining og plating kosttilskudd på en kollagen belagt seks-brønns cell kultur klynge (9 x 10 5 celler per brønn).
- Etter 4 timer, endre media til Williams 'Media E 1x som inneholder primære hepatocytter vedlikeholdstilskudd.
- Etter 24 timer i serum sulte celler med Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) media 1x i 6 timer.
- Behandle cellene med PBS som kjøretøy, FGF23 (25 ng / ml) LPS (100 ug / ml) eller IL-6 (50 ng / ml) i serumfritt medium og inkuberes i 24 timer.
4. Isolering av RNA
- Forbered RNA ved hjelp av et kommersielt spin kolonne kit i henhold til produsentens instruksjoner.
5. Generere cDNA fra isolerte RNA ved revers transkripsjon
- Tilsett 200 ng av isolert RNA prøven til et PCR-rør.
- Legg 14 mL av endonuklease-free H 2 O til PCR rør fra trinn 5.1.
- Tilsett 4 mL av revers transkriptase PCR rør fra trinn 5.1.
- Re-suspendere innholdet forsiktig for å gjøre blandingen homogen; sentrifuger forsiktig. Plasser PCR-rør inneholdende blandingen i en termosykler. Kjør termo for revers transkripsjon: en syklus på 25 ° C (5 min), 42 ° C (30 min), 85 ° C (5 min) og hold deretter ved 4 ° C. Sluttproduktet vil være det ønskede cDNA.
6. Analyse av celler ved kvantitativ real-time PCR (qPCR)
- Forbered 96-brønns plate.
- Plassere alle komponentene i qPCR reaksjon på is: 1 ul cDNA, 0,25 uM forover primer, 0,25 uM revers primer, 5 ul SYBR Green, 3,5 ul PCR karakter vann til et totalt volum på 10 ul. Ved hjelp av SYBR Green, forberede mester mix å kjøre alle prøvene i tre eksemplarer.
- Når master mix er fullført, vortex gjøre homogen. Alikvot 9 mL av qPCR masterblanding i hver brønn av en 96-wll plate. Etter forsiktig tilsett 1 pl av cDNA inn i hver brønn. Totalt reaksjonsvolum blir 10 ul.
- Etter lasting er ferdig, forsegle 96-brønns plate med optiskklebefilmen og kort sentrifuge 96-brønns plate (50 x g i 1 min).
- Kjør prøver i en Real Time PCR instrument. Plasser forseglet 96-brønns plate til Real Time PCR instrument og kjøre prøvene som per instrument produsentens anbefalinger. Eksempler på standard og raske sykluser er inkludert nedenfor.
- For standard sykling parametere, bruker du følgende: innledende denaturering ved 94 ° C i 120 s, deretter 40 sykluser på 94 ° C i 15 s, 60 ° C i 60 s, og deretter eventuelt holde ved 4 ° C.
- For raske Syklusparametrene: bruke følgende: innledende denaturering ved 94 ° C i 30 s, deretter 40 sykluser med 95 ° C i 5 s, 58 ° C i 15 s, og deretter 72 ° C i 10 sek.
- Se i instrumenthåndboken for veiledning om hvordan å analysere data.
7. Analyse av cellesupernatanter av ELISA
MERK: Alle trinnene er utført i henhold til produsentens protokoll.
- Tilsett 398 mL av fortynningsmiddel i separate rør. Pipetter 2 mL av cellesupernatanten prøven i 398 ul fortynningsmiddel rør. Dette vil gi en utvanning fold på 200.
- Gjenta trinn 7.1.1 for hver prøve som skal testes.
- Pipetter 100 ul av 200-ganger fortynnet prøve og en standard inn i brønnene til en 96-brønns plate.
- Inkuber 96-brønners plate ved 25 ° C i 45 minutter på en mikroplaterister ved 150 omdreininger pr.
- Vask brønnene 5 ganger med 1 x vaskebuffer oppløsning. Når den siste vaskingen er ferdig må alle rester av vaskeløsning med absorberende papir.
- Legg 500 ul av HRP-konjugat reagens inn i hver brønn.
- Gjenta trinn 7.2.2 - 7.2.3.
- Pipetter 100 ul av tetrametylbenzidin (TMB) reagens inn i hver brønn av 96-brønns plate.
- Bland forsiktig 96-brønners plate ved 25 ° C i 20 min på en mikroplaterystemaskin ved 150 rpm. Stopp reaksjonen ved direkte å tilsette 100 mL stopp løsning til hver brønn og bland forsiktig. Når stopp løsning tilsettes fargen skulle bli gul. Dette opplyser at stopp løsning er riktig blandet.
- Ved hjelp av en mikrotiterplateleser, bestemme den optiske tetthet ved 450 nm i løpet av de første 5 min.
- Beregne en tabell av gjennomsnittlig absorbans-verdier (A 450) for hver prøve og hver standard.
- Montere en standard kurve ved å plotte A 450 gjennomsnittet av hver standard mot dennes standardkonsentrasjon i ng / ml på en lineær graf. La x-aksen representerer konsentrasjonen og y-aksen for å representere en 450 verdier.
- Ved å benytte den midlere A 450 fra hver fortynnet prøve, å bestemme konsentrasjonen av det ønskede protein i ng / ml fra standardkurven.
- Multipliser prøven konsentrasjonen av fortynning factor. Dette vil gi rom for å bestemme den virkelige konsentrasjonen av det ønskede protein i cellesupernatanten prøven.
- Plott konstruert bordet fra prøvene til et linjediagram. Hvis OD 450 verdier faller utenfor standardkurven, må prøvene fortynnes riktig og re-testet.
- Normal resultater 500.000 celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
histologi
Representative lys mikroskopi bilder av primære isolerte og dyrkede celler er vist i figur 1A. Immunocytokjemisk analyse viser at isolerte hepatocytter sterkt uttrykker albumin (rød), så vel som fibroblast-vekstfaktor-reseptor 4 (FGFR4) (grønn). Kjerner er farget med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (blå). (Figur 1B).
Kvantitativ real-time PCR
Primære isolerte hepatocytter ble behandlet med FGF23 (25 ng / ml) LPS (100 ug / ml) eller IL-6 (50 ng / ml) i 24 timer og mRNA-nivåer av CRP og IL-6 ble analysert ved hjelp av kvantitativ real-time PCR . FGF23, LPS og IL-6 signifikant økt ekspresjon av CRP og IL-6. (Figur 2A)
Cellekultursupernatanter fra isolerte primære hepatocytter ble analysert ved hjelp av ELISA for CRP-nivå. I samsvar med vår kvantitativ real-time PCR-analyse, LPS, IL-6, så vel som FGF23 behandlinger betydelig øket CRP-nivå i cellesupernatanter sammenlignet med PBS-behandlede celler. (Figur 2B)
Figur 1: (A) Fasekontrast mikroskopisk bilde av isolerte murine primære hepatocytter. 24 timer etter plating, celler viser en sekskant-lignende form og ofte vises bi-kjernedannet. (Scale bar = 100 nm); (B) Immunofluorescens mikroskopisk analyse viser at et flertall av isolerte celler uttrykker albumin (rød), en hepatocytt-spesifikk markør. Celler også sterkt uttrykk FGFR4 (grønn). DAPI flekker kjerner. Original forstørrelse 40X. (Scale bar = 50 mikrometer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Kvantitativ Real-time PCR-analyse av isolerte Murine primære hepatocytter fastslår CRP og IL-6 Expression. (A) LPS, IL-6 og FGF23 behandlinger i betydelig grad øke mRNA-CRP-nivå sammenlignet med PBS-behandlede celler. (Verdiene er uttrykt som ganger endring ± SEM; p <0,01, n = 3 uavhengige isolater). (B) celler ble behandlet med LPS, IL-6 eller FGF23 viser også en signifikant økning i mRNA-nivåer av IL-6 i forhold til PBS behandlinger. (Verdiene er uttrykt som ganger endring ± SEM; p <0,001, n = 3 uavhengige isolater) (C) Kvantifisering av CRP proteinnivåer isupernatanter fra isolerte murine primære hepatocytter ved hjelp av enzymbundet immunosorbent assay (ELISA). LPS, IL-6 og FGF23 betydelig øke CRP-proteinnivåer sammenlignet med PBS behandlinger. Verdier representerer CRP-konsentrasjoner i mg / dl pr 500.000 celler. (P <0,05, n = 3 uavhengige isolater). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolere primære hepatocytter fra mus er en rask, billig og pålitelig verktøy for å studere inflammatoriske responser ex vivo. Hvis utført riktig, kan resultatet lett bli generert og gjengitt i en tidsriktig og kostnadseffektiv måte. Følgende punkter bør vurderes nøye for å sikre en vellykket isolasjon.
Den kirurgiske innsnitt og kanylering av IVC skal utføres under narkose og ikke etter aktiv dødshjelp. En ung, uerfaren etterforsker vil trenge mer tid i begynnelsen for å bli kjent med de anatomiske trekk ved murine magen og å utføre en korrekt kanylering. Holde donor dyret i live til perfusjon starter, vil øke levedyktigheten til isolerte celler. Ligering av supra-lever IVC skal utføres, siden det vil øke utbyttet av isolerte hepatocytter. Alternativt kan en mikro-kirurgisk klemme plasseres på IVC.Men etter torakotomi, vil dyret bli døde i løpet av et par minutter. Derav alle etterfølgende trinn skal utføres så raskt som mulig for å sikre at leveren opprettholder tilstrekkelig blodtilførsel til oppstart av perfusjon. For kanylering, er bruken av en uttrekkbar venekateter sterkt anbefalt. Etter kanylerør den IVC, kan kateter nålen være omhyggelig trukket tilbake, noe som reduserer risikoen for fartøyet perforering. Den siste kritiske trinn er tilkoblingen av perfusjon systemet til kateteret. Når nålen er fjernet fra kateteret, bør blod renne fra enden av kateteret før du kobler den til en perfusjon pumpe. Dette trinnet reduserer faren for luft-emboli, noe som kan føre til en betydelig reduksjon i kvantitet samt kvalitet av isolerte celler.
Når perfusjon igangsettes, bør leveren umiddelbart og homogent endre farge fra rødt til en blek gul. Deler gjenværende røde vil indikere insufficient perfusjon eller tilstedeværelse av luft-emboli. Vasking og filtrering av isolerte celler bør utføres gjentatte ganger. Dette vil sikre effektiv fjernelse av overskudd av celleavfall. Sunn isolerte hepatocytter vil følge i løpet av de første 4 timer for å bli belagt. Derfor kan Plating mediet endres til vedlikehold materiale på dette tidspunkt. Etter inkubering over natten, blir celler vises i en mer heksagonal form med en fremstående kjerne. Hepatocytter kan også være bi-atom (figur 1A). Granulering eller mobil blebbing er en indikator for en dårlig isolasjon. Hvis hepatocytter kontinuerlig ikke holder seg på riktig måte eller cellen levedyktighet er fortsatt lav, bør mengden av fordøyelsen medier brukes til perfusjon endres. Dette bør unngå over- eller underdigestion av levervev.
Dersom et høyere utbytte av celler er nødvendig, kan en antero perfusjon via portalvenen utføres. Klaunig et al. har vist at denne teknikken kan øke den totale celleutbyttet. alternatively, kan følgende portvenen kanylering periodisk spenne av IVC brukes. Dette vil jevne øke trykket i løpet av perfusjon og visstnok også kan øke antall isolerte celler. Perfusjon tid samt perfusjonshastighet kanskje må justeres 14. Vi har imidlertid ikke utført alternative perfusjon protokoller.
Etter en første vellykket isolasjon, bør en hepatocytt-spesifikk immunfarging (for eksempel for albumin) bli utført for å sikre renheten av isolasjon (figur 1B). 24 timer etter isolering, hepatocytter bør serumsultede i 4 til 8 timer og deretter brukt for behandlinger. Når man studerer den akutte fase respons, kan cellene bli behandlet med LPS, som er kjent for å indusere inflammasjon via Toll-lignende reseptor 4 og NF-kB 15. Pro-inflammatoriske cytokiner, slik som IL-6, medierer deres effekter gjennom interleukin-reseptorer 16.Dessuten har vi nylig vist at FGF23 kan aktivere FGFR4 og PLCγ / kalsineurin / NFAT sti og indusere en betennelsesreaksjon i leveren 7, 17. For å sikre tilstrekkelig transkripsjon og translasjon av målgener, bør cellene behandlet i 24 timer. Isolere mRNA og påfølgende analyse av genuttrykk ved bruk av kvantitativ real-time PCR sammen med ELISA av cellesupernatanter gir robust informasjon som lett kan gjentas. Dette gjør etterforskningen av nye pro-inflammatoriske mediatorer, dets lever reseptorer og deres påfølgende nedstrøms signalmekanismer. Isolerte primærceller, spesielt fra transgene dyr gir overlegne resultater i forhold til generisk cancer cellelinjer så som HepG2 og Hep3B celler. På grunn av sin enkelhet, kan denne fremgangsmåten også anvendes for screenings for å undersøke effekten av nye legemidler. Likevel studere komplekse farmakologiske eller Patho-physiolobiologiske mekanismer vil kreve ytterligere bekreftende forsøk, hovedsakelig i et in vivo miljø.
Vi har ikke utført langtidsstudier siden isolerte hepatocytter har en tendens til å dedifferentiate innen et par dager. Imidlertid kan dette overvinnes ved hjelp av spesielle cellekulturteknikker, som rapportert av andre 18. Disse inkluderer en kollagen dobbel-gel konfigurasjon, hepatocytter kuler, co-kultur med endotelceller, og micropatterned co-kulturer med 3T3-J2 fibroblaster. Til sammen isolering av primære muse voksne hepatocytter gir et robust verktøy for forskere som er interessert i metabolomics, betennelser, immunforsvar og nedsatt respons på legemidler og giftstoffer. Den er karakterisert ved enkel gjennomførbarhet, moderate kostnader og rask reproduserbarhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt å fortolle.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH (R01HL128714 til CF) og (F31DK10236101 til KS) og American Heart Association (CF og AG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer | Falcon | 352350 | |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381412 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
| 100 6-inch Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | |
| 1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2 | Becton Dickinson | 329420 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style | Corning | 353003 | |
| 6 well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| 5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards) | LOOK | SP115 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Minipuls 3 Perfusion Pump | Gilson | F155007 | |
| Hemacytometer Kits, Propper | VWR | 48300-474 | |
| Hemacytometer Cover Glasses, Propper | VWR | 48300-470 | |
| Surgical Scissers - Sharp/Blunt | F.S.T. | 14001-12 | |
| Iris Scissors-ToughCut Straight | F.S.T. | 14058-11 | |
| Dumont SS-45 Forceps | F.S.T. | 11203-25 | |
| Student Tissue Forceps | F.S.T. | 991121-12 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetic acid solution, 2.0 N | Sigma | A8976-100ML | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL) | VEDCO | 50989-161-06 | |
| Xylazine 100 mg/mL | AnaSed Injection | 139-236 | |
| Willams' Medium E (1x) | gibco | 12551-032 | |
| Liver Perfusion Medium (1x) | gibco | 17701-038 | |
| Liver Digest Medium (1x) | Life Technologies | 17703034 | |
| Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | Life Technologies | CM3000 | |
| Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | Life Technologies | CM4000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4 | ThermoFisher scientific | 10010031 | |
| Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Trypan Blue Solution | VWR | 45000-717 |
References
- Silverstein, D. M. Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and cardiovascular disease. Pediatr Nephro. 24 (8), 1445-1452 (2008).
- Isakova, T., et al. Fibroblast growth factor 23 is elevated before parathyroid hormone and phosphate in chronic kidney disease. Kidney Int. 79 (12), 1370-1378 (2011).
- Faul, C., et al. FGF23 induces left ventricular hypertrophy. J Clin Invest. 121 (11), 4393-4408 (2011).
- Gutiérrez, O. M., et al. Fibroblast growth factor 23 and mortality among patients undergoing hemodialysis. N England J Med. 359 (6), 584-592 (2008).
- Munoz Mendoza, J., et al. Fibroblast growth factor 23 and Inflammation in CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 7 (7), 1155-1162 (2012).
- Hanks, L. J., Casazza, K., Judd, S. E., Jenny, N. S., Gutiérrez, O. M. Associations of Fibroblast Growth Factor-23 with Markers of Inflammation, Insulin Resistance and Obesity in Adults. PLoS ONE. 10 (3), e0122885 (2015).
- Singh, S., et al. Fibroblast growth factor 23 directly targets hepatocytes to promote inflammation in chronic kidney disease. Kidney Int. , 1-12 (2016).
- Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
- Moshage, H. J., et al. The effect of interleukin-1, interleukin-6 and its interrelationship on the synthesis of serum amyloid A and C-reactive protein in primary cultures of adult human hepatocytes. Bioch Biophysi Res Commun. 155 (1), 112-117 (1988).
- Soldatow, V. Y., LeCluyse, E. L., Griffith, L. G., Rusyn, I. In vitro models for liver toxicity testing. Toxicol. Res. 2 (1), 23-39 (2013).
- Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure. J Vis Exp. (79), (2013).
- Kegel, V., et al. Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells. J Vis Exp. (109), (2016).
- Moshage, H., et al. Cytokines and the hepatic acute phase response. J Pathol. 181 (3), 257-266 (1997).
- Klaunig, J. E., et al. Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation. In vitro. 17 (10), 913-925 (1981).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Schmidt-Arras, D., Rose-John, S. IL-6 pathway in the liver: From physiopathology to therapy. J Hepatol. 64 (6), 1403-1415 (2016).
- Grabner, A., et al. Activation of Cardiac Fibroblast Growth Factor Receptor 4 Causes Left Ventricular Hypertrophy. Cell Metab. 22 (6), 1020-1032 (2015).
- Shulman, M., Nahmias, Y. Chapter 17, Long-Term Culture and Coculture of Primary Rat and Human Hepatocytes. Methods Mol Biol. 945, 287-302 (2012).
