Summary
Burada, yetişkin farelerin birincil hepatositler izole etmek için bir enzimatik yaklaşım göstermek ve biz ELISA ve gerçek zamanlı PCR kullanarak bir inflamatuvar yanıt ölçümü açıklar.
Abstract
Karaciğer sistemik inflamasyon düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Özellikle kronik böbrek hastalığı, karaciğer Üremik ortamda, oksidatif stres, endotoksemi ve akut faz reaktanları çok sayıda üreterek proinflamatuar sitokinler dolaşımdaki azalmış temizlenmesi cevaben tepki verir. inflamasyon ve hepatositlerin yatan rolü deneysel araçları incelemek için kronik böbrek hastalığı gibi özellikle karmaşık bir ortamda düzenlenmesi ve karaciğer sitokinlerin katkısı sistemik akut faz yanıtı ve uzun bir pro-enflamatuar senaryo, anlamak için çok önemlidir. In vivo enflamasyon karmaşık mekanizmalar okuyan zorlu kaldığından, kaynak-yoğun genellikle ve transgenik hayvanların kullanımını gerektirir, birincil izole hepatositler hepatik akut faz yanıtı içine mekanistik anlayışlar kazanmak için sağlam bir araç sağlar. Bu in vitro tekniği ılımlı maliyetleri özellikleri olduğundan, yüksek yenidenüretilebilirlik ve ortak teknik bilgi, birincil izole hepatositler de kolayca bir tarama yaklaşımı olarak kullanılabilir. Burada, birincil fare hepatositleri izole etmek için bir enzimatik temelli bir yöntem tarif ve biz ELISA ve kantitatif gerçek zamanlı PCR kullanarak bu hücrelerin bir inflamatuar yanıtın değerlendirilmesi açıklar.
Introduction
Kronik böbrek hastalığı (CKD), akut ve kronik iltihap 1 bir durum olarak tanımlanabilir. KBH olan hastalarda, phosphaturic hormon fibroblast büyüme faktörü 23 (FGF23) serum düzeyleri giderek serum fosfat homeostazisini 2 korumak için yükselir. Artmış serum FGF23 düzeyleri bağımsız hemodiyaliz tedavisi 3, 4 başlıyor hastalarda kardiyovasküler morbidite ve mortalite ile ilişkilidir. Bundan başka, pek çok klinik çalışmalar, yüksek FGF23 seviyeleri ve C-reaktif protein (CRP), Interlökin-6 (IL-6) ve tümör nekroz faktörü a (TNFa), 5, 6 serum seviyeleri arasında güçlü bir ilişki olduğunu göstermiştir. Ayrıca, deneysel bir çalışmada, son zamanlarda FGF23 doğrudan hepatositler hedef ve artan CRP ve IL-6 p bir inflamatuar yanıta neden olduğunu göstermiştirkaraciğer 7 roduction. Bu nedenle, FGF23 CKD sistemik inflamasyona katkıda bulunan dolaşan bir faktör olarak hareket olabilir.
70 yılların başında, birincil hepatositler izole edildi ve ilk kez 8 okudu. O zamandan beri primer kulturlenmiş hepatik hücreler yoğun, 10 metabolik işlem, hormonal fonksiyon, ilaç metabolizması ve toksisitesinin yanı sıra bağışıklık yanıtlarını ve enflamatuar yanıtları 9 incelemek için kullanılmıştır. Önceki protokoller esas insan karaciğer dokusunda 11, 12 birincil hepatositlerin enzimatik izolasyonuna tarif etmişlerdir. mükemmel bir model olsa da, bu karmaşık karaciğer sinyal mekanizmalarını yanı sıra uyaranların farklı türde üzerine fonksiyonel sonuçlarını nasıl etkilediğini genetik manipülasyon çalışma olanağı dışarıda bırakır. Aşağıda, fare primer hepatositlerinde izolasyonunu tarif. Özellikle, böyle bir lipopolisakarit (LPS), IL-6 ve FGF23 hepatik akut faz tepkisinin birçok aracıların, etkisi, kolay, hızlı ve yeniden üretilebilir bir şekilde 13 analiz edilebilir.
Burada, erişkin farelerden hepatositlerin enzimatik izolasyonu için protokol mevcut, ve LPS ve IL-6, hem de böyle bir FGF23 gibi yeni enflamasyon ile ilgili aracıların enflamasyon kurulan indükleyicileri, doğrudan ifadesini ve ifrazatını uyardığını göstermektedir bu tür kültürlenmiş hepatositlerde CRP ve IL-6 gibi enflamatuar sitokinleri,.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan protokolleri ve deneysel prosedürler Tıp Miami Miller School Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Hazırlık
- Ön ısıtma karaciğer perfüzyon medya ve karaciğer 37 ° C'de su banyosunda medyayı sindirmek.
- bir perfüzyon pompası (30 ml / dak) ayarlayın. Dikkatle karaciğer perfüzyon medya ile pompanın boru sistemini önceden doldurmak. sistemdeki herhangi bir hava kabarcıklarını önlemek ve stereotaktik mikroskop hazırlar.
- Üreticinin protokolüne göre kollajen tipi kullanılarak Coat hücre kültürü tabakları.
2. Karaciğer Kurtarma
- Oksijen / izofluran inhalasyon (izofluran% 4/2 L / dk oksijen) kullanarak donör fare anestezisi.
- % 2-2.5 izofluran düşürülmesiyle veya ketamin enjekte edilerek anestezi bakımı (100 mg / kg vücut ağırlığı intraperitonal olarak) ve ksilazin (vücut ağırlığı için 10 mg / kg intraperitoneally). Sürekli izofluran anestezi ketamin kan basıncını düşürür ve hepatotoksisite neden olabilir çünkü tercih edilir.
- emici ped üzerine anestezi fare yerleştirin. yapışkan bant ile farenin ekstremitelerde düzeltin.
- Tıraş ve fare karın dezenfekte ve keskin / künt uçlu cerrahi makas kullanarak karaciğer kafatası sınırına pubis ventral laparotomi gerçekleştirin. her iki tarafa da karın duvarı, diyaframın kaudal İnsizyon.
- dikkatle sağ tarafa bağırsak hareket ettirerek inferior vena kava (IVC) Açığa. Dikkatle steril pamuk uçlu çubukları ve açılı ucu forseps kullanarak IVC çevresinde yağ dokusu disseke.
- suprahepatik diyafram insizyon ve keskin / sivri uçları ile ince cerrahi makas kullanılarak iki yanal kesiler ile göğüs boşluğu açın. göğüs İVC cerrahi ipek (5/0) ile Arter.
- Dikkatle iğneyi çıkarın, bir korumalı iv kateter kullanarak infrarenal IVC cannulateperfüzyon pompası bağlamak ve karaciğer perfüze başlar. Düzgün gerçekleştirildiği takdirde, karaciğer derhal ağartma ve kabarma başlamalıdır.
- ince cerrahi makas kullanılarak kan ve perfüzyon medyanın uygun drenaj izin damar portal transect.
- Karaciğer perfüzyon ortamının yaklaşık 30 mL 'si ile karaciğer serpmek ve CD (30 mL) sindirmek karaciğer geçin. perfüzyon pompası kapatın ve perfüzyon tamamlandıktan sonra kanül kaldırın.
- Yavaşça karaciğer merkez bölgesini ortaya çıkarmak ve karaciğer lobu birbirine bağlayan bağlantı doku bulun. merkezi bağlantı lifleri tut ve dikkatli bir şekilde yerinde karaciğer tutan tüm dokuları incelemek ve yavaşça karaciğer çıkarın.
- Hemen ortamı sindirimi karaciğer 15 mL içeren 50 ml polipropilen konik tüpe karaciğer aktarın.
NOT: Bu adım için belirli bir zaman çizgisi vardır. perfüzyon sonra, karaciğer steril bir hücre kültürü kaputu taşıma için özet medyada kalır. Tüm subsequent adımları steril bir ortamda yapılmalıdır.
3. Hücrelerin İzolasyonu ve Tedavi
- Bir hücre kültürü kaputu içinde, steril bir doku kültürü çanak içine 50 ml polipropilen konik tüp içeren sindirim ortamından karaciğer aktarın.
- Steril forseps kullanarak, yavaşça karaciğerin dört lob gözyaşı. Düzgün gerçekleştirildiği takdirde, sindirim orta nedeniyle karaciğer hepatositleri izole etmek bulanık hale gelmelidir.
- 25 ml steril bir pipet ucu kullanılarak, sindirilmemiş doku partiküllerini ve hücre debrisini uzaklaştırmak için yeni bir 50 ml polipropilen konik tüpe 70 mikron naylon hücre süzgecinden bulanık sindirim orta filtre.
- Tekrar 3.2 ve steril fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS) ile 3.3 yineleyin. Bu karaciğer herhangi bir kalıntı hepatositler kaldırarak yardımcı olur.
- 4 ° C'de 2 dakika boyunca 50 x g'de santrifüjleyin. 25 ml soğuk 1x hücreleri yeniden askıya hafifçe aşırı hücre artıkları içeren süpernatant aspire veWilliams 'Orta E.
- 25 ml steril bir pipet ucu kullanılarak temiz bir süspansiyon elde etmek için 50 ml polipropilen konik tüpe yeni 70 um naylon hücre süzgecinden yeniden süspansiyon filtre.
- Tekrarlayın 3.5 ve daha net bir hücre süspansiyonu elde etmek için soğuk Williams 'Orta E 1x kullanarak üç ek yıkar 3.6 adımları.
- Son yıkama aşamasından sonra, aspirat süpernatant aşırı hücre enkaz kaldırmak için. Yeniden askıya ve 50 ml polipropilen konik tüp içine yeni bir 70 mikron naylon hücre süzgecinden birincil hepatosit çözülme ve kaplama takviyeleri içeren 25 ml ılık Williams'ın 'Medya E 1x filtre hücreleri.
- hemasitometre kullanarak 25 ml hücre süspansiyonu içinde hücreleri saymak. yetişkin karaciğer başına 20 milyon hücre - ortalama 15 bekliyoruz. tripan mavisi boyama kullanarak hücre canlılığı belirleyin.
- Bir kollajen kaplı 6-iyi ce birincil hepatosit çözülme ve kaplama takviyeleri içeren 2 ml 'Williams Medya E 1x Levha hücrelerill kültür küme (kuyu başına 9 x 10 5 hücre).
- 4 saat sonra, birincil hepatosit bakım takviyeleri içeren Williams'ın 'Medya E 1x medyayı değiştirin.
- 24 saat sonra, serum Dulbecco modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) ortamı ile 1 x 6 saat boyunca hücreleri açlıktan öldürmek.
- araç, FGF23 (25 ng / ml), LPS gibi hücrelerin PBS ile tedavi (100 ug / ml) ya da serum barındırmayan ortam içinde IL-6 (50ng / ml) ve 24 saat boyunca inkübe edilir.
RNA izolasyonu 4.
- üreticinin talimatlarına göre bir ticari bir spin kolon kiti kullanılarak RNA'nın hazırlanması.
Ters Transkripsiyon tarafından izole RNA 5. Yaratma cDNA
- PCR tüpüne izole RNA numunesinin 200 ng ekleyin.
- Aşama 5.1 endonükleaz içermeyen H2O PCR tüpü 14 uL ekleyin.
- Aşama 5.1 PCR tüpü ters transkriptazın 4 ul ekle.
- Karışım homojen hale getirmek için yavaşça içeriğini yeniden askıya; yavaşça santrifüj. bir termalcycler içine karışımı içeren PCR tüp yerleştirin. Çalışma ters transkripsiyon için PCR: daha sonra 25 ° C'de (5 dakika), 42 ° C (30 dk) 1 döngü, 85 ° C (5 dakika) ve 4 ° C'de tutun. Son ürün, arzu edilen cDNA'nın olacaktır.
6. Kantitatif Real-time PCR ile Hücrelerin Analizi (qPCR)
- 96 oyuklu plaka hazırlanması.
- 1 uL cDNA, .25 uM ileri primer, .25 uM ters primer, 5 uL SYBR Green, 10 ul toplam hacim 3.5 uL PCR sınıf su: buz üzerinde qPCR reaksiyon tüm bileşenlerini yerleştirin. SYBR Green kullanarak, üç nüsha halinde tüm örnekleri çalıştırmak için ana karışımı hazırlayın.
- master miks tamamlandıktan sonra, girdap homojen hale getirmek için. 96 Wll plakanın her oyuğuna kısım 9 uL qPCR ana karışımı. Sonra, dikkatle her kuyuya cDNA 1 mcL ekleyin. Toplam reaksiyon hacmi 10 uL olacaktır.
- Yükleme tamamlandıktan sonra, optik olarak 96 kuyucuklu bir plaka sızdırmazYapışkan film ve kısa bir süre için santrifüj 96 oyuklu plaka (1 dakika için 50 x g).
- Bir Real Time PCR cihazında Run örnekler. Real Time PCR aracı haline mühürlü 96-plaka ve enstrüman üreticisi tavsiyelerine göre çalışacak örnekleri yerleştirin. Standart ve hızlı döngü örnekleri aşağıda yer almaktadır.
- 60 saniye boyunca, 15 sn için, daha sonra 120 saniye boyunca 94 ° C 'de, 60 ° C, 94 ° C 40 döngü, ilk denatürasyon, sonra, isteğe bağlı olarak 4 ° C'de tutun: Standart bisiklet parametreleri, aşağıdaki kullanın.
- Hızlı döngü için parametreler: 5 s, 15 s için 58 ° C, 10 saniye daha sonra 72 ° C'de, daha sonra 30 saniye boyunca 95 ° C 40 döngü 94 ° C sıcaklıkta başlangıç denatürasyon: Aşağıdaki kullanın.
- Verileri analiz konusunda rehberlik için cihaz kılavuzuna bakın.
ELISA ile hücre üst 7. analizi
NOT: Üreticinin protokolüne göre tüm adımları gerçekleştirilir.
- Ayrı tüpler içine seyrelticinin 398 uL koyun. 398 uL seyreltici tüpüne hücre süpernatanı numunesi Pipet 2 uL. Bu 200 seyreltme kat sağlayacaktır.
- Her bir numune için yineleyin 7.1.1 test edilecek.
- Pipet 100 200 kat seyreltilmiş bir numunenin uL ve 96 oyuklu bir plaka gözlerine standart.
- 150 rpm'de bir mikro-plaka karıştırıcısı üzerinde 45 dakika boyunca 25 ° C'de 96 oyuklu plaka inkübe edin.
- gözenekleri 1x yıkama tampon çözeltisi ile 5 kez yıkayın. Son yıkama tamamlandıktan sonra, emici kağıt ile kalan tüm yıkama solüsyonu çıkarın.
- Her kuyuya HRP konjügatı reaktif 500 ul ekle.
- 7.2.3 - Tekrar 7.2.2 adımları.
- tetrametilbenzidin Pipet 100 uL (TMB), 96 oyuklu plakanın her oyuğuna reajanı.
- Yavaşça mikroplaka üzerinde 20 dakika boyunca 25 ° C'de 96-çukurlu plaka karıştırın150 rpm'de sarsıcı. doğrudan her kuyuya durdurma çözeltisi 100 mcL ekleyerek reaksiyonu durdurmak ve hafifçe karıştırın. durdurma çözeltisi ilave edildikten sonra rengi sarı dönmelidir. Bu durak çözüm doğru karışık olduğunu bildirir.
- bir mikrotitre plaka okuyucusu kullanılarak, ilk 5 dakika içinde 450 nm'de optik yoğunluğu belirlemek.
- Her bir örnek, her bir standart için ortalama absorbans değerleri (450) bir tablo hesaplayın.
- Ng standart konsantrasyonuna karşı her bir standart bir 450 ortalaması işaretlenmesiyle bir standart eğri birleştirin / doğrusal grafikte mi. X-ekseni konsantrasyon ve 450 değerleri temsil etmek için y eksenini temsil izin verin.
- Her bir seyreltilmiş örnek 450 ortalama kullanarak, standart eğriden ng / mL, istenen protein konsantrasyonu belirlenir.
- seyreltme facto numune konsantrasyonunu çarpınr. Bu hücre yüzer örnek istenen proteinin gerçek konsantrasyonunu belirlemek için izin verir.
- Bir çizgi grafikte içine örneklerinden inşa tablo çizilir. OD 450 değerleri standart eğrinin dışında kalan, numuneler uygun şekilde seyreltilmiş edilmeli ve yeniden test edilmiştir.
- 500.000 hücrelere sonuçları normalleştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
histoloji
Birincil izole edilen ve kültürlenen hücrelerin Örnek ışık mikroskobu görüntüleri Şekil 1A'da gösterilmiştir. İmünositokimyasal analizi izole hepatositler yüksek albümini (kırmızı) hem de fibroblast büyüme faktörü reseptörü 4 (FGFR4) (yeşil) eksprese olduğunu göstermektedir. Çekirdekler 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (mavi) ile boyanır. (Şekil 1B).
Kantitatif gerçek zamanlı PCR
Birincil İzole hepatositler FGF23 ile işlemden geçirildi (25 ng / ml) LPS veya IL-6, 24 saat ve CRP ve IL-6 mRNA düzeyleri (50 ng / ml) kantitatif gerçek zamanlı PCR ile analiz edilmiştir (ug / ml 100 ug) . FGF23, LPS ve IL-6 CRP ve IL-6 ekspresyonunu artırmıştır. (Şekil 2A)
İzole edilen primer hepatosit gelen hücre kültürü yüzerler CRP seviyeleri için ELISA ile analiz edilmiştir. PBS ile tedavi edilmiş hücreler ile karşılaştırıldığında bizim kantitatif gerçek zamanlı PCR analizi, LPS ile paralel olarak, IL-6 hem de FGF23 tedaviler önemli hücre süpernatanları CRP seviyeleri yükselmiştir. (Şekil 2B)
Şekil 1: izole edilmiş fare primer hepatositlerinde (A) faz kontrast mikroskop görüntüsü. 24 saat sonra kaplama, hücreler, bir altıgen benzeri bir şekle sergiler ve genellikle iki çekirdekli görünür. (= 100 mikron Ölçek çubuğu); (B) İmmünoflöresan mikroskopik analiz izole hücrelerin çoğunluğu albumin (kırmızı), bir hepatosit özel işaretleyici ifade olduğunu ortaya koymaktadır. Hücreler de son derece FGFR4 (yeşil) ifade eder. DAPI çekirdekleri boyar. Orijinal büyütme 40X. (Ölçek çubuğu = 50 um). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: İzole Fare birincil hepatositler kantitatif real-time PCR Analizi CRP ve IL-6 İfade belirleme. PBS ile tedavi edilmiş hücreler ile karşılaştırıldığında (A) LPS, IL-6 ve FGF23 tedavileri CRP mRNA düzeyi artar. (Değerler ± SEM kat değişiklik olarak ifade edilmiştir; p <0.01, n = 3 bağımsız izolasyonlar). PBS tedavilerine kıyasla LPS ile işlemden geçirildi (B) hücreler, IL-6 veya FGF23 aynı zamanda IL-6 mRNA düzeylerinde önemli bir artış göstermektedir. (değerler ± SEM kat değişiklik olarak ifade edilmiştir; p <0.001, n = 3 bağımsız izolasyon) CRP protein seviyeleri (C) nicellendirmesindeenzim bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) izole edilmiş fare primer hepatositlerinde elde edilen süpernatanlar. PBS tedavi ile karşılaştırıldığında, LPS, IL-6 ve CRP FGF23 protein seviyeleri yükselir. Değerler 500.000 hücre başına mg / dl CRP konsantrasyonları temsil etmektedir. (P <0.05, n = 3 bağımsız izolasyonlar). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Farelerden alınan birincil hepatositler yalıtma inflamatuar yanıtları ex vivo çalışma için hızlı, ucuz ve güvenilir bir araçtır. Doğru şekilde gerçekleştirilmemesi durumunda, sonuçlar kolaylıkla üretilir ve zamanında ve maliyet-etkin bir şekilde çoğaltılabilir. Aşağıdaki hususlar, dikkatli bir şekilde, başarılı bir izolasyon sağlamak amacıyla değerlendirilmelidir.
Cerrahi kesi ve IVC kanülasyon genel anestezi altında ve ötenazi sonra yapılmalıdır. Genç, tecrübesiz araştırmacı fare karın anatomik özelliklerini tanımanıza ve doğru kanülasyon gerçekleştirmek için başlangıçta daha fazla zamana ihtiyaç olacaktır. Donör hayvan canlı tutulması perfüzyon ölçüde izole hücrelerin canlılığını artıracak, başlayana kadar. önemli ölçüde izole edilmiş hepatositlerin verimini artıracak beri üstü hepatik IVC ligasyonu yapılmalıdır. Seçenek olarak ise, mikro-cerrahi kelepçe IVC yerleştirilebilir.Ancak, torakotomi aşağıdaki hayvan birkaç dakika içinde ölen hale gelecektir. Bu nedenle takip eden tüm adımlar karaciğer perfüzyon başlangıcına kadar yeterli bir kan akışını muhafaza etmesini sağlamak için derhal yapılmalıdır. kanülasyon için, bir geri çekilebilir intravenöz kateter kullanımı tavsiye edilir. IVC kanüle sonra, kateter iğne dikkatlice damar perforasyon riskini en aza indirir, hangi geri çekilebilir. son kritik adım kateter perfüzyon sisteminin bağlantısıdır. kateter iğne çıkardıktan sonra, kan perfüzyon pompasına bağlamadan önce kateterin ucundan tahliye etmelidir. Bu adım, miktar önemli bir azalma olarak izole hücrelerin kalitesine neden olabilir hava emboli tehlikesi en aza indirir.
perfüzyon başlatılan sonra, karaciğer hemen ve homojen bir soluk sarı kırmızıdan rengini değiştirmek gerekir. Parçalar, kalan kırmızı insuffic gösterecektirsağ- lasa perfüzyon veya hava emboli varlığı. İzole hücrelerin yıkanması ve filtreleme sürekli yapılmalıdır. Bu fazla hücre kalıntılarının randımanlı bir şekilde uzaklaştırılmasını sağlayacaktır. Sağlıklı izole hepatositler kaplama olmanın ilk 4 saat içinde uyacaktır. Bu nedenle, kaplama ortamı, bu zaman noktasında bakım ortamına değiştirilebilir. Gece boyunca inkübasyondan sonra, hücreler belirgin bir çekirdeğe sahip olan, daha altıgen şeklinde görünür. Hepatositler da iki nükleer (Şekil 1A) olabilir. Granülasyon veya hücresel blebbing kötü izolasyonu için bir göstergedir. hepatositler sürekli doğru yapışmayan veya hücre canlılığı, düşük kalırsa, perfüzyon için kullanılan sindirim ortam miktarı değiştirilmelidir. Bu aşırı bilmek veya karaciğer dokusu underdigestion gerekir.
hücrelerin daha yüksek bir verimle gerekli ise, portal ven aracılığıyla ileriye perfüzyon gerçekleştirilebilir. Klaunig ve ark. Bu tekniğin, toplam hücre verimini artırmak olduğunu göstermiştir. Alternatively, IVC aşağıdaki portal ven kanülasyon aralıklı kopça uygulanabilir. Bu periyodik izole hücrelerin toplam sayısını artırabilir sözde da perfüzyon sırasında baskıyı artacak ve. Perfüzyon süresi yanı sıra perfüzyon oranı 14 ayarlanması gerekebilir. Biz, ancak alternatif perfüzyon protokolleri uygulandı değil.
Bir ilk başarılı izole edildikten sonra, (albümin gibi), bir hepatosit spesifik immün izolasyonu (Şekil 1B) saflığını sağlamak için gerçekleştirilmelidir. izolasyondan sonra 24 saat, hepatositler, serum 4 ila 8 saat boyunca aç ve tedavi için kullanılır. Akut faz tepkisinin incelenmesi, hücreler Toll-benzeri reseptör 4 ve NF-KB 15 ile inflamasyonunu indüklemek amacıyla bilinen LPS ile muamele edilebilir. IL-6 pro-enflamatuvar sitokinler, interlökin reseptörleri 16 aracılık etmektedir.Ayrıca, kısa bir süre önce FGF23 FGFR4 ve PLCγ / kalsinörin / NFAT yolunu aktive ve karaciğer 7, 17 bir iltihabi tepki doğurmaz olduğunu göstermiştir. Yeterli transkripsiyon ve hedef genlerin translasyonunu temin etmek için, hücreler, 24 saat boyunca tedavi edilmelidir. yüzen hücrelerin ELISA ile birlikte kantitatif gerçek zamanlı PCR ile mRNA ve gen ifadesinin ardışık analiz Ayırma kolayca tekrar edilebilir sağlam bilgi sağlar. Bu yeni pro-inflamatuar mediatörlerin, onun hepatik reseptörleri ve bunların ardışık aşağı sinyal mekanizmalarının soruşturma sağlar. Böyle HepG2 ve Hep3B hücreleri gibi genel kanser hücre hatları ile karşılaştırıldığında, özellikle transgenik hayvanlarda izole birincil hücreler, üstün sonuçlar verecektir. Kolaylığından dolayı, bu yaklaşım aynı zamanda yeni ilaçların etkisini araştırmak için gösterimleri için de kullanılabilir. Bununla birlikte, karmaşık farmakolojik veya pato-physiolo okuyanjik mekanizma temel olarak bir in vivo ortamda daha fazla doğrulayıcı deneyler gerektirecektir.
İzole hepatositler birkaç gün içinde dediferansiye eğilimi beri uzun vadeli çalışmalar gerçekleştirilmiştir değil. Diğer 18 tarafından bildirilen Bununla birlikte, bu özel hücre kültürü teknikleri ile aşılabilir. Bunlar, kolajen çift jel konfigürasyonu, hepatosit sferoidler, endotel hücreleri ile birlikte-kültür ve 3T3-J2 fibroblastlar ile micropatterned eş kültürleri içerir. Birlikte ele alındığında, birincil fare yetişkin hepatositlerin izolasyon metabolomik, inflamasyon, bağışıklık ve ilaç ve toksinlere karaciğer tepki ilgilenen bilim adamları için sağlam bir araç sağlar. Bu basit fizibilite, orta maliyetleri ve hızlı tekrarlanabilirlik ile karakterizedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bildirmek için herhangi bir çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH (R01HL128714 CF) ve (KS F31DK10236101) ve Amerikan Kalp Derneği (CF ve AG) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer | Falcon | 352350 | |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381412 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
| 100 6-inch Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | |
| 1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2 | Becton Dickinson | 329420 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style | Corning | 353003 | |
| 6 well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| 5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards) | LOOK | SP115 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Minipuls 3 Perfusion Pump | Gilson | F155007 | |
| Hemacytometer Kits, Propper | VWR | 48300-474 | |
| Hemacytometer Cover Glasses, Propper | VWR | 48300-470 | |
| Surgical Scissers - Sharp/Blunt | F.S.T. | 14001-12 | |
| Iris Scissors-ToughCut Straight | F.S.T. | 14058-11 | |
| Dumont SS-45 Forceps | F.S.T. | 11203-25 | |
| Student Tissue Forceps | F.S.T. | 991121-12 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetic acid solution, 2.0 N | Sigma | A8976-100ML | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL) | VEDCO | 50989-161-06 | |
| Xylazine 100 mg/mL | AnaSed Injection | 139-236 | |
| Willams' Medium E (1x) | gibco | 12551-032 | |
| Liver Perfusion Medium (1x) | gibco | 17701-038 | |
| Liver Digest Medium (1x) | Life Technologies | 17703034 | |
| Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | Life Technologies | CM3000 | |
| Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | Life Technologies | CM4000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4 | ThermoFisher scientific | 10010031 | |
| Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Trypan Blue Solution | VWR | 45000-717 |
References
- Silverstein, D. M. Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and cardiovascular disease. Pediatr Nephro. 24 (8), 1445-1452 (2008).
- Isakova, T., et al. Fibroblast growth factor 23 is elevated before parathyroid hormone and phosphate in chronic kidney disease. Kidney Int. 79 (12), 1370-1378 (2011).
- Faul, C., et al. FGF23 induces left ventricular hypertrophy. J Clin Invest. 121 (11), 4393-4408 (2011).
- Gutiérrez, O. M., et al. Fibroblast growth factor 23 and mortality among patients undergoing hemodialysis. N England J Med. 359 (6), 584-592 (2008).
- Munoz Mendoza, J., et al. Fibroblast growth factor 23 and Inflammation in CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 7 (7), 1155-1162 (2012).
- Hanks, L. J., Casazza, K., Judd, S. E., Jenny, N. S., Gutiérrez, O. M. Associations of Fibroblast Growth Factor-23 with Markers of Inflammation, Insulin Resistance and Obesity in Adults. PLoS ONE. 10 (3), e0122885 (2015).
- Singh, S., et al. Fibroblast growth factor 23 directly targets hepatocytes to promote inflammation in chronic kidney disease. Kidney Int. , 1-12 (2016).
- Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
- Moshage, H. J., et al. The effect of interleukin-1, interleukin-6 and its interrelationship on the synthesis of serum amyloid A and C-reactive protein in primary cultures of adult human hepatocytes. Bioch Biophysi Res Commun. 155 (1), 112-117 (1988).
- Soldatow, V. Y., LeCluyse, E. L., Griffith, L. G., Rusyn, I. In vitro models for liver toxicity testing. Toxicol. Res. 2 (1), 23-39 (2013).
- Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure. J Vis Exp. (79), (2013).
- Kegel, V., et al. Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells. J Vis Exp. (109), (2016).
- Moshage, H., et al. Cytokines and the hepatic acute phase response. J Pathol. 181 (3), 257-266 (1997).
- Klaunig, J. E., et al. Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation. In vitro. 17 (10), 913-925 (1981).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Schmidt-Arras, D., Rose-John, S. IL-6 pathway in the liver: From physiopathology to therapy. J Hepatol. 64 (6), 1403-1415 (2016).
- Grabner, A., et al. Activation of Cardiac Fibroblast Growth Factor Receptor 4 Causes Left Ventricular Hypertrophy. Cell Metab. 22 (6), 1020-1032 (2015).
- Shulman, M., Nahmias, Y. Chapter 17, Long-Term Culture and Coculture of Primary Rat and Human Hepatocytes. Methods Mol Biol. 945, 287-302 (2012).
