Summary
Qui vi mostriamo un approccio enzimatico per isolare epatociti primari da topi adulti, e descriviamo la quantificazione di una risposta infiammatoria con ELISA e PCR in tempo reale.
Abstract
Il fegato svolge un ruolo determinante nella regolazione dell'infiammazione sistemica. Nella malattia renale cronica in particolare, il fegato reagisce in risposta al ambiente uremico, stress ossidativo, endotossiemia e la clearance dell'amlodipina circolante citochine proinfiammatorie producendo un gran numero di proteine della fase acuta. strumenti sperimentali per studiare l'infiammazione e il ruolo di fondo di epatociti sono cruciali per comprendere la regolamentazione e il contributo di citochine epatiche ad una risposta di fase acuta sistemica e uno scenario pro-infiammatoria prolungata, particolarmente in un contesto complicato come la malattia renale cronica. Dal momento che lo studio complessi meccanismi di infiammazione in vivo rimane difficile, e di solito ad alta intensità di risorse richiede l'utilizzo di animali transgenici, epatociti isolati primari forniscono uno strumento robusto per acquisire conoscenze meccanicistici nella risposta della fase acuta epatica. Poiché questa tecnica in vitro offre costi contenuti, alta reproducibilità e la conoscenza tecnica comune, epatociti isolati primari possono anche essere facilmente utilizzato come un approccio di screening. Qui, descriviamo un metodo enzimatico-based per isolare epatociti murini primari, e descriviamo la valutazione di una risposta infiammatoria in queste cellule utilizzando ELISA e quantitativa real-time PCR.
Introduction
Malattia renale cronica (CKD) può essere definita come uno stato di infiammazione acuta e cronica 1. Nei pazienti con insufficienza renale cronica, i livelli sierici del fattore di crescita dei fibroblasti ormone phosphaturic 23 (FGF23) progressivo aumento al fine di mantenere l'omeostasi fosfato sierico 2. L'aumento dei livelli sierici di FGF23 sono indipendentemente associati con la morbilità e mortalità cardiovascolare tra i pazienti che iniziano il trattamento di emodialisi 3, 4. Inoltre, diversi studi clinici hanno dimostrato una forte correlazione tra i livelli di FGF23 elevate e livelli sierici di proteina C-reattiva (CRP), interleuchina-6 (IL-6) e Tumor Necrosis Factor α (TNF-alfa) 5, 6. Inoltre, in uno studio sperimentale, abbiamo recentemente dimostrato che FGF23 può indirizzare direttamente epatociti e provocare una risposta infiammatoria aumentando CRP e IL-6 produzione nel fegato 7. Quindi, FGF23 potrebbe agire come un fattore che contribuisce alla circolazione infiammazione sistemica in CKD.
Nei primi anni '70, epatociti primari sono stati isolati e studiati per la prima volta 8. Da allora le cellule epatiche in coltura primaria sono stati ampiamente utilizzati per esaminare il trattamento metabolico, la funzione ormonale, il metabolismo dei farmaci e la tossicità, nonché immunità e le risposte infiammatorie 9, 10. Protocolli precedenti hanno descritto principalmente l'isolamento enzimatica di epatociti primari da tessuto epatico umano 11, 12. Mentre un modello eccellente, questo lascia la possibilità di studiare come genetica manipolazione riguarda i meccanismi di segnalazione epatica complessi così come conseguenze funzionali su diversi tipi di stimoli. Nel seguito si descrive l'isolamento di epatociti primari murini. In particolare, l'effetto di diversi mediatori della risposta di fase acuta epatica, come lipopolisaccaride (LPS), IL-6 e FGF23 può essere analizzato in modo facile, veloce e riproducibile 13.
Qui, vi presentiamo un protocollo per l'isolamento enzimatica di epatociti di topi adulti, e dimostriamo che induttori stabiliti di infiammazione, come LPS e IL-6, così come mediatori infiammatori innovative come le FGF23, in grado di stimolare direttamente l'espressione e la secrezione di citochine infiammatorie, come la PCR e iL-6 in epatociti coltivati.
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Protocol
Tutti i protocolli di animali e procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) dell 'Università di Miami Miller School of Medicine.
1. Preparazione
- mezzi di perfusione epatica di preriscaldamento e fegato digerire media in un bagno d'acqua a 37 ° C.
- Impostare una pompa di perfusione (30 mL / min). precompilare con attenzione il sistema di tubi della pompa con mezzi di perfusione epatica. Evitare eventuali bolle d'aria nel sistema e preparare il microscopio stereotassica.
- Coat piatti di coltura cellulare utilizzando collagene di tipo I secondo il protocollo del produttore.
2. Il recupero del fegato
- Anestetizzare il mouse donatore utilizzando ossigeno / inalazione isoflurano (isoflurano 4% / 2 L / min di ossigeno).
- Mantenere anestesia abbassando isoflurano al 2-2,5% o iniettando ketamina (100 mg / kg di peso corporeo per via intraperitoneale) e xilazina (10 mg / kg di peso corporeo intraperitoneally). Continuo anestesia isoflurano è preferito da ketamina abbassa la pressione sanguigna e può causare epatotossicità.
- Posizionare il mouse anestetizzato su un tampone assorbente. Fissare le estremità del topo con del nastro adesivo.
- Shave e disinfettare l'addome del mouse ed eseguire una laparotomia ventrale dal pube fino al confine craniale del fegato con le forbici chirurgiche con punte affilate / smussato. Incidere la parete addominale su entrambi i lati, caudale del diaframma.
- Esporre la vena cava inferiore (IVC) spostando attentamente l'intestino al lato destro. sezionare con cura il tessuto grasso intorno alla IVC utilizzando sterili tamponi punta di cotone e pinze punta angolata.
- Incidere il diaframma sovraepatica e aprire la cavità toracica da due incisioni laterali con le forbici chirurgiche sottili con punte taglienti / appuntiti. Legare l'toracica IVC utilizzando seta chirurgica (5/0).
- Cannulate il infrarenale IVC utilizzando un catetere IV schermato, rimuovere con attenzione l'ago,collegare la pompa di perfusione e iniziare perfusione del fegato. Se eseguita correttamente, il fegato dovrebbe iniziare immediatamente a scottare e si gonfiano.
- Transetto della vena porta che consente il drenaggio adeguato dei mezzi di comunicazione di sangue e perfusione con le forbici chirurgiche sottili.
- Profumato fegato con circa 30 ml di fegato mezzi perfusione, e poi passare a fegato digerire i media (30 ml). Spegnere la pompa di perfusione e rimuovere la cannula volta perfusione è completa.
- esporre delicatamente la regione centrale del fegato e individuare il tessuto connettivo che collega i lobi del fegato. Afferra le fibre che collegano centrali e con attenzione sezionare tutti i tessuti che tengono il fegato in atto e rimuovere delicatamente il fegato.
- Trasferire immediatamente il fegato in un tubo conico da 50 ml in polipropilene contenente 15 ml di fegato digerire media.
NOTA: Non c'è tempo-linea specifica per questo passo. Dopo perfusione, il fegato rimane in mezzi Digest per il trasporto ad una cappa sterile coltura cellulare. Tutti spassi ubsequent devono essere eseguite in un ambiente sterile.
3. Isolamento e trattamento delle cellule
- All'interno di una cappa di coltura cellulare, trasferire il fegato da terreni contenenti digestione 50 mL provetta di polipropilene conica in una piastra di coltura tissutale sterili.
- Utilizzando pinze sterili, strappare delicatamente i quattro lobi del fegato. Se eseguita correttamente, medio digestione dovrebbe diventare torbida a causa di isolare epatociti dal fegato.
- Utilizzando una punta 25 mL pipetta sterile, filtrare il mezzo di digestione torbida attraverso un colino 70 micron cella nylon in una nuova provetta conica da 50 ml in polipropilene per rimuovere le particelle di tessuto non digerito e detriti cellulari.
- Ripetere i punti 3.2 e 3.3 con sterile PBS (PBS). Questo aiuta a rimuovere eventuali residui epatociti dal fegato.
- Centrifugare a 50 xg per 2 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante contenente detriti cellulari in eccesso e delicatamente risospendere le cellule in 25 ml 1x freddoWilliams 'Media E.
- Utilizzando un 25 mL punta pipetta sterile, filtrata del risospensione attraverso un nuovo 70 micron colino cella di nylon in un tubo da 50 ml in polipropilene conica per ottenere una sospensione più pulito.
- Ripetere i punti 3.5 e 3.6 per tre lavaggi aggiuntivi utilizzando freddo Williams 'Medium E 1x per ottenere una sospensione di cellule più chiara.
- Dopo l'ultimo lavaggio, aspirare il surnatante per rimuovere i detriti delle cellule in eccesso. Risospendere e celle filtranti in 25 ml caldo Williams 'Media e 1x che contiene lo scongelamento degli epatociti primari e integratori placcatura attraverso un nuovo 70 micron colino cella di nylon in un tubo da 50 ml in polipropilene conica.
- Contare le celle all'interno della sospensione cellulare 25 mL con un emocitometro. In media si aspettano 15 - 20 milioni di cellule per il fegato adulto. Determinare la vitalità delle cellule utilizzando trypan colorazione blu.
- cellule piastra in 2 ml di Williams 'Media e 1x che contiene lo scongelamento degli epatociti primari e supplementi placcatura su un collagene rivestito ce 6-benell cultura del cluster (9 x 10 5 cellule per pozzetto).
- Dopo 4 ore, cambiare media per Williams 'Media e 1x che contiene gli integratori di manutenzione epatociti primari.
- Dopo 24 ore, il siero di fame le cellule con medie di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) supporti 1x per 6 ore.
- Trattare cellule con PBS come veicolo, FGF23 (25 ng / mL), LPS (100 ug / mL) o IL-6 (50 ng / ml) in terreno privo di siero e incubare per 24 h.
4. Isolamento di RNA
- Preparare RNA utilizzando un kit Spin Column commerciale in base alle istruzioni del produttore.
5. Generazione di cDNA da RNA isolato mediante trascrizione inversa
- Aggiungere 200 ng di campione di RNA isolato dalla provetta.
- Aggiungere 14 ml di-endonucleasi libera H 2 O per PCR tubo dal punto 5.1.
- Aggiungere 4 ml di trascrittasi inversa per provetta PCR dal punto 5.1.
- Risospendere il contenuto con precauzione per fare miscela omogenea; centrifugare delicatamente. Mettere provetta PCR contenente il composto in un termociclatore. Eseguire termociclatore per trascrizione inversa: 1 ciclo di 25 ° C (5 min), 42 ° C (30 min), 85 ° C (5 min) e poi mantenere a 4 ° C. Il prodotto finale sarà il cDNA desiderato.
6. Analisi di celle quantitativa Real-time PCR (qPCR)
- Preparare la piastra a 96 pozzetti.
- Mettere tutti i componenti della reazione qPCR su ghiaccio: 1 ml di cDNA, .25 micron di primer in avanti, .25 micron inversione di fondo, 5 ml SYBR Green, 3,5 microlitri PCR acqua di grado per un volume totale di 10 microlitri. Utilizzando SYBR Green, preparare master mix per eseguire tutti i campioni in triplice copia.
- Una volta che il master mix è completo, vortex per rendere omogenea. Aliquota 9 ml di qPCR master mix in ciascun pozzetto di una piastra da 96 WLL. Dopo, aggiungere con cautela 1 ml di cDNA in ciascun pozzetto. Volume di reazione totale sarà di 10 ml.
- Dopo il caricamento è completo, sigillare piastra a 96 pozzetti con otticapellicola adesiva e centrifugare brevemente piastra a 96 pozzetti (50 xg per 1 min).
- Campioni eseguito in uno strumento di Real-Time PCR. Mettere sigillato piastra a 96 pozzetti in vero e proprio strumento Time-PCR e campioni Esegui come strumento per le raccomandazioni del produttore. Esempi di cicli standard e veloci sono stati inseriti.
- Per i parametri di ciclismo normali, utilizzare il seguente: denaturazione iniziale a 94 ° C per 120 s, quindi 40 cicli di 94 ° C per 15 s, 60 ° C per 60 s, e quindi opzionalmente tenere a 4 ° C.
- Per i parametri ciclo rapido: utilizzare il seguente: denaturazione iniziale a 94 ° C per 30 s, quindi 40 cicli di 95 ° C per 5 s, 58 ° C per 15 s, quindi 72 ° C per 10 s.
- Fare riferimento al manuale dello strumento per una guida su come analizzare i dati.
7. Analisi dei sopranatanti cellulari di ELISA
NOTA: Tutte le operazioni vengono eseguite secondo il protocollo del produttore.
- Dispensare 398 ml di diluente in tubi separati. Pipettare 2 ml del campione surnatante cellulare nella provetta di diluente 398 ml. Ciò fornirà una piega diluizione 200.
- Ripetere il passaggio 7.1.1 per ogni campione da analizzare.
- Pipettare 100 ml di campione diluito 200 volte e uno standard nei pozzetti di una piastra da 96 pozzetti.
- Incubare la piastra a 96 pozzetti a 25 ° C per 45 minuti su un agitatore per micropiastre a 150 rpm.
- Lavare i pozzetti 5 volte con soluzione tampone di lavaggio 1x. Una volta che l'ultimo lavaggio, rimuovere tutta la soluzione di lavaggio residua con carta assorbente.
- Aggiungere 500 ml di reagente HRP-coniugato in tutti i pozzetti.
- Ripetere i punti 7.2.2 - 7.2.3.
- Pipettare 100 ml di tetrametilbenzidina (TMB) dei reagenti in ciascun pozzetto della piastra da 96 pozzetti.
- Mescolare delicatamente piastra a 96 pozzetti a 25 ° C per 20 minuti su una micropiastraagitatore a 150 rpm. Arrestare la reazione aggiungendo direttamente 100 ml di soluzione di stop in ogni pozzetto e mescolare delicatamente. Una volta aggiunto alla soluzione di arresto il colore deve diventare giallo. Questo informa che la soluzione di arresto è stato correttamente miscelata.
- Utilizzo di un lettore di micropiastra, determinare la densità ottica a 450 nm entro i primi 5 minuti.
- Calcolare una tabella di valori di assorbanza media (A 450) per ogni campione e ciascuno standard.
- Montare una curva standard tracciando la media A 450 di ogni standard contro la sua concentrazione standard in ng / mL su un grafico lineare. Consentire l'asse x per rappresentare la concentrazione e l'asse y per rappresentare A 450 valori.
- Utilizzando la media A 450 da ciascun campione diluito, determinare la concentrazione della proteina desiderata in ng / mL dalla curva standard.
- Moltiplicare la concentrazione del campione per la diluizione di fattor. Ciò consentirà per determinare la concentrazione effettiva della proteina desiderata nel campione surnatante cellulare.
- Tracciare la tabella costruita da campioni in un grafico a linee. Se OD 450 valori non rientrano della curva standard, i campioni devono essere diluiti in modo appropriato e ri-testati.
- Normalizzare i risultati a 500.000 cellule.
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Representative Results
Istologia
Immagini luce microscopia rappresentativi di cellule isolate e coltivate primarie sono descritte nella Figura 1A. Immunocytochemical analisi dimostra che epatociti isolati altamente esprimono albumina (rosso) e fattore di crescita dei fibroblasti receptor 4 (FGFR4) (verde). I nuclei sono colorati con 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (blu). (Figura 1B).
Quantitativa real-time PCR
epatociti isolati primari sono stati trattati con FGF23 (25 ng / ml) LPS (100 ug / mL) o IL-6 (50 ng / ml) per 24 ore e livelli di mRNA di CRP e IL-6 sono stati analizzati mediante quantitativa PCR in tempo reale . FGF23, LPS e IL-6 significativamente aumentata espressione di CRP e IL-6. (Figura 2A)
supernatanti di colture cellulari da isolati epatociti primari sono stati analizzati mediante ELISA per i livelli di CRP. In linea con la nostra quantitativa in tempo reale PCR, LPS, IL-6 e trattamenti FGF23 aumentato in modo significativo i livelli di CRP in sovranatanti cellulari rispetto alle cellule PBS-trattati. (Figura 2B)
Figura 1: (A) contrasto di fase immagine microscopica di epatociti isolati primari murini. 24 ore dopo la placcatura, le cellule presentano una forma esagonale simile e spesso appaiono bi-nucleate. (Barra di scala = 100 micron); Analisi microscopica (B) immunofluorescenza rivela che la maggioranza delle cellule isolate esprimere albumina (rosso), un marcatore specifico epatociti. Le cellule altamente esprimono FGFR4 (verde). DAPI macchie nuclei. ingrandimento originale 40X. (Scala bar = 50 micron). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: quantitativa in tempo reale analisi PCR di isolati murini epatociti primari per determinare CRP e IL-6 Espressione. (A) LPS, IL-6 e FGF23 trattamenti aumentare significativamente i livelli di mRNA di CRP rispetto alle cellule PBS-trattati. (I valori sono espressi come variazione piega ± SEM; p <0.01; n = 3 isolamenti indipendenti). (B) Le cellule trattate con LPS, IL-6 o FGF23 mostrano anche un significativo aumento dei livelli di mRNA di IL-6 rispetto ai trattamenti PBS. (I valori sono espressi come variazione piega ± SEM; p <0.001; n = 3 isolamenti indipendenti) (C) Quantificazione dei livelli di proteina CRP insurnatanti da isolati epatociti primari murini mediante test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). LPS, IL-6 e FGF23 aumentare significativamente i livelli di proteina CRP rispetto ai trattamenti PBS. I valori rappresentano le concentrazioni di CRP in mg / dl per 500.000 cellule. (P <0,05, n = 3 isolamenti indipendenti). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Isolando epatociti primari da topi è uno strumento veloce, economico e affidabile per studiare le risposte infiammatorie ex vivo. Se eseguita correttamente, i risultati possono essere facilmente generati e riprodotti in modo tempestivo ed economicamente efficiente. I seguenti punti devono essere attentamente valutati per assicurare un isolamento efficace.
L'incisione chirurgica e incannulamento della IVC devono essere eseguite in anestesia generale e non dopo l'eutanasia. Un giovane, ricercatore inesperto avrà bisogno di più tempo in origine, per acquisire familiarità con le caratteristiche anatomiche del ventre murino e per eseguire una corretta incannulamento. Mantenere l'animale donatore in vita fino alla perfusione inizia, aumenterà in modo significativo la vitalità delle cellule isolate. Legatura del sovra-epatico IVC deve essere eseguita poiché aumenterà significativamente la resa di epatociti isolati. In alternativa, un morsetto micro-chirurgica può essere collocato sul IVC.Tuttavia, a seguito di toracotomia, l'animale diventerà deceduta entro un paio di minuti. Quindi tutti i passi successivi devono essere eseguite prontamente per assicurare che il fegato mantiene il flusso di sangue sufficiente fino all'inizio di perfusione. Per la cannulazione, l'uso di un catetere endovenoso retrattile è altamente raccomandato. Dopo cannulating l'IVC, l'ago catetere può essere attentamente retratto, che minimizza il rischio di perforazione del vaso. L'ultimo passo critico è il collegamento del sistema di perfusione al catetere. Dopo aver rimosso l'ago dal catetere, il sangue deve defluire dalla fine del catetere prima di collegarlo ad una pompa di perfusione. Questo passo minimizza il rischio di emboli aria, che può causare una significativa riduzione della quantità e la qualità delle cellule isolate.
Una volta avviata la perfusione, fegato dovrebbe cambiare immediatamente ed omogeneamente il suo colore da rosso a giallo pallido. Parti rimanenti rosso indicherà insufficperfusione iente o la presenza di aria emboli. Lavaggio e filtraggio delle cellule isolate devono essere eseguite ripetutamente. Ciò garantirà la rimozione efficiente dei detriti cellulari eccesso. epatociti isolati sani aderiranno entro le prime 4 ore di essere placcato. Quindi, i media placcatura possono essere cambiati a supporto di manutenzione, a questo punto di tempo. Dopo incubazione durante la notte, le cellule verranno visualizzati in una forma più esagonale con un nucleo di primo piano. Epatociti possono anche essere bi-nucleare (Figura 1A). La granulazione o blebbing cellulare è un indicatore per un povero isolamento. Se epatociti continuamente non aderiscono correttamente o la vitalità cellulare rimane bassa, la quantità di materiale utilizzato per la digestione perfusione deve essere modificato. Questo dovrebbe evitare sovra o underdigestion di tessuto epatico.
Se è richiesta una maggiore resa di cellule, una perfusione anterograda attraverso la vena porta può essere eseguita. Klaunig et al. hanno dimostrato che questa particolare tecnica può aumentare la resa cellulare totale. alternatively, seguendo vena incannulamento stringendo intermittente della IVC può essere applicata. Ciò periodicamente aumentare la pressione durante la perfusione e presumibilmente può anche aumentare il numero totale di cellule isolate. Tempo di perfusione così come il tasso di perfusione potrebbero dover essere regolato 14. Noi, però, non abbiamo eseguito i protocolli di perfusione alternativi.
Dopo un primo isolamento successo, una immunocolorazione specifico epatociti (ad esempio per l'albumina) deve essere eseguita per garantire la purezza del isolamento (Figura 1B). 24 ore dopo l'isolamento, epatociti vanno siero a digiuno per 4 a 8 ore e poi utilizzati per i trattamenti. Quando si studia la risposta di fase acuta, le cellule possono essere trattati con LPS, che è noto per indurre l'infiammazione tramite Toll-like receptor 4 e NF-kB 15. Citochine pro-infiammatorie, quali IL-6, mediano i loro effetti attraverso i recettori interleuchina 16.Inoltre, abbiamo recentemente dimostrato che FGF23 può attivare FGFR4 e / calcineurina / NFAT percorso PLCγ e indurre una risposta infiammatoria nel fegato 7, 17. Per garantire la trascrizione e traduzione di geni bersaglio sufficiente, le cellule devono essere trattati per 24 h. Isolando mRNA e analisi consecutiva di espressione genica utilizzando quantitativa real-time PCR insieme con ELISA dei sovranatanti di cellule fornisce informazioni robusto che può essere facilmente ripetuto. In questo modo la ricerca di mediatori pro-infiammatori romanzo, i suoi recettori epatici e dei loro meccanismi di segnalazione a valle consecutivi. pile isolate, soprattutto da animali transgenici forniranno risultati superiori rispetto alle linee di cellule di cancro generici come le cellule HepG2 e Hep3B. Grazie alla sua semplicità, questo approccio può essere utilizzato anche per proiezioni per studiare l'effetto di nuovi farmaci. Tuttavia, lo studio farmacologico complesso o pato-physiolomeccanismi gici richiedono ulteriori esperimenti confermative, soprattutto in un ambiente in vivo.
Non abbiamo effettuato studi a lungo termine da epatociti isolati tendono a dedifferentiate entro un paio di giorni. Tuttavia, questo può essere superato mediante tecniche speciali di coltura cellulare, come riportato da altri 18. Questi includono la configurazione di collagene a doppio gel, sferoidi epatociti, co-coltura con cellule endoteliali, e micropatterned co-culture con fibroblasti 3T3-J2. Nel loro insieme, l'isolamento di epatociti adulti murini primari fornisce uno strumento robusto per gli scienziati interessati alla metabolomica, infiammazione, immunità e la risposta epatica di farmaci e tossine. Essa è caratterizzata da semplice fattibilità, costi moderati e riproducibilità veloce.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal NIH (R01HL128714 a CF) e (F31DK10236101 a KS) e l'American Heart Association (CF e AG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer | Falcon | 352350 | |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381412 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
| 100 6-inch Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | |
| 1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2 | Becton Dickinson | 329420 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style | Corning | 353003 | |
| 6 well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| 5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards) | LOOK | SP115 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Minipuls 3 Perfusion Pump | Gilson | F155007 | |
| Hemacytometer Kits, Propper | VWR | 48300-474 | |
| Hemacytometer Cover Glasses, Propper | VWR | 48300-470 | |
| Surgical Scissers - Sharp/Blunt | F.S.T. | 14001-12 | |
| Iris Scissors-ToughCut Straight | F.S.T. | 14058-11 | |
| Dumont SS-45 Forceps | F.S.T. | 11203-25 | |
| Student Tissue Forceps | F.S.T. | 991121-12 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetic acid solution, 2.0 N | Sigma | A8976-100ML | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL) | VEDCO | 50989-161-06 | |
| Xylazine 100 mg/mL | AnaSed Injection | 139-236 | |
| Willams' Medium E (1x) | gibco | 12551-032 | |
| Liver Perfusion Medium (1x) | gibco | 17701-038 | |
| Liver Digest Medium (1x) | Life Technologies | 17703034 | |
| Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | Life Technologies | CM3000 | |
| Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | Life Technologies | CM4000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4 | ThermoFisher scientific | 10010031 | |
| Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Trypan Blue Solution | VWR | 45000-717 |
References
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