Summary
Este protocolo descreve esfregaços massagem, uma técnica não-invasiva manual para coleta de sêmen de aves e extração de DNA de esperma aviária usando um kit de extração comercial com modificações.
Abstract
Colheita de sémen pode ser útil para uma vasta gama de aplicações, incluindo estudos que envolvem a qualidade do esperma, esperma telômero dinâmica e epigenética. Pássaros são assuntos amplamente utilizados na investigação biológica e são ideais para estudos que envolvam amostras repetidas de esperma. No entanto, alguns recursos estão atualmente disponíveis para aqueles que desejam aprender a coletar e extrair DNA de esperma aviária. Aqui descrevemos esfregaços massagem, uma técnica manual suave, não-invasivo para a coleta de esperma aviária. Embora esta técnica é estabelecida na literatura, pode ser difícil de aprender com as descrições disponíveis. Nós também fornecemos informações para extrair DNA de sémen aviária usando um kit de extração comercial com modificações. Esfregaços massagem pode ser usada facilmente em qualquer pequeno para médio porte masculino ave condição reprodutiva. Após a coleta, o sêmen pode ser usado imediatamente para ensaios de motilidade ou congelado para extração de DNA, seguindo o protocolo descrito neste documento. Este protocolo de extração foi refinado por esperma aviária e tem sido utilizado com sucesso em amostras coletadas de diversas espécies de passeriformes (Passer domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanuse Turdus migratorius ) e um columbid (Columba livia).
Introduction
Pássaros são temas ideais para estudos que envolvem a qualidade do esperma e competição1, esperma telômero dinâmica2, epigenetics3e tópicos semelhantes, como são amplamente utilizados em pesquisas biológicas e esperma pode ser degustadas facilmente usando esfregaços massagem. Esfregaços massagem é uma técnica manual suave, não-invasivo para a coleta de sêmen de aves4,5,6. Amostras repetidas podem ser obtidas facilmente e sem ferramentas especiais são necessárias, tornando simples para executar no campo ou no laboratório. Apesar de esfregaços massagem tem sido usado por décadas, é difícil de aprender com os escritos descrições disponíveis. Esta publicação destina-se a reduzir o tempo e incerteza envolvidos em aprender massagem esfregaços.
Sêmen coletado de aves usando esfregaços massagem pode ser usado imediatamente para avaliação de motilidade4,7 ou inseminação artificial8, ou congelado para outros usos, tais como de imagem avançada e extração de DNA. Amostras de sêmen de aves da ordem Passeriformes são pequenas mas contenham esperma densamente. DNA é extraído usando um kit de extração comercial para manter a simplicidade, com modificações para superar as funções de protecção especializadas de esperma9. Após a extração, telômeros de esperma podem ser medidos usando qPCR10.
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Protocol
Este protocolo envolve assuntos animais vertebrados e foi aprovado pelo Comitê de uso (IACUC) da North Dakota State University e institucional Cuidado Animal.
1. coleta de sêmen de uma ave passeriforme da família usando esfregaços massagem
Nota: Esfregaços massagem é uma técnica de coleção de sêmen eficaz sobre aves reprodutivamente ativas somente, mas pode ser realizada com sucesso fora da época de reprodução em situações apropriadas em cativeiro. Atividade reprodutiva deve ser determinada para a espécie-alvo antes de utilizar a massagem esfregaços. Esta técnica pode ser usada em aves selvagens após captura ou em pássaros mantidos em cativeiro.
- Começando com um pássaro masculino, (em condição de reprodução) aderência do bander na mão não dominante, transferir o pássaro para a mão dominante com seu lado ventral, tocando a palma (Figura 1).
- Certifique-se de que a cabeça da ave é o mais próximo a borda lateral da palma da mão. Seguro levemente a cabeça e o corpo usando o mindinho, anel e os dedos do meio. Isso deixa do pássaro respiradouro e cauda exposta.
- Deixe as pernas do pássaro solto ou levemente comedido, usando a palma da mão.
Figura 1 : Aperto para massagem esfregaços. O pássaro está seguro levemente na mão dominante, com seu lado ventral, tocando a palma e cabeça garantidas pelo dedo mindinho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Coloque o dominante o dedo indicador e o polegar de cada lado da extremidade superior da cloaca e levemente belisca os dedos juntos, aplicando uma pressão muito leve em direção a cauda ( Figura 2). A cloaca será evert, expondo a mucosa cloacal (interior cor de rosa).
Nota: Se o pássaro não está atualmente produzindo sêmen, a protuberância cloacal pode ser pequena e a cloaca é difícil de evert. Com a experiência, é fácil diferenciar entre as cloacas de machos reprodutivamente ativas e inativas5,11.
Figura 2 : Dedo posição e protuberância cloacal. Evert cloaca aplicando pressão ligeira à extremidade superior (A). Em um ativo reprodutivamente masculino ave passeriforme da família, a protuberância cloacal é óbvia e empresa (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Com a mão não dominante, coloque a almofada do dedo no lado dorsal da base da cauda para estabilizar a mão e em seguida, coloque a ponta do polegar logo abaixo da cloaca de sempre.
Nota: Uma miniatura curta e Lisa é vantajosa para a realização de massagem cloacal e protege o pássaro de lesão acidental. - Mova o polegar não-dominante cranialmente e profunda em um movimento repetitivo com média pressão, ficando abaixo da cloaca. Continue até o pássaro ejacula. Dependendo do indivíduo, isto normalmente leva entre 1 e várias dezenas de cursos.
- Assim que o pássaro ejacula, colete o sêmen em um tubo de Microhematócrito. Repita a massagem esfregaços para obter múltiplos ejacula.
Nota: Passeriformes sémen é castanho claro e normalmente tem uma consistência um pouco grossa. Substâncias brancas ou escuras, expelidas da cloaca não estão sémen e podem contaminar a amostra de sêmen. A aparência de uma pequena quantidade de sangue na cloaca ou misturado com o sêmen é geralmente causado por muita pressão durante a massagem. - Para a extração de DNA, coloca o sêmen em um tubo de microcentrifugadora com 20 µ l de 1X PBS (pH 7,4). Nota: Sêmen armazenado em PBS 1x não é apropriado para a inseminação artificial, mas pode ser usado para a extração de DNA em uma data posterior quando armazenado a-80 ° C. O PBS pode ser temperatura ambiente ou refrigerados, mas deve estar no estado líquido, quando a amostra de sêmen é depositada.
- Confirme a presença de espermatozoides na amostra exibindo uma pequena quantidade da amostra diluída sob um microscópio composto (Figura 3).
- Armazene o sêmen diluído a-80 ° C até a extração.
2. extração de DNA do sêmen do pássaro
Nota: Este protocolo foi testado com vários jogos comerciais de extração de DNA, mas só faz sucesso quando usado com um DNA kit12. Etapas que são modificadas desde o protocolo do kit são indicadas por *.
- Preparar uma solução 1m de ditiotreitol (DTT) em água e misture usando um vortex.*
- Alíquota da solução de TDT e armazená-lo a-20 ° C até imediatamente antes da utilização. Cada amostra a ser extraído requer 10 µ l de solução de TDT * 1m
- Preparar um buffer contendo 20 mM Tris-Cl, pH 8.0; 20 mM EDTA; 200 mM NaCL; e 4% SDS. Cada amostra a ser extraído exige 90 µ l desta buffer.*
- Armazene o buffer em temperatura ambiente. Se ele se precipitou, aquecê-lo a 56 ° C, para dissolve.*
- Pré-aqueça uma incubadora contendo um balancim ou agitador a 65 ° c
- Imediatamente antes de iniciar a extração, misture a solução de TDT 10 µ l com 90 µ l de buffer preparado no passo 2.2 para cada amostra a ser extraído, por exemplo, 900 buffer de µ l além de 100 µ l TDT solução se extraindo 10 amostras. Esta mistura será chamada TDT-buffer.*
- Adicionar 70 µ l 1X PBS para a amostra de sêmen diluído inteiro e misture bem, usando um vortex.*
- Adicione 100 µ l tampão-DTT e solução de proteinase K 10 µ l de amostra. Vórtex por 20 segundos, então incubar na incubadora pré-aquecido por 1 hora em um balancim ou shaker.*
- Adicionar 200 µ l de buffer AL e 200 µ l EtOH fresco (100%) e vórtice para encerrar 20
- Transferir a amostra inteira para uma coluna de rotação e centrifugar 1 minuto em 6.000 x. g. descarte o tubo de coleta.
- Coloque a coluna em um tubo novo e juntar 500 µ l preparado tampão AW1. Centrifugar 1 minuto em 6.000 x. g. descarte o tubo de coleta.
- Coloque a coluna em um tubo novo e juntar 500 µ l preparado tampão AW2. Centrífuga para 1 minuto em 6.000 g. x descartar o escoamento e coloque a coluna de volta no tubo.
- Centrifugar a 3 minutos a 20.000 x g. descarte o tubo de coleta e colocar a coluna em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
- Pipeta 35 µ l de AE buffer directamente sobre a membrana da coluna e incubar a temperatura ambiente por 5 minutes.*
- Centrifugar 1 minuto a 14.000 x. g. descartar a coluna de rotação e armazenar amostras extraídas a-80 ° C.
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Representative Results
Massagem de esfregaços e DNA extração usando que o protocolo descrito foi realizado em várias espécies de passeriformes e um columbid (tabela 1). A presença de espermatozoides em amostras de sêmen recolhidas pela massagem esfregaços foi confirmada pela visualização de uma pequena quantidade das amostras diluídas sob um microscópio composto em ampliação de 400 X (Figura 3). Depois de extrair o DNA de amostras de sêmen coletados de pardais de casa usando o protocolo descrito aqui, oito amostras foram executadas na electroforese do gel com uma escada de DNA (três amostras podem ser vistas na Figura 4). Distintas bandas sem manchas foram vistas em todos os oito pistas da amostra, indicando sucesso isolamento de DNA de alta qualidade. Todos os outros exemplos extraídos usando este protocolo foram avaliados para a concentração de DNA usando um espectrofotômetro (ver tabela 1).
Figura 3: esperma dos dois pequenos passeriformes. Estas amostras foram obtidas por esfregaços massagem de uma casa finch (Haemorhous mexicanus), à esquerda e um pardal (Passer domesticus), certo, de esperma preso em Fargo, ND em 2016. As amostras foram cada uma diluída em 20 µ l PBS e vistas sob um microscópio composto em 1.000 X e ampliação de 400 X, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : DNA gel eletroforese de esperma DNA. Três amostras de DNA extraídas de sémen pardal executar em um gel com uma escada de DNA. Observe a presença de bandas distintas, indicando sucesso extração de DNA de alta qualidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Pardal (Passer domesticus) | Chipping sparrow (Spizella passerina) | House finch (Haemorhous mexicanus) | Tordo-americano (Turdus migratorius) | Rocha Pombo (Columba livia) | |
| Número de amostras coletadas | 156 | 3 | 2 | 2 | 2 |
| Número de amostras extraídas | 90 | 3 | 2 | 2 | 2 |
| Taxa de sucesso de coleta de sêmen | 98% | 75% | 100% | 67% | 67% |
Tabela 1: espécies e amostras recolhidas e extraído para data. No momento da publicação, as amostras foram processadas utilizando o protocolo descrito de 4 espécies de passeriformes e 1 columbid. Taxa de sucesso de coleta de sêmen refere-se a percentagem de cada um para que uma amostra foi obtida com êxito o número total de tentativa.
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Discussion
Nós descrevemos um método simples e confiável para coleta de sêmen de aves pequenas e médias em condição reprodutivamente ativa e extrair DNA de esperma aviária.
O protocolo de extração de DNA de sémen descrito é modificado a partir de um kit para manter a simplicidade, mas foi refinado para uso em sêmen aviária. Espermatozoides são resistentes à Lise por extração padrão produtos químicos9,13, e amostras de sêmen coletadas de passeriformes são bastante pequenas (tipicamente alguns microlitros). Estes fatores apresentam desafios que são superados com sucesso usando uma concentração adequada de TDT e incubando a 65 ° C. Usando esse método, consistentemente isolamos quantidades utilizáveis de ADN para qPCR análise do comprimento dos telômeros de esperma (normalmente entre 40-250 ng / µ l, dependendo do volume de ejaculação).
DTT anteriormente foi usado para extrair DNA de esperma aviária em combinação com uma reação de fenol/clorofórmio13. Reações de fenol/clorofórmio são eficazes para isolar o DNA, mas são mais demorados, são mais perigosas e necessitam de uma coifa. Uma notável limitação do nosso protocolo de extração é que só tem sido bem sucedida quando usado com uma marca e tipo do kit de extração, possivelmente devido o pequeno volume de amostra a começar. Amostras de sêmen muito pequeno (menos de 1 µ l) ou amostras com densidade baixa de esperma podem impedir o sucesso extração de DNA devido à insuficiente DNA presente na amostra, mas não encontramos este problema quando esfregaços massagem é realizada em aves, em condição de reprodução . Para evitar esse problema, esfregaços massagem pode ser repetida imediatamente para coletar vários ejacula que pode ser agrupada para extração.
Esfregaços massagem tem sido usada por décadas e em muitas espécies1,4,5,6,7,15,16,17e é um rápida e eficaz meio de coleta de sêmen de aves, em muitos casos. Para estudos envolvendo aves selvagens ou inexperientes que podem ser capturados, é mais eficaz do que os métodos de coleção que dependem de convencer um pássaro macho para copular com um item e depositar seu sêmen voluntariamente4. Outro método de coleta de sêmen é por dissecação dos testículos ou glomera seminal, mas isto não é uma opção para fins de conservação ou amostragem repetida4,14. A principal limitação de esfregaços massagem é a dificuldade em aprender a técnica sem demonstração. Descrições escritas são muitas vezes insuficientes para compreender e aprender a implementar o processo. Ilustrando a massagem esfregaços em detalhe, esperamos reduzir o tempo de aprendizagem e dificuldade para aqueles que desejam aprender a técnica.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Agradecemos Jose Noguera assistência precoce com massagem cloacal, e Jeffrey Kittilson para laboratório de apoio. Este trabalho foi apoiado por um prêmio de ND EPSCoR FAR0022429 a BJH. Custos de publicação foram generosamente apoiados pelo departamento de ciências biológicas da NDSU.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microhematocrit capillary tubes | Fisherbrand | 22-362566 | Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow. |
| Microcentrifuge tubes | Any | ||
| 1x PBS | Any | Used for storing semen samples prior to DNA extraction. | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | Any supplier can be used. |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1233508 | Any supplier can be used. |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | Any supplier can be used. |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | Any supplier can be used. |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us. |
References
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