Summary
このプロトコルでは、排せつマッサージ、鳥、および変更と商業抽出キットを使用して鳥の精子から DNA の抽出から精液を収集するため非侵襲的な手動技術について説明します。
Abstract
精液の採取は、精子の質、精子テロメア ダイナミクス、エピジェネティクス研究を含むアプリケーションの広い範囲のために役立ちます。鳥は広く使用されている科目は、生物学的研究、繰り返し精子サンプルを含む研究に最適です。ただし、いくつかのリソースは現在利用可能な収集および鳥の精子から DNA を抽出する方法を学びたい人のためです。ここで排せつマッサージ、鳥精子を収集するための穏やかな、非侵襲的な手動技術について述べる。文献でこの手法を確立すると、使用可能な記述から学ぶことは困難ことはできます。また、変更と商業抽出キットを使用して鳥の精液から DNA を抽出するための情報を提供いたします。排せつマッサージは、生殖状態で中規模男性鳥で容易に使用することができます。次のコレクション、精液は運動アッセイのためすぐに使用または記載プロトコルを次の DNA の抽出のために冷凍できます。この抽出プロトコル鳥精子の洗練された、いくつかのスズメ目種 (通行人国立公園、 Spizella passerina、 Haemorhous メキシコ、およびつぐみ migratorius から収集されたサンプルで正常に使用されています。) と 1 つの columbid (コルンバ ・ リヴィア)。
Introduction
鳥が生物学の研究に幅広く使用されている精子は排せつを使用して簡単にサンプリングすることができますと精子の質と競争1、精子テロメア ダイナミクス2エピジェネティクス3と似たようなトピックを含む研究のための理想的な科目マッサージ。排せつマッサージは鳥4,5,6から精液を収集するための穏やかな、非侵襲的な手動技術です。繰り返しサンプルを簡単に得ることができる、特別な工具も不要、簡単にフィールドまたはラボで実行できるように。排せつのマッサージは、何十年も使用されている、利用可能な説明が書かれてから学ぶことは困難です。このパブリケーションは、排せつマッサージを学習に関わる不確実性を低減するものです。
排せつマッサージを使用して鳥から収集した精液は、運動評価4,7または人工授精8、すぐに使用または高度なイメージングおよび DNA の抽出等の用途として冷凍することができます。スズメ目の鳥から精液サンプルは小さいが密集精子を含まれています。精子9の特殊な保護機能を克服するための変更を簡単にするため商業抽出キットを使用して DNA を抽出します。抽出後、qPCR10を使用して精子テロメアを測定できます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
このプロトコルは脊椎動物の動物科目を含み、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ノースダコタ州立大学でによって承認されています。
1. 精液採取排せつマッサージを使用してスズメ目の鳥から
注: 排せつマッサージ繁殖アクティブな鳥のみ、効果的な精液収集手法ですが、適切な飼育状況で繁殖シーズン以外正常に実行することができます。排せつのマッサージを使用する前にターゲット種の生殖活動を決定してください。キャプチャ時に野生の鳥や鳥が飼育下で開催、この手法を使用することができます。
- (繁殖条件) で、雄の鳥から始まる非利き手でのバンダのグリップは、腹側 (図 1) の手のひらに触れると支配的な手に鳥を転送します。
- 鳥の頭は手のひらの外側の縁に最も近いことを確認します。軽く頭と小指、リングおよび中指を使用してボディを保護します。これは、鳥の口と尾公開を残します。
- 緩んでいるか、軽く手のひらを使用して拘束された鳥の足を残します。
図 1: 排せつマッサージ グリップします。鳥はその腹側の手のひらと小指担保の頭に触れると、軽く利き手でセキュリティ保護されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
- 腔の優れた終わりのどちら側でも支配的な人差し指と親指を置き、軽く尾 (図 2) の方の非常にわずかな圧力を適用するときに一緒に指を挟んだり。排泄腔が片脚、排せつの粘膜 (ピンク インテリア) を公開します。
注: 鳥がない場合排せつの突起が小さいことができる現在、精液を生産と排泄腔が片脚にくい。経験を持つ、繁殖アクティブおよび非アクティブの男性5,11cloacas 区別するために簡単です。
図 2: 位置や排せつ突起を指します。優れたエンド (A) にわずかな圧力を適用することによって、総排出腔を片脚します。繁殖アクティブな男性のスズメ目、排せつの突起は明白と (B) の会社。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
- 非支配的な手で手を安定させるために尾のベースの背側に指のパッドを配置し、すぼまり腔下親指の先端。
注: 短く、滑らかなサムネイルは排せつマッサージを実行するため有利であり傷害から鳥を保護します。 - 中型圧力、クロアカ以下の滞在の反復運動に深いと頭側非利き手親指を移動します。鳥が射精するまで続行します。個人によって通常 1 といくつかのダース ストローク間かかります。
- 鳥が射精すると、すぐに microhematocrit チューブで精液を収集します。複数射精を取得する排せつマッサージを繰り返します。
注: スズメ目精液は明るい茶色で、通常やや濃厚。白や暗い物質排泄腔から排出、精液は、精液のサンプルを汚染する可能性があります。腔に少量の血液の外観または混合される精液は、通常のマッサージ中にあまりにも多くの圧力によって引き起こされます。 - DNA の抽出の 1x PBS (pH 7.4) の 20 μ L の微量遠心チューブに精液を配置します。注: 1 × PBS で保存精液人工授精には適していませんが、後日 DNA 抽出のため使用することができます-80 ° C で保存する場合PBS 室温または冷蔵しますが、精液のサンプルが到着したとき、液体の状態にする必要があります。
- サンプルで精子の存在を確認するには、複合顕微鏡 (図 3) の下で希釈サンプルの少量を表示します。
- 抽出まで-80 ° C で希釈精液を格納します。
2. 鳥の精液からの DNA の抽出
注: このプロトコルは、複数の商業 DNA 抽出キットでテストされていますが、のみ 1 つの DNA キット12で使用する場合は成功しています。キットのプロトコルからの変更手順で示されます *。
- ジチオトレイトール (DTT) 水での 1 M 溶液を準備し、vortex.* を使用してミックス
- 因数 DTT ソリューション使用直前まで-20 ° C で保存します。抽出する各サンプルは 1 M の DTT の solution.* の 10 μ L を必要とします。
- 20 ミリメートル pH 8.0; トリス-の Cl を含むバッファーを準備します。20 mM EDTA;200 mM の NaCL;4 %sds。各サンプルを抽出するこの buffer.* の 90 μ L が必要です。
- 室温でバッファーを保存します。それは沈殿させた場合 dissolve.* 56 ° C に温めてください。
- ロッカーまたは 65 にシェーカーを含むインキュベーターを予熱 ° C.*
- すぐに抽出を開始、する前にバッファーの場合は 10 試料を抽出手順 2.2 各サンプル抽出する、例えば900 μ L バッファーに加え 100 μ L DTT ソリューションで準備の 90 μ L で 10 μ L DTT ソリューションをミックスします。この混合物は DTT buffer.* と呼ばれる、
- 全体の希釈精液サンプルを 70 μ L 1 × PBS を追加し、vortex.* でよく混ぜ
- 100 μ L を追加 DTT バッファー、サンプルに 10 μ L プロティナーゼ K ソリューション。20 秒間、渦、予熱したインキュベーターで 1 時間インキュベート ロッカーまたは shaker.*
- 200 μ L バッファー アルと 200 μ L を追加新鮮なエタノール (100%)、20 seconds.* の渦
- スピン列にサンプル全体を転送し、6,000 x g. 破棄で 1 分コレクション チューブを遠心分離します。
- 新しいチューブに列を配置し、500 μ L 準備バッファー AW1 を追加します。6,000 x g. 破棄で 1 分コレクション チューブを遠心分離機します。
- 新しいチューブに列を配置し、500 μ L 準備バッファー AW2 を追加します。6,000 x g に 1 分間遠心は、フロースルーと列がチューブに戻って配置を破棄します。
- 20,000 x g 破棄に 3 分コレクション チューブを遠心し、1.5 mL 遠心チューブに列を配置します。
- ピペット 35 μ L AE の列膜に直接バッファーし、5 分ではあ、室温でインキュベート
- スピン列 14,000 x g 破棄に 1 分を遠心し、-80 ° C で抽出されたサンプルを格納
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
排せつマッサージと DNA 抽出を使用していくつかのスズメ目種と 1 つの columbid (表 1) で行われた記述のプロトコル。排せつマッサージによって収集された精液に精子の存在は、400 倍の倍率 (図 3) で少量の化合物顕微鏡下で希釈した試料を表示することによって確認されました。ここで説明されているプロトコルを使用して家すずめから収集された精液のサンプルから DNA を抽出後、8 個のサンプルはゲル電気泳動法 (図 4の 3 つのサンプルを見ることができる) DNA の梯子で実行しました。高品質 DNA の分離を成功させるに示すサンプル レーンのすべての 8 で塗りつけなし明瞭なバンドを見た。このプロトコルを使用して抽出した他のすべてのサンプルは、分光光度計 (テーブル 1を参照) を用いた DNA 濃度の評価されました。
図 3: 2 つの小さな産スズメ目鳥から精子。左、メキシコマシコ (Haemorhous メキシコ) から排せつマッサージと右、家すずめ (通行人国立公園)、採取したこれらの精子は、2016 年にファーゴ、ノースダコタに閉じ込められました。サンプルそれぞれ 20 μ L の PBS で希釈され、それぞれ 1,000 倍と 400 倍の倍率での顕微鏡の下に表示。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 精子 DNA の電気泳動のゲルの DNA します。3 つのサンプルの家すずめの精液から抽出した DNA は DNA の梯子が付いているゲルで実行します。高品質の DNA を正しく抽出を示す明瞭なバンドの存在に注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 家すずめ (通行人国立公園) | チャガシラヒメドリ (Spizella passerina) | 家フィンチ (Haemorhous メキシコ) | アメリカのロビン (つぐみ migratorius) | カワラバト (コルンバ ・ リヴィア) | |
| 収集されたサンプルの数 | 156 | 3 | 2 | 2 | 2 |
| 抽出サンプル数 | 90 | 3 | 2 | 2 | 2 |
| 精液回収成功率 | 98% | 75% | 100% | 67% | 67% |
表 1: 種およびサンプルの収集まで抽出します。出版物の時に、サンプルは、スズメ目 4 種と 1 columbid から記述されているプロトコルを使用して処理されています。精液回収成功率は試行の合計数のうち正常に取得されましたサンプルをそれぞれの割合を指します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
シンプルで信頼性の高い繁殖アクティブ状態でない中小鳥から精液を収集し、鳥の精子から DNA を抽出法について述べる.
記述されていた精液の DNA の抽出のプロトコルは便宜上、キットからは変更が、鳥ザーメン使用の洗練されました。精子が標準抽出化学9,13、溶解耐性と産スズメ目鳥から収集した精液のサンプルが非常に小さい (通常数マイクロリットル)。これらの要因は、DTT の適切な濃度を使用し、65 ° c. で孵化によって正常に克服するための課題を提示します。このメソッドを使用して、我々 は一貫して精子テロメアの長さ (通常 40 250 ng/μ L、射精量に応じて) 間の qPCR の分析のための使用可能な量の DNA を分離しています。
DTT は、フェノール/クロロホルム反応13との組み合わせで鳥の精子から DNA を抽出する以前使用されています。フェノール/クロロホルム反応は、DNA を隔離するため効果がより時間がかかり、危険なし、ヒューム フードを必要とします。私たちの抽出のプロトコルの主な制限は、それだけ成功させるには、1 つのブランドとタイプの少量サンプルを開始のための抽出キットで使用されているです。(未満 1 μ L) の非常に小さい精液サンプルまたは密度の低い精子サンプルは成功の十分な DNA のサンプルでは、現在のための DNA の抽出を防ぐことができますが、条件の繁殖の鳥に排せつマッサージが実行されるときにこの問題を発生していない私たち.この問題を回避するには、は、排せつマッサージを抽出するためにプールすることができます複数の射精を収集するためにすぐに繰り返すことが。
排せつマッサージ、多く種1,4,5,6,7,15,16,17、何十年も使用されているし、は、多くの場合鳥から精液を収集の迅速かつ効果的な手段。捕獲できる野生または未熟な鳥を含む研究項目に交尾し、彼の精液を喜んで入金に雄の鳥を説得力に依存するコレクションの方法よりもより効果的です4。別の精液コレクション メソッドは精巣の精 glomera 郭清が、これは繰り返しサンプリング4,14または保全目的のためのオプションではありません。排せつマッサージの主な制限は、デモなし学習の難しさです。書かれた説明多いを理解し、学ぶプロセスを実装するための十分なないです。排せつマッサージの詳細を示すは、我々 は技術を学びたい人のための学習時間と難易度を減らすために願っています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
排せつのマッサージと早期支援ありがとうサンノゼ施設と研究所のジェフリー ・ Kittilson をサポートします。この作品は、BJH に ND EPSCoR FAR0022429 賞によって支えられました。出版費用は寛大清心生物学科によってをサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microhematocrit capillary tubes | Fisherbrand | 22-362566 | Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow. |
| Microcentrifuge tubes | Any | ||
| 1x PBS | Any | Used for storing semen samples prior to DNA extraction. | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | Any supplier can be used. |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1233508 | Any supplier can be used. |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | Any supplier can be used. |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | Any supplier can be used. |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us. |
References
- Briskie, J. V., Montgomerie, R. Sperm size and sperm competition in birds. Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).
- Monaghan, P. Telomeres and life histories: the long and the short of it. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).
- Carrell, D. T.
- Burrows, W. H., Quinn, J. P. The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey. Poultry Science. 16 (1), 19-24 (1937).
- Wolfson, A. The cloacal protuberance: a means for determining breeding condition in live male birds. Bird-Banding. 23 (4), 159-165 (1952).
- Kast, T. L., Ketterson, E. D., Nolan, V. Variation in ejaculate quality in dark-eyed juncos according to season, stage of reproduction, and testosterone treatment. The Auk. 115 (3), 684-693 (1998).
- Helfenstein, F., Podevin, M., Richner, H. Sperm morphology, swimming velocity, and longevity in the house sparrow Passer domesticus. Behav. Ecol. Sociobiol. 64, 557-565 (2010).
- Purchase, C. F., Earle, P. T. Modifications to the IMAGEJ computer assisted sperm analysis plugin greatly improve efficiency and fundamentally alter the scope of attainable data. J. Appl. Icthyol. 28, 1013-1016 (2012).
- Gill, P., Jeffreys, A. J., Werrett, D. J. Forensic application of DNA 'fingerprints'. Nature. 318 (12), 577-579 (1985).
- Criscuolo, F., et al. Real-time quantitative PCR assay for measurement of avian telomeres. J. Avian Biol. 40, 342-347 (2009).
- Lovette, I. J., Fitzpatrick, J. W. Cornell Lab of Ornithology Handbook of Bird Biology, 3rd Edition. , Wiley-Blackwell, Princeton University Press. ISBN 9781118291047 (2016).
- QIAamp DNA Micro Handbook. , Third edition (2014).
- Carter, K. L., Robertson, B. C., Kempenaers, B. A differential DNA extraction method for sperm on the perivitelline membrane of avian eggs. Mol. Ecol. 9, 2149-2154 (2000).
- Birkhead, T. R., Buchanan, K. L., Devoogd, T. J., Pellatt, E. J., Catchpole, C. K. Song, sperm quality and testes asymmetry in the sedge warbler. Anim. Behav. 53, 965-971 (1997).
- Lüpold, S., Calhim, S., Immler, S., Birkhead, T. R. Sperm morphology and sperm velocity in passerine birds. Proc. R. Soc. B. 276, 1175-1181 (2009).
- Samour, J. H., Smith, C. A., Moore, H. D., Markham, J. A. Semen collection and spermatozoa characteristics in budgerigars (Melopsittacus undulates). Vet. Rec. 118, 397-399 (1986).
- Stelzer, G., Crosta, L., Bürkle, M., Krautwalt-Junghanns, M. E. Attempted semen collection using the massage technique and semen analysis in various psittacine species. J. Avian Med. Surg. 19 (1), 7-13 (2005).
