Summary
यहाँ, हम एक enzymatic दृष्टिकोण वयस्क चूहों से प्राथमिक hepatocytes को अलग-थलग करने के लिए दिखाने के लिए, और हम एक भड़काऊ प्रतिक्रिया एलिसा और वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग की मात्रा का ठहराव का वर्णन है।
Abstract
जिगर प्रणालीगत सूजन के नियमन में एक निर्णायक भूमिका निभाता है। विशेष रूप से क्रोनिक किडनी रोग, जिगर uremic परिवेश, oxidative तनाव, अन्तर्जीवविष और तीव्र चरण अभिकारकों की एक बड़ी संख्या का निर्माण करके proinflammatory साइटोकिन्स घूम की कमी आई है क्लीयरेंस के जवाब में प्रतिक्रिया करते हैं। सूजन और hepatocytes की अंतर्निहित भूमिका प्रायोगिक उपकरणों का अध्ययन करने के लिए इस तरह के क्रोनिक किडनी रोग के रूप में विनियमन और यकृत साइटोकिन्स के योगदान को एक प्रणालीगत तीव्र चरण प्रतिक्रिया करने के लिए और एक लंबे समय तक समर्थक भड़काऊ परिदृश्य, विशेष रूप से एक जटिल सेटिंग में समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं। चूंकि इन विवो में सूजन के जटिल तंत्र के अध्ययन चुनौती बनी हुई है, संसाधन गहन और आमतौर पर ट्रांसजेनिक जानवरों के उपयोग की आवश्यकता है, प्राथमिक पृथक hepatocytes यकृत तीव्र चरण प्रतिक्रिया में यंत्रवत अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए एक मजबूत उपकरण प्रदान करते हैं। चूंकि इस तकनीक इन विट्रो मध्यम लागत सुविधाओं, उच्च पुनproducibility और आम तकनीकी ज्ञान, प्राथमिक पृथक hepatocytes भी आसानी से एक स्क्रीनिंग दृष्टिकोण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ, हम प्राथमिक murine hepatocytes को अलग-थलग करने के लिए एक enzymatic आधारित विधि का वर्णन है, और हम इन एलिसा और मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग कोशिकाओं में एक भड़काऊ प्रतिक्रिया के आकलन का वर्णन है।
Introduction
क्रोनिक किडनी रोग (सीकेडी) तीव्र और जीर्ण सूजन 1 के एक राज्य के रूप में परिभाषित किया जा सकता है। सीकेडी के साथ रोगियों में, phosphaturic हार्मोन fibroblast वृद्धि कारक 23 (FGF23) के सीरम स्तर उत्तरोत्तर आदेश सीरम फॉस्फेट homeostasis 2 बनाए रखने के लिए वृद्धि। वृद्धि सीरम FGF23 स्तरों स्वतंत्र रूप से रोगियों को जो हेमोडायलिसिस उपचार 3, 4 शुरुआत कर रहे हैं के बीच हृदय रुग्णता और मृत्यु दर के साथ जुड़े रहे हैं। इसके अलावा, कई नैदानिक अध्ययन ऊंचा FGF23 स्तर और सी-रिएक्टिव प्रोटीन (सीआरपी), इंटरल्युकिन -6 (आईएल -6) और ट्यूमर परिगलन फैक्टर α (TNFα) 5, 6 के सीरम स्तर के बीच एक मजबूत संबंध दिखाई है। इसके अलावा, एक प्रयोगात्मक अध्ययन में, हम हाल ही में दिखा दिया है कि FGF23 सीधे hepatocytes को निशाना बनाने और बढ़ती सीआरपी और आईएल -6 पी द्वारा एक भड़काऊ प्रतिक्रिया पैदा कर सकता हैजिगर 7 में roduction। इसलिए, FGF23 एक घूम पहलू यह है कि सीकेडी में प्रणालीगत सूजन के लिए योगदान के रूप में कार्य कर सकता है।
शुरुआती 70 में, प्राथमिक hepatocytes अलग थे और पहली बार 8 के लिए अध्ययन किया। तब से प्राथमिक सुसंस्कृत यकृत कोशिकाओं बड़े पैमाने पर, 10 चयापचय प्रसंस्करण, हार्मोनल समारोह, दवा चयापचय और विषाक्तता के रूप में अच्छी तरह से प्रतिरक्षा और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं 9 की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। पिछले प्रोटोकॉल मुख्य रूप से मानव जिगर ऊतक 11, 12 से प्राथमिक hepatocytes के enzymatic अलगाव का वर्णन किया है। जबकि एक उत्कृष्ट मॉडल, यह कैसे आनुवंशिक हेरफेर जटिल यकृत संकेतन तंत्र के साथ ही उत्तेजनाओं के विभिन्न प्रकारों पर कार्यात्मक परिणामों को प्रभावित करता है अध्ययन करने की क्षमता से बाहर छोड़ देता है। बाद में, हम murine प्राथमिक hepatocytes के अलगाव का वर्णन। विशेष रूप से, इस तरह के lipopolysaccharide (LPS), आईएल -6 और FGF23 के रूप में यकृत तीव्र चरण प्रतिक्रिया के कई मध्यस्थों, के प्रभाव एक आसान, तेज और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से 13 में विश्लेषण किया जा सकता है।
इस के साथ साथ, हम वयस्क चूहों से hepatocytes के enzymatic अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, और हम हैं कि इस तरह LPS और आईएल -6, साथ ही इस तरह के रूप में FGF23 उपन्यास सूजन मध्यस्थों के रूप में सूजन की स्थापना की inducers, सीधे की अभिव्यक्ति और स्राव को प्रोत्साहित कर सकते हैं प्रदर्शित ऐसे सीआरपी और सुसंस्कृत hepatocytes में आईएल -6 के रूप में भड़काऊ साइटोकिन्स,।
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Protocol
सभी पशु प्रोटोकॉल और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) मेडिसिन के मियामी मिलर स्कूल के विश्वविद्यालय के द्वारा अनुमोदित किया गया।
1. तैयारी
- पहले से गरम जिगर छिड़काव मीडिया और जिगर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में मीडिया को पचाने।
- एक छिड़काव पंप (30 एमएल / मिनट) की स्थापना की। ध्यान से जिगर छिड़काव मीडिया के साथ पंप के ट्यूबिंग प्रणाली prefill। प्रणाली में किसी भी हवाई बुलबुले से बचने और स्टीरियोटैक्टिक माइक्रोस्कोप तैयार करते हैं।
- कोट सेल संस्कृति कोलेजन प्रकार का उपयोग मैं निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार व्यंजन।
2. लिवर वसूली
- ऑक्सीजन / isoflurane साँस लेना (4% isoflurane / 2 एल / मिनट ऑक्सीजन) का उपयोग कर दाता माउस anesthetize।
- 2-2.5% isoflurane को कम करके या ketamine इंजेक्शन द्वारा संज्ञाहरण बनाए रखें (100 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन intraperitoneally की) और xylazine (10 मिलीग्राम / किलो शरीर के वजन के intraperitoneally)। सतत isoflurane संज्ञाहरण को प्राथमिकता के बाद से ketamine रक्तचाप को कम करती है और हेपटोटोक्सिसिटी का कारण बन सकता है।
- एक शोषक पैड पर anesthetized माउस रखें। चिपकने वाला टेप के साथ माउस के हाथ पैरों को ठीक करें।
- दाढ़ी और माउस के पेट और जिगर कीटाणुरहित तेज / कुंद सुझावों के साथ शल्य कैंची का उपयोग करने का कपाल सीमा के pubis से एक उदर laparotomy प्रदर्शन करते हैं। दोनों पक्षों के लिए पेट की दीवार, डायाफ्राम की दुम काटकर अलग कर देना।
- ध्यान से सही पक्ष को आंत ले जाकर अवर रग Cava (आईवीसी) बेनकाब। ध्यान से बाँझ कपास टिप टिप swabs और कोणीय संदंश का उपयोग आईवीसी के आसपास वसा ऊतकों को काटना।
- suprahepatic डायाफ्राम काटकर अलग कर देना और दो पार्श्व चीरों तेज / तीव्र सुझावों के साथ ठीक शल्य कैंची का उपयोग करके वक्ष गुहा खुला। Ligate वक्ष शल्य आईवीसी रेशम (5/0) का उपयोग।
- एक परिरक्षित चतुर्थ कैथेटर का उपयोग कर अधोमूत्र पिंडीय आईवीसी Cannulate, ध्यान से सुई को हटा दें,छिड़काव पंप कनेक्ट और जिगर perfusing शुरू करते हैं। अगर ठीक से प्रदर्शन किया, जिगर तुरंत चूनी और प्रफुल्लित करने के लिए शुरू करना चाहिए।
- ठीक शल्य कैंची का उपयोग रक्त और छिड़काव मीडिया के उपयुक्त जल निकासी की इजाजत दी नस पोर्टल आड़ा काट।
- जिगर छिड़काव मीडिया के लगभग 30 एमएल के साथ जिगर छिड़कना, और फिर पचाने मीडिया (30 एमएल) जिगर के लिए स्विच। छिड़काव पंप बंद करें और प्रवेशनी को दूर एक बार छिड़काव पूरा हो गया है।
- धीरे जिगर के मध्य क्षेत्र को बेनकाब और जिगर पालियों जोड़ने जोड़ने के ऊतक का पता लगाने। केंद्रीय जोड़ने वाले तंतुओं ले लो और ध्यान से जगह में जिगर पकड़े सभी ऊतकों काटना और धीरे जिगर को हटा दें।
- इसके तत्काल बाद जिगर की मीडिया को पचाने के 15 एमएल युक्त एक 50 एमएल polypropylene शंक्वाकार ट्यूब में जिगर हस्तांतरण।
नोट: इस कदम के लिए कोई विशेष समय लाइन नहीं है। छिड़काव के बाद, जिगर एक बाँझ सेल संस्कृति हुड के लिए परिवहन के लिए डाइजेस्ट मीडिया में रहता है। सभी subsequent कदम एक बाँझ वातावरण में किया जाना चाहिए।
3. अलगाव और कोशिकाओं के उपचार
- एक सेल संस्कृति हुड के भीतर, एक बाँझ टिशू कल्चर डिश में 50 एमएल polypropylene शंक्वाकार ट्यूब युक्त पाचन मीडिया से जिगर हस्तांतरण।
- बाँझ संदंश का प्रयोग, धीरे जिगर के चार पालियों आंसू। अगर ठीक से प्रदर्शन किया, पाचन मध्यम कारण जिगर से hepatocytes को अलग-थलग करने के लिए परेशान हो जाना चाहिए।
- एक 25 एमएल बाँझ विंदुक टिप का उपयोग करना, पचाया नहीं ऊतक कणों और सेल मलबे को हटाने के लिए एक नया 50 एमएल polypropylene शंक्वाकार ट्यूब में एक 70 माइक्रोन नायलॉन सेल झरनी के माध्यम से परेशान पाचन मध्यम फिल्टर।
- दोहराएँ 3.2 और बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ 3.3 कदम। यह जिगर से किसी भी अवशिष्ट hepatocytes को हटाने के साथ मदद करता है।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 50 XG पर अपकेंद्रित्र। अतिरिक्त सेल मलबे से युक्त सतह पर तैरनेवाला Aspirate और धीरे फिर से निलंबित 25 एमएल ठंड 1x में कोशिकाओंविलियम्स 'मध्यम ई
- एक 25 एमएल बाँझ विंदुक टिप का उपयोग करना, एक क्लीनर निलंबन प्राप्त करने के लिए एक 50 एमएल polypropylene शंक्वाकार ट्यूब में एक नया 70 माइक्रोन नायलॉन सेल झरनी के माध्यम से फिर से निलंबन फिल्टर।
- दोहराएँ 3.5 और एक स्पष्ट सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए ठंड विलियम्स 'मध्यम ई 1x का उपयोग कर तीन अतिरिक्त washes के लिए 3.6 कदम।
- अंतिम चरण धोने के बाद, अतिरिक्त सेल मलबे को हटाने के लिए महाप्राण सतह पर तैरनेवाला। पुनः निलंबित और 25 एमएल गर्म विलियम्स 'मीडिया ई 1x कि एक 50 एमएल polypropylene शंक्वाकार ट्यूब में एक नया 70 माइक्रोन नायलॉन सेल झरनी के माध्यम से प्राथमिक hepatocyte विगलन और पूरक चढ़ाना होता है में फिल्टर कोशिकाओं।
- 25 एमएल सेल एक hemocytometer का उपयोग निलंबन के भीतर कोशिकाओं की गणना। वयस्क जिगर के अनुसार 20 मिलियन कोशिकाओं - औसतन 15 की उम्मीद है। trypan नीले रंग धुंधला का उपयोग सेल व्यवहार्यता का निर्धारण।
- 2 विलियम्स की 'एमएल मीडिया ई 1x में प्लेट कोशिकाओं है कि प्राथमिक hepatocyte विगलन और एक कोलेजन लेपित 6 अच्छी तरह से सीई पर की खुराक चढ़ाना होता हैडालूँगा संस्कृति क्लस्टर (अच्छी तरह से प्रति 9 एक्स 10 5 कोशिकाओं)।
- 4 घंटे के बाद, विलियम्स 'मीडिया ई 1x कि प्राथमिक hepatocyte रखरखाव की खुराक में शामिल करने के लिए मीडिया बदल जाते हैं।
- 24 घंटे के बाद, सीरम Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) मीडिया के साथ 1x 6 घंटे के लिए कोशिकाओं को भूखा।
- वाहन, FGF23 (25 एनजी / एमएल), एलपीएस के रूप में पीबीएस के साथ कोशिकाओं को समझो (100 माइक्रोग्राम / एमएल) या सीरम मुक्त माध्यम में आईएल -6 (50 एनजी / एमएल) और 24 घंटे के लिए सेते हैं।
4. शाही सेना के अलगाव
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक स्पिन स्तंभ किट का उपयोग आरएनए तैयार करें।
रिवर्स प्रतिलेखन द्वारा पृथक शाही सेना से 5. उत्पन्न सीडीएनए
- पृथक शाही सेना के नमूने के 200 एनजी एक पीसीआर ट्यूब में जोड़े।
- Endonuclease मुक्त एच 2 ओ पीसीआर को ट्यूब के 14 μL 5.1 कदम से जोड़ें।
- 5.1 कदम से पीसीआर ट्यूब के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस के 4 μL जोड़ें।
- मिश्रण समरूप बनाने के लिए धीरे सामग्री पुनः निलंबित; धीरे अपकेंद्रित्र। एक thermocycler में मिश्रण युक्त पीसीआर ट्यूब रखें। रिवर्स प्रतिलेखन के लिए thermocycler चलाएँ: 25 डिग्री सेल्सियस (5 मिनट), 42 डिग्री सेल्सियस (30 मिनट) के 1 चक्र, 85 डिग्री सेल्सियस (5 मिनट) और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़। अंतिम उत्पाद वांछित सीडीएनए होगा।
6. मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण (qPCR)
- 96 अच्छी तरह से थाली तैयार करें।
- 1 μL सीडीएनए, .25 माइक्रोन के आगे प्राइमर, .25 माइक्रोन के रिवर्स प्राइमर, 5 μL SYBR ग्रीन, 3.5 μL पीसीआर ग्रेड 10 μL की कुल मात्रा को पानी: बर्फ पर qPCR प्रतिक्रिया के सभी घटकों रखें। SYBR ग्रीन का प्रयोग, तीन प्रतियों में सभी नमूनों को चलाने के लिए मास्टर मिश्रण तैयार करते हैं।
- एक बार जब मास्टर मिश्रण पूरा हो गया है, भंवर समरूप बनाने के लिए। एक 96 डब्ल्यूएलएल प्लेट के प्रत्येक कुएं में अशेष 9 qPCR की μL मास्टर मिश्रण। के बाद, ध्यान सीडीएनए के 1 μL प्रत्येक में अच्छी तरह से जोड़ें। कुल प्रतिक्रिया मात्रा 10 μL हो जाएगा।
- लोड हो रहा है पूर्ण होने पर, मुहर ऑप्टिकल के साथ 96 अच्छी तरह से थालीचिपकने वाली फिल्म और संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज 96 अच्छी तरह से थाली (1 मिनट के लिए 50 XG)।
- एक रीयल टाइम पीसीआर साधन में चलाने के नमूने हैं। रीयल टाइम पीसीआर साधन में सील 96 अच्छी तरह से थाली और प्रति उपकरण निर्माता की सिफारिशों के रूप में चलाने के नमूने रखें। मानक और तेजी से चक्र का उदाहरण नीचे शामिल किए गए हैं।
- प्रारंभिक विकृतीकरण 94 डिग्री सेल्सियस पर 120 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्रों 15 एस के लिए, 60 डिग्री सेल्सियस 60 एस के लिए फिर, और फिर वैकल्पिक रूप से 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़: मानक साइकिल चालन के मापदंडों के लिए, निम्न का उपयोग करें।
- तेजी से साइकिल चालन के मापदंडों के लिए: 94 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक विकृतीकरण 30 एस के लिए तो 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्रों 5 एस, 15 एस के लिए 58 डिग्री सेल्सियस और 10 एस के लिए तो 72 डिग्री सेल्सियस के लिए,: निम्नलिखित का उपयोग करें।
- डेटा का विश्लेषण करने के लिए कैसे पर मार्गदर्शन के लिए साधन मैनुअल को देखें।
7. एलिसा द्वारा सेल Supernatants का विश्लेषण
नोट: सभी चरणों के निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन कर रहे हैं।
- अलग ट्यूबों में मंदक के 398 μL बांटना। पिपेट 2 398 μL मंदक ट्यूब में सेल सतह पर तैरनेवाला नमूना की μL। यह 200 के कमजोर पड़ने गुना प्रदान करेगा।
- प्रत्येक नमूना के लिए दोहराएँ कदम 7.1.1 परीक्षण किया जाना है।
- 200 गुना पतला नमूने के पिपेट 100 μL और एक 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं में एक मानक।
- 150 rpm पर एक microplate प्रकार के बरतन पर 45 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 96 अच्छी तरह से थाली सेते हैं।
- कुओं 1x धो बफर समाधान के साथ 5 बार धोएं। एक बार जब पिछले धोने पूरा हो गया है, शोषक कागज के साथ सभी अवशिष्ट धोने समाधान निकाल दें।
- एचआरपी-साधना अभिकर्मक के 500 μL प्रत्येक कुएं में जोड़ें।
- 7.2.3 - दोहराएँ 7.2.2 कदम।
- tetramethylbenzidine की पिपेट 100 μL (TMB) 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में अभिकर्मक।
- धीरे एक microplate पर 20 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 96 अच्छी तरह से थाली मिश्रण150 rpm पर एक प्रकार के बरतन। सीधे प्रत्येक अच्छी तरह से रोकने के समाधान के 100 μL जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो और धीरे मिश्रण। एक बार स्थान पर समाधान जोड़ा जाता है रंग पीला बारी चाहिए। यह उस स्थान पर समाधान सही ढंग से मिश्रित किया गया है बताते हैं।
- एक microtiter प्लेट रीडर का उपयोग, पहले 5 मिनट के भीतर 450 एनएम ऑप्टिकल घनत्व का निर्धारण।
- प्रत्येक नमूना और प्रत्येक मानक के लिए औसत absorbance के मूल्यों (ए 450) की एक मेज की गणना।
- एनजी में अपने मानक एकाग्रता के खिलाफ एक मानक की एक 450 मतलब साजिश रचने के द्वारा एक मानक वक्र इकट्ठा / एमएल एक रेखीय ग्राफ पर। एक्स अक्ष एकाग्रता और वाई अक्ष एक 450 मूल्यों का प्रतिनिधित्व करने का प्रतिनिधित्व करने की अनुमति दें।
- उपयोग मतलब है एक 450 प्रत्येक पतला नमूना से, मानक वक्र से एनजी / एमएल में वांछित प्रोटीन की एकाग्रता का निर्धारण।
- कमजोर पड़ने वास्तविक द्वारा नमूना एकाग्रता गुणाआर। यह सेल सतह पर तैरनेवाला नमूने में वांछित प्रोटीन की वास्तविक एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए अनुमति देगा।
- नमूनों से निर्माण तालिका एक लाइन ग्राफ में प्लॉट। आयुध डिपो के 450 मूल्यों मानक वक्र के बाहर गिर जाते हैं, नमूने उचित रूप से पतला होना चाहिए और फिर से परीक्षण किया।
- 500,000 कोशिकाओं के लिए परिणाम मानक के अनुसार।
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Representative Results
प्रोटोकॉल
प्राथमिक अलग और संवर्धित कोशिकाओं के प्रतिनिधि प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवियों चित्रा 1 ए में चित्रित कर रहे हैं। Immunocytochemical विश्लेषण दर्शाता है कि पृथक hepatocytes अत्यधिक एल्बुमिन (लाल) के साथ ही fibroblast वृद्धि कारक रिसेप्टर 4 (FGFR4) (हरा) को व्यक्त करता है। नाभिक 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (नीला) के साथ दाग रहे हैं। (चित्रा 1 बी)।
मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर
प्राथमिक पृथक hepatocytes FGF23 साथ इलाज किया गया (25 एनजी / एमएल) LPS (100 माइक्रोग्राम / एमएल) या आईएल -6 24 घंटे और सीआरपी और आईएल -6 की mRNA स्तर के लिए (50 एनजी / एमएल) मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर द्वारा विश्लेषण किया गया । FGF23, LPS और आईएल -6 काफी सीआरपी और आईएल -6 की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई। (2A चित्रा)
पृथक प्राथमिक hepatocytes से सेल संस्कृति supernatants सीआरपी के स्तर के लिए एलिसा द्वारा विश्लेषण किया गया। हमारे मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण, LPS के साथ लाइन में, आईएल -6 के साथ ही FGF23 उपचार काफी सेल supernatants में सीआरपी स्तर में वृद्धि हुई जब पीबीएस इलाज कोशिकाओं की तुलना में। (चित्रा 2 बी)
चित्रा 1: अलग murine प्राथमिक hepatocytes (ए) चरण विपरीत सूक्ष्म छवि। चढ़ाना के बाद 24 घंटे, कोशिकाओं एक षट्भुज के आकार की तरह प्रदर्शन और अक्सर द्वि-nucleated दिखाई देते हैं। (स्केल बार = 100 माइक्रोन); (बी) इम्यूनोफ्लोरेसेंस सूक्ष्म विश्लेषण से पता चलता है कि अलग कक्षों के बहुमत एल्बुमिन (लाल), एक hepatocyte विशिष्ट मार्कर व्यक्त करते हैं। कोशिकाओं को भी अत्यधिक FGFR4 (हरा) व्यक्त करते हैं। DAPI नाभिक दाग। मूल बढ़ाई 40एक्स (स्केल बार = 50 माइक्रोन)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: पृथक Murine प्राथमिक Hepatocytes की मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण सीआरपी और आईएल -6 अभिव्यक्ति का निर्धारण। (ए) एलपीएस, आईएल -6 और FGF23 उपचार काफी सीआरपी की mRNA स्तर में वृद्धि जब पीबीएस इलाज कोशिकाओं की तुलना में। (मान ± SEM के गुना परिवर्तन के रूप में व्यक्त कर रहे हैं, पी <0.01, एन = 3 स्वतंत्र isolations)। (बी) LPS के साथ इलाज किया कोशिकाओं, आईएल -6 या FGF23 भी आईएल -6 की mRNA स्तर में उल्लेखनीय वृद्धि दिखाने के लिए जब पीबीएस उपचार की तुलना में। (मान ± SEM के गुना परिवर्तन के रूप में व्यक्त कर रहे हैं, पी <0.001, एन = 3 स्वतंत्र isolations) (सी) में सीआरपी प्रोटीन का स्तर की मात्राएंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) द्वारा पृथक murine प्राथमिक hepatocytes से supernatants। एलपीएस, आईएल -6 और FGF23 काफी सीआरपी प्रोटीन का स्तर बढ़ाने के लिए जब पीबीएस उपचार की तुलना में। मान 500,000 कोशिकाओं प्रति मिलीग्राम / डीएल में सीआरपी सांद्रता प्रतिनिधित्व करते हैं। (पी <0.05, एन = 3 स्वतंत्र isolations)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
चूहों से प्राथमिक hepatocytes अलग भड़काऊ प्रतिक्रियाओं पूर्व vivo अध्ययन करने के लिए एक तेज, सस्ती और विश्वसनीय उपकरण है। यदि सही ढंग से प्रदर्शन किया, परिणाम आसानी से उत्पन्न होता है और एक समय पर और लागत प्रभावी ढंग से reproduced किया जा सकता है। निम्नलिखित बातों पर ध्यान क्रम में एक सफल अलगाव सुनिश्चित करने के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए।
शल्य चीरा और आईवीसी की केन्युलेशन सामान्य संज्ञाहरण के तहत और इच्छामृत्यु के बाद नहीं किया जाना चाहिए। एक युवा, अनुभवहीन अन्वेषक शुरुआत में और अधिक समय की आवश्यकता होगी murine पेट की शारीरिक विशेषताओं से परिचित बनने के लिए और एक सही केन्युलेशन प्रदर्शन करने के लिए। दाता जानवर जिंदा रखते हुए जब तक छिड़काव शुरू होता है, काफी अलग कक्षों की व्यवहार्यता में वृद्धि होगी। के बाद से यह काफी अलग-थलग hepatocytes की उपज में वृद्धि होगी ऊपर अर्थ का उपसर्ग यकृत आईवीसी के ligation किया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, एक सूक्ष्म शल्य दबाना आईवीसी पर रखा जा सकता है।हालांकि, thoracotomy के बाद, जानवर कुछ मिनटों के भीतर मृतक बन जाएगा। इसलिए बाद के सभी चरणों को सुनिश्चित करने के लिए कि जिगर छिड़काव की दीक्षा जब तक पर्याप्त रक्त के प्रवाह को बनाए रखता तुरंत किया जाना चाहिए। केन्युलेशन के लिए, एक ले लेने योग्य नसों में कैथेटर का उपयोग अत्यधिक की सिफारिश की है। आईवीसी cannulating के बाद, कैथेटर सुई ध्यान से मुकर जा सकता है, जो पोत वेध के जोखिम को कम करता है। पिछले महत्वपूर्ण कदम कैथेटर के लिए छिड़काव प्रणाली का कनेक्शन है। कैथेटर से सुई को हटाने के बाद, रक्त यह एक छिड़काव पंप को जोड़ने से पहले कैथेटर के अंत से पलायन करना चाहिए। यह कदम एयर एम्बोली का खतरा है, जो मात्रा में एक महत्वपूर्ण कमी के साथ ही अलग कक्षों की गुणवत्ता पैदा कर सकता है कम करता है।
एक बार छिड़काव शुरू की है, जिगर चाहिए तुरंत और homogenously लाल से उसका रंग एक हल्के पीले करने के लिए बदल जाते हैं। पार्ट्स शेष लाल insuffic संकेत जाएगाient छिड़काव या एयर एम्बोली की उपस्थिति। कपड़े धोने और अलग कक्षों की छानने को बार-बार किया जाना चाहिए। इस अतिरिक्त सेल मलबे के कुशल हटाने को सुनिश्चित करेगा। स्वस्थ पृथक hepatocytes चढ़ाया होने के पहले 4 घंटे के भीतर पालन करना होगा। इसलिए, चढ़ाना मीडिया इस समय बिंदु पर रखरखाव मीडिया को बदला जा सकता है। रात ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं एक प्रमुख नाभिक के साथ एक अधिक हेक्सागोनल आकार में दिखाई देगा। Hepatocytes भी द्वि-परमाणु (चित्रा 1 ए) हो सकता है। दानेदार या सेलुलर blebbing एक गरीब अलगाव के लिए एक संकेतक है। hepatocytes लगातार ठीक से पालन नहीं या सेल व्यवहार्यता कम रहता है, छिड़काव के लिए इस्तेमाल किया पाचन मीडिया की राशि बदल दिया जाना चाहिए। यह खत्म बचने के लिए या यकृत ऊतक के underdigestion चाहिए।
कोशिकाओं के एक उच्च उपज की आवश्यकता है, के माध्यम से पोर्टल शिरा एक अग्रगामी छिड़काव किया जा सकता है। Klaunig एट अल। पता चला है कि इस विशेष तकनीक कुल सेल उपज में वृद्धि कर सकते हैं। Alternatively, निम्नलिखित पोर्टल शिरा केन्युलेशन आईवीसी के रुक-रुक कर clasping लागू किया जा सकता है। यह समय समय पर अलग कक्षों की कुल संख्या बढ़ा सकते हैं छिड़काव के दौरान दबाव में वृद्धि होगी और माना जाता है कि यह भी। छिड़काव समय के साथ-साथ छिड़काव दर 14 से समायोजित किया जा करना पड़ सकता है। हम फिर भी, वैकल्पिक छिड़काव प्रोटोकॉल प्रदर्शन नहीं किया है।
पहली बार एक सफल अलगाव के बाद, एक hepatocyte विशेष immunostaining (एल्बुमिन के लिए जैसे) अलगाव (चित्रा 1 बी) की शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए। 24 घंटे के अलगाव के बाद, hepatocytes सीरम 4 से 8 घंटे के लिए भूखे किया जाना चाहिए और उसके बाद उपचार के लिए प्रयोग किया जाता है। जब तीव्र चरण प्रतिक्रिया का अध्ययन, कोशिकाओं LPS, जो टोल की तरह रिसेप्टर 4 और एनएफ-κB 15 के माध्यम से सूजन प्रेरित करने के लिए जाना जाता है के साथ इलाज किया जा सकता है। ऐसे आईएल -6 के रूप में समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स, इंटरल्यूकिन रिसेप्टर्स 16 के माध्यम से अपने प्रभाव मध्यस्थता।इसके अलावा, हम हाल ही में दिखा दिया है कि FGF23 FGFR4 और PLCγ / calcineurin / NFAT मार्ग को सक्रिय करने और जिगर 7, 17 में एक भड़काऊ प्रतिक्रिया पैदा कर सकते हैं। पर्याप्त प्रतिलेखन और लक्ष्य जीन का अनुवाद सुनिश्चित करने के लिए, कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए इलाज किया जाना चाहिए। सेल supernatants की एक साथ मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग एलिसा के साथ mRNA और जीन अभिव्यक्ति की लगातार विश्लेषण अलग मजबूत जानकारी है कि आसानी से दोहराया जा सकता है। इस उपन्यास समर्थक भड़काऊ मध्यस्थों, अपने यकृत रिसेप्टर्स और उनके लगातार बहाव के संकेत तंत्र की जांच की अनुमति देता है। पृथक प्राथमिक कोशिकाओं, विशेष रूप से ट्रांसजेनिक जानवरों से बेहतर परिणाम प्रदान करेगा जब इस तरह के HepG2 और Hep3B कोशिकाओं के रूप में सामान्य कैंसर कोशिका लाइनों की तुलना में। अपनी सादगी के कारण, इस दृष्टिकोण भी उपन्यास दवाओं के प्रभाव की जांच करने के लिए स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। फिर भी, अध्ययन जटिल औषधीय या Patho-physiological तंत्र मुख्य रूप से एक विवो सेटिंग में अतिरिक्त सबूत प्रयोगों की आवश्यकता होगी।
हम लंबे समय तक अध्ययन नहीं किया है के बाद से पृथक hepatocytes कुछ दिनों के भीतर dedifferentiate जाते हैं। हालांकि, इस स्पेशल सेल कल्चर तकनीक से दूर किया जा सकता है दूसरों के रूप में 18 से सूचना दी। ये एक कोलेजन डबल जेल विन्यास, hepatocyte spheroids, endothelial कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति, और 3T3-J2 fibroblasts के साथ micropatterned सह संस्कृतियों शामिल हैं। साथ में ले ली, प्राथमिक murine वयस्क hepatocytes के अलगाव metabolomics, सूजन, प्रतिरक्षा और दवाओं और विषाक्त पदार्थों को यकृत जवाब में रुचि वैज्ञानिकों के लिए एक मजबूत उपकरण प्रदान करता है। यह सरल व्यवहार्यता, मध्यम लागत और तेजी से reproducibility के द्वारा होती है।
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Disclosures
लेखकों के हितों की कोई संघर्ष की घोषणा करनी है।
Acknowledgments
यह काम एनआईएच (R01HL128714 सीएफ के लिए) और (एस को F31DK10236101) और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (सीएफ और एजी) द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer | Falcon | 352350 | |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381412 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
| 100 6-inch Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | |
| 1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2 | Becton Dickinson | 329420 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style | Corning | 353003 | |
| 6 well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| 5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards) | LOOK | SP115 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Minipuls 3 Perfusion Pump | Gilson | F155007 | |
| Hemacytometer Kits, Propper | VWR | 48300-474 | |
| Hemacytometer Cover Glasses, Propper | VWR | 48300-470 | |
| Surgical Scissers - Sharp/Blunt | F.S.T. | 14001-12 | |
| Iris Scissors-ToughCut Straight | F.S.T. | 14058-11 | |
| Dumont SS-45 Forceps | F.S.T. | 11203-25 | |
| Student Tissue Forceps | F.S.T. | 991121-12 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetic acid solution, 2.0 N | Sigma | A8976-100ML | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL) | VEDCO | 50989-161-06 | |
| Xylazine 100 mg/mL | AnaSed Injection | 139-236 | |
| Willams' Medium E (1x) | gibco | 12551-032 | |
| Liver Perfusion Medium (1x) | gibco | 17701-038 | |
| Liver Digest Medium (1x) | Life Technologies | 17703034 | |
| Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | Life Technologies | CM3000 | |
| Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | Life Technologies | CM4000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4 | ThermoFisher scientific | 10010031 | |
| Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Trypan Blue Solution | VWR | 45000-717 |
References
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