Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

דוגמנות התנהגות אליפטית סרטן השחלות תאיים בתוך Microdevice הצפק 3D דינמי

Published: February 18, 2017 doi: 10.3791/55337
Automatic Translation
*1, *1, *2, 2, 3, 3, 4, 2, 1
1School of Biological Sciences, University of Hong Kong, 2Department of Mechanical Engineering, University of Hong Kong, 3Department of Medicine, University of Hong Kong, 4Department of Biomedical Sciences, Key Laboratory of Biochip Technology, Biotech and Health Centre, Shenzhen Research Institutes of City University of Hong Kong
* These authors contributed equally

Summary

כדי ללמוד התקדמות גידול שחלות במודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, spheroids רב-תאיים היו בתרבית microdevice תחת זרימת נוזל מדומה. מודל 3D דינמיקה זו מחק את סביבת intraperitoneal עם המרכיבים התאיים מכאניים שבו גרורות סרטן השחלות מתרחשות.

Abstract

סרטן השחלות מאופיין גרורות הצפק נרחבות, עם תחומי גידול נפוץ למצוא את מיימת הממאיר. זה קשור ותוצאות קליניות דלות וכיום חסר טיפול יעיל. הן בסביבה תלת-ממדי (3D) ואת הכוחות המכאניים דינאמיים הם גורמים חשובים מאוד מפל גרורה זה. עם זאת, תרביות תאים מסורתיות מצליחות לשחזר microenvironment גידול הטבעי הזה. לפיכך, in vivo מודלים-כמו שיכול לחקות את סביבת intraperitoneal הם בעלי חשיבות ברורה. במחקר זה, פלטפורמת microfluidic חדשה של הצפק הוקמה כדי לחקות את המצב של spheroids סרטן שחלות, בתוך חלל הבטן במהלך גרורות. spheroids השחלות סרטן שנוצר תחת מצב לא חסיד היה מתורבת ערוצי microfluidic מצופה תאים mesothelial הצפק נתון ללחץ גזירה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. לסיכום, מיקרופון הסרטן-mesothelium שחלות 3D דינמי זהפלטפורמת rofluidic יכולה לספק ידע חדש על ביולוגית סרטן בסיסית לשמש פלטפורמה להקרנה ופיתוח תרופות פוטנציאליות.

Introduction

סרטן השחלות הוא הסרטן הקטלני ביותר גניקולוגיות ומאופיין הפצת הצפק נפוצה להיווצרות מיימת ממאיר 1. גרורות הצפק ענפות זו מהווה אתגר קליני מהותי והיא קשורה עם תוצאות קליניות עניות. בניגוד לרוב קרצינומות מוצקים כי גרורות דרך הדם, סרטן השחלות מפיץ בעיקר בתוך חלל הצפק. תאים סרטניים קיימים אגרגטים רב-תאיים כמו / spheroids בתהליך של גרורות 2. העובדה שהתרבות ההשעיה יכול להעשיר גזע סרטניים בשחלות / תאים ייזום גידולים עוד עולה כי spheroids אלה עשויה להיות קשורה הן אגרסיביות הגידול ומשופרים chemoresistance 3, 4. ישנם הבדלים בתגובת סמים בין תרבויות 2D and 3D, אשר מן הסתם יש מנגנונים מולקולריים שונים 5.

_content "> האינטראקציה החיונית עם mesothelium בונה במייקרו-הסביבה העיקרית התקדמות גידול שחלות. תאי mesothelial אלה לשקר על תאי מטריקס (ECM), שבו פיברונקטין הוא מרכיב בכל מקום. קשר סיבתי בין הביטוי המוגבר של פיברונקטין תאים שמקורם mesothelial ו התקדמות גידול הוכח. פיברונקטין קיים בשפע מיימת ממאיר 6, 7. תאי סרטן השחלות יכול גם לגרום הפרשת פיברונקטין מתאי mesothelial כדי לקדם גרורות סרטן שחלות בשלב מוקדם 8.

מתעוררים הראיות עולה כי גירויים מכניים, כולל מאמץ הגזירה, יכול לווסת מורפולוגיה תאים, ביטוי גנים, ולפיכך, פנוטיפים של תאים סרטניים 9, 10, 11. כמו מיימת ממאיר לפתח ולצבור במהלך tumor התקדמות, תאים סרטניים בשחלות נחשפים זרימת נוזל ואת לחץ הגזירה שהתקבל. מספר הקבוצות, שלנו כלל, מראה את ההשפעה של לחץ גזירה על התקדמות סרטן שחלות, כולל שינויי cytoskeleton, אפיתל-to-mesenchymal מעברים, וסרטן stemness 12, 13, 14, 15. לפיכך, microenvironment רלוונטי מבחינה פיזיולוגית חשוב לחקירת גרורות הצפק גידול. עם זאת, נוכחית במבחנת מערכות תרבות הידרודינמית יש מגבלות על מחקת ושליטת מאמץ גזירה קבועה, נמוך, רלוונטי מבחינה פיזיולוגית 16, 17, 18, 19. קונבנציונלי במבחנת גישות התמקדות משני הסביבה הסלולר או מכנה עדיין מוגבליםמחק את המורכבות של המיקרו-סביבת intraperitoneal עם הרלוונטיות פיסיולוגיות נכונות.

כאן, כדי להנדס מודל חדש של הצפק כדי להתגבר על המגבלות של אסטרטגיות קונבנציונליות כדי לקדם את המחקר של תא intraperitoneal בהתפשטות גרורה סרטני, פלטפורמת microfluidic המבוסס 3D עם זרימת נוזל נשלטה תוכנן. במודל זה, spheroids סרטן שחלות היו שיתוף תרבותי עם תאי mesothelial הצפק אדם מן המעלה ראשונים בתחום השבב microfluidic תחת זרם fluidic הרציף (איור 1 א). תאי mesothelial היו מצופים על פיברונקטין. spheroids לא חסיד סרטן השחלות היו זורעים לתוך ערוצי microfluidic עם המדיום זרימה רציפה perfused ידי משאבת מזרק. הן בסביבת 3D ואת הכוחות המכאניים דינאמיים הם גורמים חשובים מאוד של המפל גרורתי. פלטפורמה זו תוכל לשמש חוקר את המיקרו-סביבת intraperitoneal מבחינת cel מורכבlular ואינטראקציות שיתוף תרבות, כמו גם בכל הנוגע לרמזים מכאניים דינמיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תכנון ייצור מכשיר microfluidic

  1. עיצוב המאסטר Microfluidic
    1. עיצוב לצייר את דפוס ערוץ microfluidic עם כל תוכנת תכנון בעזרת מחשב (CAD).
      הערה: בדרך כלל, ציור CAD ניתן לשלוח לחברה photomask לייצר את photomask. עיצוב microfluidic מורכב משלושה ערוצים מקבילים זהים, כל אחד עם הממדים הבאים: 4 מ"מ × 25 מ"מ × 250 מיקרומטר (רוחב × אורך × גובה) ולהגדיר 2 מ"מ זה מזה. בשני קצות הערוץ נועדו עם 127 ° זוויות כדי להקל כניסה ויציאה נוזליות (איור 1 ב). הערוץ בשימוש בפרוטוקול זה דווח בפרסום קודם 13.
    2. שטפו את פרוסות סיליקון עם ultrasonication (500 W / 42 kHz) אצטון, isopropanol, ומים deionized במשך 15 דקות כל אחד. לייבש את פרוסות סיליקון עם גז חנקן דחוס. מחממים את פרוסות סיליקון על פלטה חשמלית ב 250 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי לגמרי יבשזה.
    3. ספין-מעיל שכבה של SU-8 2075 photoresist (125 מיקרומטר עבה) על גבי פרוסות סיליקון סיליקון עם מהירות ספינינג של 1,800 סל"ד. אופים את פרוסות סיליקון מצופה photoresist ישירות על פלטה חשמלית על 65 מעלות צלזיוס ולאחר מכן ב 95 מעלות צלזיוס, כדי להסיר ממס עודף עבור 5 ו -25 דקות, בהתאמה (על פי הוראות המוצר SU-8).
    4. חזור על שלב 3 ו ספין המעיל שכבה נוספת של photoresist SU-8 2075 כדי לקבל עובי הסופי של 250 מיקרומטר. אופים את פרוסות סיליקון מצופה photoresist ישירות על פלטה חשמלית על 65 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות ולאחר מכן ב 95 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאט לקרר את פרוסות לטמפרטורת החדר. אין לקרר עם אוויר דחוס.
    5. יישר וקבע photomask ישירות על גבי פרוסות סיליקון. תחשוף אותה לאור UV במשך 20 שניות כדי crosslink התבנית.
    6. אופים את פרוסות סיליקון עם photoresist על 65 מעלות צלזיוס ו -95 מעלות צלזיוס על פלטה חמה עבור 5 דקות ו -12, בהתאמה, כדי להסיר את הממס פילמור (על פי הוראות המוצר SU-8). לאחר מכן, לקרר את רקיקטמפרטורת חדר.
    7. הסר את photoresist הלא crosslinked ידי טבילת רקיק מפתח SU-8 עבור 25 דקות. שוטפים את פרוסות סיליקון עם isopropanol ולייבשו עם אוויר בלחץ.
      הערה: אם פתרון חלבי נצפה כאשר שטיפה עם isopropanol, המציין פיתוח שלם, לטבול את הפרוסות בחזרה מפתח SU-8 במשך זמן פיתוח ארוך.
    8. מניח את הפרוסות על צלחת חמה ב 180 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי לרפא את התבנית מן הסדקים פוטנציאליים. כבה את צלחת חמה לאט להתקרר רקיק לטמפרטורת החדר על ידי השארת אותו על צלחת חמה.
    9. הוסף כמה טיפות של trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane בכובע בקבוקון. לשים את כובע הבקבוקון בריק הייבוש. מניחים את פרוסות ליד כובע הבקבוקון silanize רקיק במשך 10 דקות.
  2. ייצור שבב PDMS
    1. עוטף את הפרוסות עם רדיד אלומיניום על מנת ליצור מחזיק.
    2. מערבבים את polydimethylsiloxane (PDMS) בסיס וסוכן ריפוי בכל 10: יחס מסה 1עם מיקסר צנטריפוגלי תחת פונקצית ערבוב דגה. יוצקים את התערובת PDMS לאט על גבי פרוסות סיליקון עד לגובה של כ 5 מ"מ. דג את PDMS תחת ואקום במשך 40 דקות. לרפא את PDMS בתנור על 65 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
    3. בזהירות לקלף את לוח PDMS את המאסטר וקוצצים את PDMS לאורך הערוצים עד שהוא יהיה בגודל של זכוכית שקופית. פונץ 'את PDMS עם ביופסיה 1 מ"מ כדי ליצור את פתחי הכניסה שקעים של המכשיר.
    4. נקו את המשטח PDMS עם קלטת אוויר דבק בלחץ כדי להסיר אבק ופסולת PDMS.
    5. מניח את לוח PDMS, כשהצד הערוץ כלפי מעלה, לתוך שואב פלזמה. מקום שקופית זכוכית נקיה לתוך שואב הפלזמה לצד לוח PDMS.
    6. פנק את PDMS וזכוכית שקף מתחת פלזמת אוויר ברמת RF גבוהה עבור 1 דקות. לחייב את PDMS לשקופית זכוכית ליצור קשר קוולנטי בלתי הפיך.
    7. מניח את שבב PDMS על פלטה חשמלית ב 150 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי לשפר את הכח המליט וכדי להחזיר את hydrophobicity של PDMS לפני השימוש.

2. מתזמנים את שבב microfluidic עם תאי mesothelial ראשוניים של הצפק (HPMCs)

  1. ציפוי פיברונקטין של ערוצי microfluidic
    1. לעקר את ערוץ microfluidic עם 30 μL של 75% אתנול. הסר את אתנול ולשטוף פעמיים עם 30 μL של בופר פוספט מעוקר (PBS) באמצעות קצה פיפטה. ביסודיות לשאוב PBS באפיקים.
      הערה: כדי למזער זיהום, תרבות תא microfluidic צריכה להתנהל בזהירות בתנאי aseptic מלא באמצעות השימוש במנדף זרימה למינרית.
    2. כן פתרון פיברונקטין 10 מיקרוגרם / מיליליטר סרום ללא M199: MCDB105 (1: 1) בינוני. פיפטה הפתרון מעלה ומטה, עם תשומת לב מיוחדת, כדי למנוע היווצרות בועה. לא מערבולת.
    3. לאט להתמלא כל ערוץ עם 30 μL של פתרון פיברונקטין. חותם את הערוצים עם קלטת דגירת שבב הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    2. > מתזמן HPMCs לתוך ערוצי microfluidic
    1. HPMCs תרבות ב 10% בסרום שור העובר בינוני תרבות (FBS) (M199: MCDB105 השלימו עם 10% FBS ו 100 U / mL פניצילין / סטרפטומיצין) מתחת לגיל 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס עד מפגש 80%.
    2. שוטפים את HPMCs עם 3 מ"ל של PBS ו trypsinize עם 2 מ"ל של טריפסין 0.05% / 0.01% EDTA (TE) פתרון עבור 30 s. לנטרל עם 4 מ"ל של מדיום תרבות 10% FBS ו לסובב את התאים XG ב 1000 למשך 5 דקות.
    3. Resuspend את HPMCs ב 2 מ"ל של מדיום תרבות FBS 10%. ספירת תאים עם hemocytometer ולהתאים את הריכוז התא 3.5 × 10 6 / מ"ל.
    4. מומלץ לחמם את שבב microfluidic מצופה פיברונקטין בתוך 37 ° C חממה במשך 5 דקות לפני השימוש. לחלוטין לשאוב את הפתרון פיברונקטין.
    5. לאט פיפטה 30 μL של ההשעיה HPMC לתוך כל ערוץ. חותם את הערוצים עם קלטת ומקום ההתקנים CO 2 באינקובטור במשך הלילה.

"Jove_title"> 3. היווצרות הסרטן אליפטית שחלות ו Co-תרבות

  1. היווצרות אליפטית סרטן השחלות
    1. שמירה על קו תא סרטן השחלות אדם אפיתל Skov -3 במדיום תרבות 5% FBS (M199: MCDB105 עם FBS 5% ו 100 U / mL פניצילין / סטרפטומיצין) מתחת לגיל 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס לפני הניסויים.
    2. ממיסים agarose 0.5% במים מעוקרים ידי הרתחה. לוותר 50 μL של פתרון agarose לבאר כל 96-גם הצלחות. השאירו את הצלחות בשכונה במשך 20 דקות כדי לאפשר agarose כדי לחזק; agarose הקרושה ציפוי הבארות יכולות למנוע הידבקות תא ומציין כי הצלחות מוכנות לשימוש.
    3. שוטפים את התאים Skov-3 עם 3 מ"ל של PBS. Trypsinize עם 2 מ"ל של תמיסת TE במשך 3 דקות. לנטרל עם 4 מ"ל של מדיום תרבות FBS 5% ו לסובב את התאים XG ב 1000 למשך 5 דקות.
    4. לספור את מספר הסלולרי Skov-3 עם hemocytometer ו resuspend התאים במדיום תרבות 5% FBS בצפיפות של 5,000 תאים / מ"ל. Transfer 200 μL של השעיה התא לתוך כל agarose מצופה היטב בתרבות מתחת לגיל 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
  2. טעינת אליפטית סרטן
    1. העבר spheroids סרטן לצינור צנטריפוגות 50 מ"ל מראש הרטובות עם 1 מ"ל של מדיום סרום ללא ספין למטה ב 750 XG במשך 5 דקות.
      הערה: Pre-רטוב טיפי פיפטה וצינורות צנטריפוגות יכולים למנוע מצורף אליפטית רצוי על הצינורות צנטריפוגות.
    2. הכן 2.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של diacetate 5 chloromethylfluorescein (CMFDA) פתרון M199 סרום ללא: בינוני MCDB105. spheroids סרטן Resuspend ב 1 מ"ל של תמיסת CMFDA לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. צנטריפוגה ב 750 XG במשך 5 דקות.
    3. שוטפים את spheroids סרטן עם 2 מ"ל של מדיום צנטריפוגות סרום ללא ב 750 XG במשך 5 דקות. חזור על פעולה זו פעמיים כדי להסיר את צבע פלואורסצנטי הנותרים מהמדיום.
      הערה: ניתן להיעזר אות ניאון spheroids במשך יותר מ -96 שעות.
    4. Resuspend הסרטןspheroids ב סרום ללא M199: בינוני MCDB105 ולספור את מספר אליפטית עם hemocytometer. התאם את הריכוז 2,000 spheroids / מ"ל ​​עם סרום ללא בינוני.
    5. לפני אליפטית הטעינה, לאט להזריק 100 μL של סרום ללא M199: בינוני MCDB105 כדי לשטוף את התאים mesothelial שאינם דבק בתוך הערוצים.
      הערה: זריקה מהירה, שאיפה, או היווצרות בועה תוביל את ניתוק monolayer mesothelial.
    6. טען 30 μL של השעיה אליפטית ניאון שכותרתו לתוך כל ערוץ. מניחים את שבב microfluidic לתוך CO 2 באינקובטור.
  3. הרכבת פלטפורמת זלוף ושיתוף תרבות
    1. צרף מזרק עמוס M199 טרי, סרום ללא: בינוני MCDB105 לצינור 1 מ-ארוך.
    2. יש להכניס את המזרק על משאבת מזרק ולאבטח את הבוכנה והגוף של מזרק. התקן את משאבת מזרק במצב מאוזן באותו גובה כמו שבב microfluidic בתוך האינקובטור.
      NOTE: המספר והגודל של מזרקים תלויים במספר הערוצים בשימוש ואת תקופת הניסוי.
    3. במהירות להחדיר את הצינורית השלמה עם מדיום ידי לחיצה וחזקה של הכפתור קדימה מהר עד הבינוני גולש בצינור.
    4. הפעל את הזריקה בשיעור הזרימה הרצויה. להעריך את מאמץ הגזירה הקיר באמצעות המשוואה הבאה:
      משוואה 1
      שם τ מייצג את הלחץ הקיר גזירה בתוך החדר, Ǫ = קצב הזרימה, μ = צמיגות (0.01 גרם CMS -1); h = זרימת גובה קאמרית, ורוחב תא w = זרימה.
    5. חבר את הצינורות אל המפרצון של הערוץ. מניחים את צינורות היניקה עודף בחממה על מנת להבטיח כי המדיום הוא התחמם מוזרק לפני לתוך הערוצים. כדי להקל על הקשר בין הצינורות והערוץ, ניתן לבחור למחברים מתאימים. הערה: היזהרו לא להכניס שום בועות אל syrinGE, צינורות, וקשרים.
    6. חבר יציאה של ערוץ אל צינור חרוטי 50 מ"ל כדי לאסוף את המדיום יצוא עם צינור פלט קצר.
      ההערה: מערכת שיתוף התרבות הדינמית המלאה מוצגת באיור 1D.

תצפית 4. HPMCs וסרטן Spheroids לאחר זלוף

  1. שימו לב HPMCs ו spheroids סרטן עם שדה-בהיר או מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולצלם לאחר 1 שעות של זלוף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השימוש בפרוטוקול זה, פלטפורמת microfluidic הוקמה מודל spheroids סרטן השחלות עם תאי mesothelial בתנאים הידרודינמית. תאים mesothelial הצפק אדם מן המעלה הראשונה היו בתרבית בתוך microdevice במשך 16 שעות ולאחר שנצפה תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. כפי שניתן לראות בתרשים 2A, בתחתית הערוץ היה מכוסה בהצלחה עם בשכבה של HPMCs. חשוב לציין כי היווצרות בועה במהלך פיברונקטין או דפוסים HPMC יוביל לכישלון ציפוי ערוץ. באמצעות התרבות ההשעיה לא חסיד, spheroids רב-תאיים בקטרים ​​של כ -100 מיקרומטר, אשר הדומות בגודלן לאלה שנמצאו מיימת של החולים, נוצרו ומסומן עם צבע פלואורסצנטי ירוק, CMFDA. הספרואידים הועברו אז לערוצי microfluidic מצופה HPMC ונשארו השעיה. מורפולוגיה Cell נצפו תחת מיקרוסקופ ותמונות נתפסו (איור 2B). הספרואידים סרטן ניאון שכותרתו ניתן להבדיל בקלות מתאי mesothelial תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2 ג).

איור 1
איור 1. הדינמי 3D הצפק Microdevice עבור דוגמנות סרטן השחלות תאיות אליפטית התנהגויות. (א) תרשים סכמטי של שבב microfluidic המשמש שיתוף תרבות spheroids סרטן השחלות עם HPMCs בתנאי זרימה. (ב) תרשים סכמטי המציג את העיצוב של ערוצי microfluidic. (ג) צילום של שבב microfluidic להשתמש בפרוטוקול, עם הערוצים שלה רווי פתרון לצבוע להדמיה ברורה. בר = 1 ס"מ. (ד) תמונה בה נראית הגדרת הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר of דמות זו.

איור 2
איור 2. תמונות של דגם משותף התרבות דינמי תא סרטן השחלות אליפטית-mesothelial. (א) תמונה של monolayer HPMC גדלי ערוץ microfluidic. (ב) תמונות של spheroids סרטן השחלות בערוץ microfluidic מצופה תאים mesothelial הצפק תחת מיקרוסקופ לעומת שלב (פאנל משמאל) או (ג) מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ירוק, CMFDA; פאנל מימין). בר = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

assay זה מציע מודל גמיש מבחינה פיזיולוגית רלוונטי שיכול להיות משולב עם מבחני ביוכימיים מבוססי תאים שונים, כולל, אך לא רק, מבחני הידבקות, מבחני אישור mesothelial, והקרנת התרופה. זה יכול להיות מיושם על הערכה של ההשפעה של microenvironment intraperitoneal על התקדמות סרטן. עם זאת, מספר תנאי ניסוי עלולים צריכים להיות מותאמים, תלוי המטרות של הפרויקט (למשל, מספר HPMCs ו spheroids הסרטן זורע לכל ערוץ, הפעם שיתוף התרבות, וכו '). סוגי תאים אחרים במיקרו-סביבה של intraperitoneal, כגון פיברובלסטים, תאי אנדותל, או תאי מערכת החיסון, ניתן לכלול גם במערכת כדי ללמוד את יחסי הגומלין מהותי בין spheroids סרטן השחלות התאים הסמוכים. רכיבים אחרים ECM, כגון laminin, vitronectin, או קולגן, יכול לשמש גם. אחת החולשות של פרוטוקול זה כי ייתכן שיהיה צורך להתחשב בו הוא כי, בעודצימוד של replenishing מזין ומתח גזירה מזכיר כי ראו in vivo, אין שליטה נפרדת של replenishing מזין ומתח גזירת המערכת הנוכחית שלנו. יתר על כן, טכניקות כגון trypsinization על שבב משולב עם מיון תא מופעל קרינה תהיינה צורך בנפרד לאסוף תאי סרטן שחלות HPMCs עבור מחקרים מולקולריים נוספים על סוגים שונים של תאים.

טכניקה זו מציגה מספר יתרונות בהשוואת גישות מסורתיות. ראשית, 3D שיתוף תרבות טובה יותר מחקה את התקשורת in vivo אינטר בין תאים סרטניים בשחלות ותאי mesothelial. שנית, תאים בתרבית תחת זרם fluidic אבל הם לא במצב סטטי, יצירת תגובה תאית כי הוא נציג פוטנציאל של המצב vivo 12, 13. יתר על כן, זרימת הנוזל ניתן לשלוט באופן מדויק, מחקה את hydrodynamiתנאי ג בשלבים שונים של התקדמות הגידול.

לסיכום, מודל שיתוף תרבות הסרטן-mesothelium שחלות 3D הדינמי המובא כאן מספק מסגרת גמישה להתנהגות גידול דוגמנות בתוך חלל הבטן. בעזרת מודל זה, את האינטראקציה בין תאים סרטניים ותאים mesothelial תחת תנאי הידרודינמית דינמי ניתן לנתח באופן מקיף. זה יכול מאוד לקדם את הבנתנו את המנגנונים של התקדמות גרורתי ועלול גם להקל התפתחות טיפולית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי הונג קונג מענק מחקר המועצה (מענקים 17,122,014, C1013-15G, 719813E, ו 17,304,514). AST וונג הוא חתן מלגת המחקר הבכיר Croucher.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafer University wafer #1196 100 mm
SU-8 2075 photoresist  Microchem
SU-8 developer  Microchem 108-65-6
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane Sigma 448931
Sylgard 184 Dow Corning 1673921 Polydimethylsiloxane (PDMS) + curing agent kit
Biopsy punch  Miltex 33-31AA 1 mm diameter
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-002
Polyethylene tubing SCI BB31695-PE/5 0.86 mm (inner diameter)
Syringe Terumo
Syringe pump Longer precision pump   LSP01-2A
Medium 199 Invitrogen 31100-035 Add 2.2 g/L sodium bicarbonate
MCDB 105 Medium Sigma M6395
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH30068.02
Penicillin/streptomycin  Invitrogen 15070-063
Trypsin EDTA solution  Gibco 25300-054 0.05% Trypsin - 0.01% EDTA, phenol red
Fibronectin human BD 354008
Agarose  Invitrogen 15510-027
5-chloromethylfluorescein diacetate Life technologies C7025 Green CMFDA
CO2 incubator SANYO MCO-18AIC
Centrifuge Hitachi CT15RE
Fluorescent microscope Nikon Model: 80i or ECLIPSE Ti; software: SPOT
SKOV-3  Gift from Dr. N Auersperg (University of British Columbia)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jemal, A., et al. Global cancer statistics. CA: Cancer J. Clin. 61, 69-90 (2011).
  2. Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
  3. Chau, W. K., Ip, C. K., Mak, A. S., Lai, H. C., Wong, A. S. c-Kit mediates chemoresistance and tumor-initiating capacity of ovarian cancer cells through activation of Wnt/beta-catenin-ATP-binding cassette G2 signaling. Oncogene. 32, 2767-2781 (2013).
  4. Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).
  5. Tang, M. K. S., Zhou, H. Y., Yam, J. W. P., Wong, A. S. T. c-Met overexpression contributes to the acquired apoptotic resistance of nonadherent ovarian cancer cells through a cross talk mediated by phosphatidylinositol 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase 1/2. Neoplasia. 12, 128-144 (2010).
  6. Ksiazek, K., et al. Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin. Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).
  7. Hafter, R., Klaubert, W., Gollwitzer, R., Vonhugo, R., Graeff, H. Crosslinked Fibrin Derivatives and Fibronectin in Ascitic Fluid from Patients with Ovarian-Cancer Compared to Ascitic Fluid in Liver-Cirrhosis. Thromb Res. 35, 53-64 (1984).
  8. Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
  9. Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307, 58-62 (2005).
  10. Chang, S. F., et al. Tumor cell cycle arrest induced by shear stress: Roles of integrins and Smad. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 3927-3932 (2008).
  11. Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator. Trends Cell Biol. 17, 44-50 (2007).
  12. Rizvi, I., et al. Flow induces epithelial-mesenchymal transition, cellular heterogeneity and biomarker modulation in 3D ovarian cancer nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, E1974-E1983 (2013).
  13. Ip, C. K., et al. Stemness and chemoresistance in epithelial ovarian carcinoma cells under shear stress. Sci. Rep. 6, 26788 (2016).
  14. Avraham-Chakim, L., et al. Fluid-flow induced wall shear stress and epithelial ovarian cancer peritoneal spreading. PloS one. 8, e60965 (2013).
  15. Burkhalter, R. J., et al. Peritoneal mechanobiology and metastatic success in epithelial ovarian cancer. Faseb Journal. 26, (2012).
  16. Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  17. Botta, G. P., Manley, P., Miller, S., Lelkes, P. I. Real-time assessment of three-dimensional cell aggregation in rotating wall vessel bioreactors in vitro. Nat. Protoc. 1, 2116-2127 (2006).
  18. Ismadi, M. Z., et al. Flow characterization of a spinner flask for induced pluripotent stem cell culture application. PloS one. 9, e106493 (2014).
  19. Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PloS one. 9. 9, e89966 (2014).

Tags

Bioengineering גיליון 120 סרטן שחלות מיקרופלואידיקה מאמץ גזירה תאי mesothelial הצפק spheroids רב-תאי תרבות 3D שיתוף תרבות
דוגמנות התנהגות אליפטית סרטן השחלות תאיים בתוך Microdevice הצפק 3D דינמי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, S. S., Ip, C. K. M., Tang, M. Y. … More

Li, S. S., Ip, C. K. M., Tang, M. Y. H., Sy, S. K. H., Yung, S., Chan, T. M., Yang, M., Shum, H. C., Wong, A. S. T. Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice. J. Vis. Exp. (120), e55337, doi:10.3791/55337 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter