Summary
Questo protocollo descrive cloacal massaggio, tecnica manuale non invasiva per la raccolta di sperma da uccelli ed estrazione di DNA da aviaria dello sperma usando un kit di estrazione commerciale con modifiche.
Abstract
Raccolta di sperma può essere utile per una vasta gamma di applicazioni, tra cui studi su qualità dello sperma, sperma del telomero dinamiche e l'epigenetica. Gli uccelli sono soggetti ampiamente usati nella ricerca biologica e sono ideali per studi condotti su campioni di sperma ripetuti. Tuttavia, poche risorse sono disponibili per coloro che desiderano imparare a raccogliere ed estrarre DNA da sperma aviaria. Qui descriviamo cloacal massaggio, una tecnica manuale dolce, non invasiva per la raccolta dello sperma aviaria. Anche se questa tecnica è stabilita nella letteratura, può essere difficile da imparare dalle descrizioni disponibili. Forniamo anche informazioni per l'estrazione del DNA da aviaria sperma usando un kit di estrazione commerciale con modifiche. Massaggi cloacal possono essere facilmente utilizzato su qualsiasi uccello maschio medio-piccole in condizione riproduttiva. Dopo il prelievo, lo sperma può essere utilizzato immediatamente per saggi di motilità, o bloccato per l'estrazione del DNA seguendo il protocollo descritto nel presente documento. Questo protocollo di estrazione è stato perfezionato per aviaria sperma ed è stato utilizzato con successo su campioni raccolti da diverse specie di passeriformi (Passer domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanuse Turdus migratorius ) e un columbid (Columba livia).
Introduction
Gli uccelli sono soggetti ideali per studi su qualità dello sperma e concorso1, sperma del telomero dinamica2, epigenetica3e argomenti simili, come essi sono ampiamente utilizzati nella ricerca biologica e dello sperma può essere facilmente campionato utilizzando cloacal massaggi. Cloacal massaggio è una tecnica manuale dolce, non invasiva per la raccolta dello sperma da uccelli4,5,6. Campioni ripetuti possono essere ottenuti facilmente e attrezzi speciali non sono necessari, che lo rende semplice da eseguire nel campo o nel laboratorio. Anche se cloacal massaggi sono stato in uso per decenni, è difficile da imparare dalla scritta descrizioni disponibili. Questa pubblicazione è intesa a ridurre il tempo e l'incertezza coinvolti nell'apprendimento massaggi cloacal.
Lo sperma raccolto da uccelli utilizzando cloacal massaggio può essere utilizzato immediatamente per motilità valutazione4,7 o8di inseminazione artificiale, o congelato per altri usi come imaging avanzato e l'estrazione del DNA. Campioni di liquido seminale da uccelli passeriformi sono piccoli ma contengono sperma densamente imballato. Il DNA è estratto usando un kit di estrazione commerciale per semplicità, con modifiche per superare le caratteristiche protettive specializzate di sperma9. Dopo l'estrazione, i telomeri dello sperma possono essere misurati usando qPCR10.
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Protocol
Questo protocollo coinvolge soggetti animali vertebrati ed è stato approvato dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) North Dakota State University.
1. centri di raccolta da un uccello passeriforme utilizzando cloacal massaggi
Nota: Cloacal massaggio è una tecnica di raccolta di sperma efficace sugli uccelli riproduttivo attivi solo, ma può essere eseguita correttamente di fuori della stagione riproduttiva nelle opportune situazioni in cattività. Attività riproduttiva deve essere determinata per specie di destinazione prima di utilizzare massaggio cloacal. Questa tecnica può essere utilizzata su uccelli selvatici al momento cattura o sugli uccelli tenuti in cattività.
- A partire con un uccello maschio, (in condizioni di allevamento) presa di Bonetti nella mano non dominante, trasferire l'uccello alla mano dominante con il lato ventrale toccando il palmo (Figura 1).
- Assicurarsi che la testa dell'uccello è più vicino il bordo laterale del palmo della mano. Garantire leggermente la testa e il corpo utilizzando il mignolo, anello e le barrette centrali. Questo lascia l'uccello dello sfiato e coda esposti.
- Lasciare le gambe d'uccello sciolti o leggermente trattenuto usando il palmo.
Figura 1 : Presa per massaggi cloacal. L'uccello è protetto con leggerezza nella mano dominante con il lato ventrale toccando la Palma e la testa, protetta dal dito mignolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Posizionare l'indice e pollice dominante su entrambi i lati dell'estremità superiore della cloaca e leggermente avvicinare le dita esercitando una pressione molto lieve verso la coda ( Figura 2). La cloaca sarà evert, esponendo la mucosa cloacale (interni rosa).
Nota: Se l'uccello non è attualmente in produzione dello sperma, la protuberanza cloacal può essere piccola e la cloaca è difficile da evert. Con esperienza, è facile distinguere tra il cloacas i maschi riproduttivi attivi e inattivi5,11.
Figura 2 : Dito posizione e protuberanza cloacal. Evert cloaca applicando leggera pressione all'estremità superiore (A). In un passeriforme maschio riproduttivo attivo, è evidente la protuberanza cloacale e impresa (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Con la mano non dominante, posizionare il cuscinetto del dito indice sul lato dorsale della base della coda per stabilizzare la mano e quindi posizionare la punta del pollice appena sotto la cloaca anteverso.
Nota: Una miniatura corta e liscia è vantaggiosa per l'esecuzione di massaggi cloacal e protegge l'uccello da un infortunio accidentale. - Spostare il pollice non dominante cranialmente e profondo in un movimento ripetitivo con media pressione, restando di sotto della cloaca. Continuare fino a quando l'uccello eiacula. A seconda dell'individuo, ciò avviene in genere tra 1 e parecchi dozzina colpi.
- Non appena l'uccello eiacula, raccogliere lo sperma in un tubo di microhematocrit. Ripetere cloacal massaggio per ottenere più eiacula.
Nota: Lo sperma passeriforme è marrone chiaro e in genere ha una consistenza piuttosto densa. Bianche o scure sostanze espulsione dalla cloaca non sono lo sperma e potrebbero contaminare il campione di sperma. L'aspetto di una piccola quantità di sangue sulla cloaca o misto in con lo sperma è solitamente causato da troppa pressione durante il massaggio. - Per estrazione del DNA, è possibile inserire lo sperma in un tubo del microcentrifuge con 20 µ l di 1X PBS (pH 7.4). Nota: Semen memorizzati in 1X PBS non è adatto per l'inseminazione artificiale, ma può essere utilizzato per l'estrazione di DNA in un secondo momento quando conservato a-80 ° C. Il PBS può essere a temperatura ambiente o refrigerati, ma dovrebbe essere in uno stato liquido quando viene depositato il campione di sperma.
- Confermare la presenza di spermatozoi nel campione visualizzando una piccola quantità del campione diluito sotto un microscopio composto (Figura 3).
- Conservare lo sperma diluito a-80 ° C fino all'estrazione.
2. estrazione di DNA da sperma di uccello
Nota: Questo protocollo è stato testato con più kit commerciali di estrazione del DNA, ma ha solo avuto successo quando viene utilizzato con un DNA kit12. Passaggi che vengono modificati dal protocollo kit sono indicati da *.
- Preparare una soluzione 1 M di ditiotreitolo (DTT) in acqua e mescolare usando un vortex.*
- Aliquota della soluzione DTT e conservare a-20 ° C fino a immediatamente prima dell'uso. Ogni campione deve essere estratto richiede 10 µ l di soluzione di 1m DTT
- Preparare un tampone contenente 20 mM Tris-Cl, pH 8.0; 20 mM EDTA; 200 mM NaCL; e 4% SDS. Ogni campione deve essere estratto richiede 90 µ l di questa buffer.*
- Conservare il tampone a temperatura ambiente. Se è precipitato, riscaldarlo a 56 ° C per dissolve.*
- Preriscaldare un incubatore contenente un rocker o agitatore a 65 ° c. *
- Immediatamente prima di iniziare l'estrazione, mescolare 10 µ l di soluzione DTT con 90 µ l di tampone preparata al punto 2.2 per ciascun campione da estrarre, ad esempio 900 µ l di tampone più 100 µ l di soluzione DTT se l'estrazione di 10 campioni. Questa miscela si chiamerà DTT-buffer.*
- Aggiungere 70 µ l 1X PBS per il campione di sperma diluito intero e mescolare bene con un vortex.*
- Aggiungere 100 µ l DTT-buffer e 10 µ l di soluzione di proteinasi K al campione. Vortice per 20 secondi, quindi Incubare in incubatrice preriscaldato per 1 ora su un bilanciere o shaker.*
- Aggiungere 200 µ l tampone AL e 200 µ l fresco EtOH (100%) e vortex per 20 seconds.*
- Trasferire l'intero campione a una colonna di spin e centrifugare a 1 minuto a 6.000 x g. gettare la provetta di raccolta.
- Posizionare la colonna su un tubo nuovo e aggiungere 500 µ l preparati buffer AW1. Centrifugare 1 minuto a 6.000 x g. gettare la provetta di raccolta.
- Posizionare la colonna su un tubo nuovo e aggiungere 500 µ l preparati buffer AW2. Centrifugare per 1 minuto a 6.000 g. x eliminare il flusso continuo e posto la colonna posteriore sul tubo.
- Centrifugare per 3 minuti a 20.000 x g. gettare il tubo di raccolta e posizionare la colonna in una microcentrifuga da 1,5 mL.
- Dispensare 35 µ l di AE buffer direttamente sulla membrana di colonna e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. *
- Centrifugare 1 minuto a 14.000 x g. gettare la colonna di spin e conservare i campioni estratti a-80 ° C.
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Representative Results
Cloacal massaggi e DNA estrazione utilizzando che il protocollo descritto è stato eseguito su diverse specie di passeriformi e uno columbid (tabella 1). Visualizzando una piccola quantità di campioni diluiti sotto un microscopio composto a 400 ingrandimenti (Figura 3) è stata confermata la presenza di spermatozoi nel seme campioni raccolti da massaggio cloacal. Dopo l'estrazione del DNA dai campioni di sperma raccolto da passeri della camera mediante il protocollo descritto qui, otto campioni sono stati analizzati su elettroforesi del gel con un DNA ladder (tre campioni possono essere visto nella Figura 4). Fasce distinte senza sbavature sono stati veduti in tutte e otto le corsie di campione, che indica successo isolamento di alta qualità del DNA. Tutti gli altri campioni estratti utilizzando questo protocollo sono stati valutati per la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro (Vedi tabella 1).
Figura 3: sperma da due piccoli passeriformi. Questi spermatozoi campioni sono stati ottenuti da cloacal massaggi da un Carpodaco messicano (Haemorhous mexicanus), a sinistra e un passero domestico (Passer domesticus), destro, intrappolati in Fargo, ND nel 2016. I campioni sono stati diluiti in 20 µ l PBS e visti al microscopio composto a 1.000 X e 400 ingrandimenti, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : DNA elettroforesi del DNA spermatico. Tre campioni di DNA Estratto da passero sperma correre su un gel con un DNA ladder. Si noti la presenza di fasce distinte, che indica successo estrazione di DNA di alta qualità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Passero domestico (Passer domesticus) | Scheggia del passero (Spizella passerina) | Carpodaco messicano (Haemorhous mexicanus) | Pettirosso americano (Turdus migratorius) | Piccione di roccia (colomba livia) | |
| Numero di campioni raccolti | 156 | 3 | 2 | 2 | 2 |
| Numero di campioni estratti | 90 | 3 | 2 | 2 | 2 |
| Tasso di successo di raccolta dello sperma | 98% | 75% | 100% | 67% | 67% |
Tabella 1: specie e campioni raccolti ed estratti in data. Al momento della pubblicazione, i campioni sono stati elaborati utilizzando il protocollo descritto da 4 specie di passeriformi e 1 columbid. Tasso di successo di raccolta dello sperma si riferisce alla percentuale di ciascuno per il quale un campione è stato ottenuto con successo rispetto al numero totale ha tentato.
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Discussion
Descriviamo un metodo semplice e affidabile per la raccolta dello sperma da uccelli di piccoli e medi in stato riproduttivo attivo ed estrazione di DNA da sperma aviaria.
Il protocollo di estrazione del DNA dello sperma descritto viene modificato da un kit per semplicità, ma è stato perfezionato per l'uso su sperma aviaria. Gli spermatozoi sono resistenti alla lisi di estrazione standard prodotti chimici9,13, e campioni di sperma raccolti da Passeriformi sono abbastanza piccoli (in genere pochi microlitri). Questi fattori presenti sfide che sono superate con successo usando una concentrazione appropriata della DTT e incubando a 65 ° C. Utilizzando questo metodo, abbiamo costantemente isolato quantità utilizzabile di DNA per analisi di qPCR di lunghezza del telomero sperma (in genere tra 40-250 ng / µ l, a seconda del volume di liquido seminale).
DTT in precedenza è stato utilizzato per estrarre il DNA da aviaria sperma in combinazione con una reazione di fenolo/cloroformio13. Reazioni di fenolo/cloroformio sono efficaci per isolamento del DNA, ma sono molto più tempo, sono più pericolose e richiedono una cappa aspirante. Una limitazione notevole del nostro protocollo di estrazione è che ha solo avuto successo quando utilizzato con una marca e tipo di kit di estrazione, possibilmente dovuto il piccolo volume di campione di partenza. Campioni di sperma molto piccolo (meno di 1 µ l) o con densità bassa dello sperma può impedire il successo estrazione del DNA a causa di insufficiente DNA presente nel campione, ma non abbiamo incontrato questo problema quando cloacal massaggio viene eseguito su uccelli in condizioni di allevamento . Per evitare questo problema, massaggi cloacal possono essere ripetuta immediatamente a raccogliere eiacula multipli che possa essere messe in comune per l'estrazione.
Massaggi cloacal è stato in uso per decenni e in molte specie1,4,5,6,7,15,16,17ed è un rapido ed efficace mezzo di raccolta dello sperma da uccelli in molti casi. Per gli studi che coinvolgono gli uccelli selvatici o inesperti che possono essere catturati, è più efficace rispetto ai metodi di raccolta che si basano su solide un uccello maschio di accoppiarsi con un elemento e depositare il suo seme volentieri4. Un altro metodo di raccolta di sperma è tramite la dissezione dei testicoli o glomera seminale, ma non si tratta di un'opzione per scopi di conservazione o ripetuti campionamenti4,14. Il limite principale del massaggio cloacal è la difficoltà nell'apprendimento della tecnica senza dimostrazione. Le descrizioni scritte sono spesso insufficienti a capire e imparare a implementare il processo. Illustrando cloacal massaggi in dettaglio, speriamo di ridurre i tempi di apprendimento e difficoltà per coloro che desiderano imparare la tecnica.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Grazie Jose Noguera per intervento tempestivo con massaggio cloacal, e Jeffrey Kittilson per il laboratorio di supporto. Questo lavoro è stato supportato da un premio di ND EPSCoR FAR0022429 a BJH. Spese di pubblicazione sono stati generosamente sostenute dal dipartimento di scienze biologiche di NDSU.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microhematocrit capillary tubes | Fisherbrand | 22-362566 | Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow. |
| Microcentrifuge tubes | Any | ||
| 1x PBS | Any | Used for storing semen samples prior to DNA extraction. | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | Any supplier can be used. |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1233508 | Any supplier can be used. |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | Any supplier can be used. |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | Any supplier can be used. |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us. |
References
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