Summary
एक physiologically प्रासंगिक मॉडल में डिम्बग्रंथि ट्यूमर प्रगति का अध्ययन करने के लिए, बहुकोशिकीय spheroids नकली द्रव का प्रवाह के तहत एक microdevice में सुसंस्कृत थे। इस गतिशील 3 डी मॉडल सेलुलर और यांत्रिक घटकों जहां डिम्बग्रंथि के कैंसर मेटास्टेसिस होता है के साथ intraperitoneal पर्यावरण emulates।
Abstract
डिम्बग्रंथि के कैंसर ट्यूमर क्षेत्रों में आमतौर पर घातक जलोदर में पाया के साथ व्यापक पेरिटोनियल मेटास्टेसिस के द्वारा होती है। इस गरीब नैदानिक परिणामों के साथ जुड़ा हुआ है और वर्तमान में प्रभावी उपचार का अभाव है। दोनों तीन आयामी (3 डी) पर्यावरण और गतिशील यांत्रिक बलों इस मेटास्टेटिक झरना में बहुत ही महत्वपूर्ण कारक हैं। हालांकि, पारंपरिक सेल संस्कृतियों इस प्राकृतिक ट्यूमर microenvironment पुनरावृत्ति करने में विफल है। इस प्रकार, इन विवो तरह के मॉडल है कि intraperitoneal पर्यावरण अनुकरण कर सकते हैं स्पष्ट महत्व के हैं। इस अध्ययन में, पेरिटोनियम की एक नई microfluidic मंच मेटास्टेसिस के दौरान पेरिटोनियल गुहा में डिम्बग्रंथि के कैंसर spheroids की स्थिति नकल करने के लिए स्थापित किया गया था। डिम्बग्रंथि के कैंसर के लिए एक गैर पक्षपाती शर्त के तहत उत्पन्न spheroids पेरिटोनियल mesothelial physiologically प्रासंगिक कतरनी तनाव के अधीन कोशिकाओं के साथ लेपित microfluidic चैनलों में सुसंस्कृत थे। सारांश में, इस गतिशील 3 डी डिम्बग्रंथि कैंसर mesothelium microfluidic मंच बुनियादी कैंसर जीव विज्ञान पर नए ज्ञान प्रदान करते हैं और संभावित दवा स्क्रीनिंग और विकास के लिए एक मंच के रूप में सेवा कर सकते हैं।
Introduction
डिम्बग्रंथि के कैंसर सबसे घातक स्त्री रोग कैंसर है और बड़े पैमाने पर पेरिटोनियल प्रसार और घातक जलोदर 1 के गठन की विशेषता है। इस व्यापक पेरिटोनियल मेटास्टेसिस एक प्रमुख नैदानिक चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है और गरीब नैदानिक परिणामों के साथ जुड़ा हुआ है। सबसे ठोस कार्सिनोमा है कि रक्त के माध्यम से metastasize के विपरीत, या गर्भाशय के कैंसर मुख्य रूप से पेरिटोनियल गुहा के भीतर प्रसार करता है। ट्यूमर कोशिकाओं मेटास्टेसिस 2 की प्रक्रिया के दौरान के रूप में बहुकोशिकीय समुच्चय / spheroids मौजूद हैं। तथ्य यह है कि निलंबन संस्कृति या गर्भाशय के कैंसर स्टेम / ट्यूमर की शुरुआत कोशिकाओं को समृद्ध कर सकते आगे चलता है कि इन दोनों spheroids ट्यूमर आक्रामकता के साथ जुड़ा हो सकता है और बढ़ाया chemoresistance 3, 4। वहाँ 2 डी और 3 डी संस्कृतियों, जो संभवतः अलग आणविक तंत्र 5 के बीच दवा जवाब में मतभेद हैं।
_content "> mesothelium के साथ आवश्यक बातचीत डिम्बग्रंथि ट्यूमर प्रगति के लिए प्राथमिक microenvironment निर्माण करती है। ये mesothelial कोशिकाओं एक बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम), जहां फ़ाइब्रोनेक्टिन एक सर्वव्यापी घटक है पर झूठ बोलते हैं। mesothelial सेल व्युत्पन्न फ़ाइब्रोनेक्टिन की वृद्धि की अभिव्यक्ति के बीच एक कड़ी ट्यूमर प्रगति दिखाया गया है। fibronectin घातक जलोदर 6, 7 में बहुतायत से मौजूद है। डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं को भी आदेश जल्दी डिम्बग्रंथि के कैंसर मेटास्टेसिस 8 बढ़ावा देने के लिए mesothelial कोशिकाओं से फ़ाइब्रोनेक्टिन के स्राव को प्रेरित करने में सक्षम हैं।सबूत उभरते पता चलता है कि कतरनी तनाव सहित यांत्रिक उत्तेजनाओं, सेल आकृति विज्ञान, जीन अभिव्यक्ति मिलाना कर सकते हैं, और इस प्रकार, ट्यूमर कोशिकाओं 9, 10, 11 के phenotypes। घातक जलोदर के रूप में विकास और टी के दौरान जमाumor प्रगति, डिम्बग्रंथि ट्यूमर कोशिकाओं द्रव का प्रवाह और जिसके परिणामस्वरूप कतरनी तनाव को उजागर कर रहे हैं। समूहों की एक संख्या है, हमारा भी शामिल है, डिम्बग्रंथि के कैंसर की प्रगति पर कतरनी तनाव के प्रभाव को दिखाया गया है, cytoskeleton संशोधनों, उपकला करने वाली mesenchymal संक्रमण, कैंसर और stemness 12, 13, 14, 15 सहित। इस प्रकार, एक physiologically प्रासंगिक microenvironment ट्यूमर पेरिटोनियल मेटास्टेसिस की जांच के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, मौजूदा इन विट्रो hydrodynamic संस्कृति प्रणालियों नकल उतार और एक स्थिर, कम, physiologically प्रासंगिक कतरनी तनाव 16, 17, 18, 19 को नियंत्रित करने पर सीमाएं हैं। परंपरागत इन विट्रो पर या तो सेलुलर या यांत्रिक पर्यावरण ध्यान केंद्रित अभी भी सीमित कर रहे हैं दृष्टिकोणउचित शारीरिक प्रासंगिकता के साथ intraperitoneal microenvironment की जटिलता नकल उतार।
इधर, आदेश पेरिटोनियम का एक नया मॉडल इंजीनियर को पारंपरिक रणनीतियों की सीमाओं को पार करने के लिए और कैंसर मेटास्टेसिस में intraperitoneal डिब्बे का अध्ययन करने के लिए अग्रिम में, नियंत्रित द्रव का प्रवाह के साथ एक 3 डी microfluidic आधारित प्लेटफॉर्म तैयार किया गया था। इस मॉडल में, या गर्भाशय के कैंसर spheroids निरंतर fluidic प्रवाह (चित्रा 1 ए) के तहत microfluidic चिप्स में प्राथमिक मानव पेरिटोनियल mesothelial कोशिकाओं के साथ सह-सुसंस्कृत थे। mesothelial कोशिकाओं फ़ाइब्रोनेक्टिन पर चढ़ाया गया। गैर पक्षपाती डिम्बग्रंथि के कैंसर spheroids सतत प्रवाह मध्यम एक सिरिंज पंप से भरकर रखा के साथ microfluidic चैनलों में वरीयता प्राप्त थे। दोनों 3 डी वातावरण और गतिशील यांत्रिक बलों मेटास्टेटिक झरना का बहुत महत्वपूर्ण कारक हैं। इस मंच जटिल सेल के मामले में intraperitoneal microenvironment की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकताlular और सह संस्कृति बातचीत, साथ ही गतिशील यांत्रिक संकेतों के संबंध में।
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Protocol
1. Microfluidic डिवाइस डिजाइन और निर्माण
- Microfluidic मास्टर डिजाइन
- डिजाइन और किसी भी कंप्यूटर एडेड डिजाइन (सीएडी) सॉफ्टवेयर के साथ microfluidic चैनल पैटर्न आकर्षित।
नोट: आम तौर पर, सीएडी ड्राइंग एक photomask कंपनी के लिए भेजा जा सकता है photomask उत्पादन करने के लिए। microfluidic डिजाइन तीन समान समानांतर चैनलों, निम्नलिखित आयामों के साथ प्रत्येक के होते हैं: 4 × मिमी 25 मिमी × 250 माइक्रोन (चौड़ाई × ऊंचाई × लंबाई) और 2 मिमी के अलावा निर्धारित किया है। दोनों सिरों चैनल तरल प्रवेश और निकास (चित्रा 1 बी) की सुविधा के लिए 127 डिग्री कोण के साथ डिजाइन किए गए थे। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल चैनल पिछले एक प्रकाशन 13 में बताया गया था। - 15 मिनट प्रत्येक के लिए एसीटोन, isopropanol में ultrasonication (500 W / 42 किलोहर्ट्ज़), और विआयनीकृत पानी के साथ सिलिकॉन वेफर धो लें। दबाव नाइट्रोजन गैस के साथ वेफर सूखी। 15 मिनट के पूरी तरह से सूखे के लिए 250 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर सिलिकॉन वेफर गरम करेंयह।
- स्पिन कोट SU-8 2075 photoresist (125 माइक्रोन मोटी) 1,800 आरपीएम की एक कताई गति के साथ सिलिकॉन वेफर पर की एक परत। 65 डिग्री सेल्सियस पर और फिर 95 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर सीधे photoresist लेपित वेफर सेंकना, अतिरिक्त विलायक दूर करने के लिए क्रमश: 5 और 25 मिनट के लिए, (SU-8 उत्पाद मैनुअल के अनुसार)।
- चरण 3 दोहराएँ और स्पिन कोट SU-8 2075 photoresist की एक और परत 250 माइक्रोन के अंतिम मोटाई प्राप्त करने के लिए। photoresist लेपित 7 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर सीधे वेफर सेंकना और फिर 30 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर। धीरे-धीरे कमरे के तापमान को शांत वेफर। दबाव हवा के साथ शांत नहीं करते हैं।
- संरेखित करें और वेफर के शीर्ष पर सीधे photomask डाल दिया। 20 S के लिए यूवी प्रकाश को बेनकाब पैटर्न crosslink करने के लिए।
- 65 डिग्री सेल्सियस पर photoresist के साथ वेफर और 5 और 12 मिनट के लिए एक hotplate पर 95 डिग्री सेल्सियस सेंकना, क्रमशः, polymerization के लिए विलायक दूर करने के लिए (SU-8 उत्पाद मैनुअल के अनुसार)। बाद में, वेफर को शांतकमरे का तापमान।
- 25 मिनट के लिए SU-8 डेवलपर में वेफर डुबो कर गैर crosslinked photoresist निकालें। isopropanol साथ वेफर कुल्ला और दबाव हवा के साथ सूखी।
नोट: यदि एक दूधिया समाधान जब, isopropanol के साथ rinsing अधूरा विकास का संकेत मनाया गया, एक लंबे समय तक विकास के समय के लिए SU-8 डेवलपर में वापस वेफर विसर्जित कर दिया। - 10 मिनट के संभावित दरारें से पैटर्न चंगा करने के लिए 180 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर वेफर रखें। गर्म थाली बंद करें और धीरे-धीरे गर्म थाली पर इसे छोड़ने से कमरे के तापमान को वेफर शांत हो जाओ।
- एक शीशी टोपी में (1H, 1h, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane trichloro की कुछ बूँदें जोड़ें। निर्वात desiccator में शीशी टोपी डाल दिया। वेफर शीशी टोपी के लिए अगले 10 मिनट के लिए वेफर silanize के लिए रखें।
- डिजाइन और किसी भी कंप्यूटर एडेड डिजाइन (सीएडी) सॉफ्टवेयर के साथ microfluidic चैनल पैटर्न आकर्षित।
- PDMS चिप निर्माण
- एल्यूमीनियम पन्नी के साथ वेफर लपेटें एक धारक बनाने के लिए।
- 1 जन अनुपात: एक 10 पर polydimethylsiloxane (PDMS) आधार और इलाज एजेंट मिक्समिश्रण और देगास समारोह के तहत एक केन्द्रापसारक मिक्सर के साथ। लगभग 5 मिमी की ऊंचाई तक वेफर पर धीरे-धीरे PDMS मिश्रण डालो। 40 मिनट के लिए वैक्यूम के अंतर्गत PDMS देगास। 2 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में PDMS इलाज।
- ध्यान से मास्टर बंद PDMS स्लैब छील और चैनलों के साथ PDMS ट्रिम जब तक यह एक गिलास स्लाइड के आकार है। एक 1 मिमी बायोप्सी पंच inlets और डिवाइस के आउटलेट बनाने के साथ PDMS पंच।
- दबाव हवा और चिपकने वाला टेप के साथ PDMS सतह को साफ धूल और PDMS मलबे को हटाने के लिए।
- PDMS स्लैब प्लेस, चैनल की ओर एक प्लाज्मा क्लीनर में ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ। प्लाज्मा क्लीनर PDMS स्लैब के साथ में एक साफ कांच स्लाइड रखें।
- 1 मिनट के लिए उच्च स्तर पर आरएफ PDMS और हवा प्लाज्मा के तहत गिलास स्लाइड समझो। एक अपरिवर्तनीय सहसंयोजक बंधन बनाने के लिए गिलास स्लाइड करने के लिए PDMS बाँध।
- 150 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर PDMS चिप 1 घंटे के लिए रखें संबंध ताकत को बढ़ाने के लिए और hydrop वापस करने के लिएउपयोग करने से पहले PDMS की hobicity।
2. सीडिंग प्राथमिक पेरिटोनियल mesothelial कोशिकाओं के साथ microfluidic चिप (HPMCs)
- microfluidic चैनलों की fibronectin कोटिंग
- 75% इथेनॉल के 30 μL के साथ microfluidic चैनल जीवाणुरहित। इथेनॉल निकालें और (पीबीएस) निष्फल फॉस्फेट बफर खारा के 30 μL एक विंदुक टिप का उपयोग कर के साथ दो बार कुल्ला। अच्छी तरह से चैनलों में पीबीएस aspirate।
ध्यान दें: प्रदूषण को कम करने के लिए, microfluidic सेल संस्कृति को ध्यान से एक लामिना का प्रवाह हुड के उपयोग के माध्यम से पूरी तरह से सड़न रोकनेवाला की शर्तों के तहत आयोजित किया जाना चाहिए। - MCDB105 (1: 1) मध्यम सीरम मुक्त M199 में 10 माइक्रोग्राम / एमएल fibronectin समाधान तैयार है। समाधान ऊपर और नीचे विशेष देखभाल के साथ पिपेट, बुलबुला गठन से बचने के लिए। भंवर मत करो।
- धीरे-धीरे fibronectin समाधान के 30 μL के साथ प्रत्येक चैनल को भरने के। टेप के साथ चैनलों को सील करने और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर चिप सेते हैं।
- 75% इथेनॉल के 30 μL के साथ microfluidic चैनल जीवाणुरहित। इथेनॉल निकालें और (पीबीएस) निष्फल फॉस्फेट बफर खारा के 30 μL एक विंदुक टिप का उपयोग कर के साथ दो बार कुल्ला। अच्छी तरह से चैनलों में पीबीएस aspirate।
- में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) संस्कृति के माध्यम से संस्कृति HPMCs: जब तक 80% संगम 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के तहत (M199 MCDB105 10% FBS और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक)।
- पीबीएस के 3 एमएल के साथ HPMCs कुल्ला और 0.05% trypsin के 2 एमएल / 0.01% EDTA (ते) 30 एस के लिए समाधान के साथ trypsinize। 10% FBS संस्कृति के माध्यम से 4 एमएल के साथ बेअसर और 5 मिनट के लिए 1,000 XG पर कोशिकाओं नीचे स्पिन।
- 10% FBS संस्कृति के माध्यम से 2 एमएल में HPMCs Resuspend। एक hemocytometer साथ सेल संख्या की गणना और 3.5 × 10 6 / एमएल के लिए सेल एकाग्रता समायोजित करें।
- उपयोग करने से पहले 5 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में fibronectin लेपित microfluidic चिप गर्म। पूरी तरह से fibronectin समाधान aspirate।
- धीरे-धीरे हर चैनल में एचपीएमसी निलंबन के 30 μL पिपेट। टेप के साथ चैनलों को सील करने और रात भर सीओ 2 इनक्यूबेटर में उपकरणों जगह है।
- डिम्बग्रंथि के कैंसर उपगोल गठन
- (5% FBS और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ MCDB105 M199) 5% सीओ 2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोगों से पहले मानव उपकला डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका लाइन SKOV -3 में 5% FBS संस्कृति के माध्यम से बनाए रखें।
- उबलते द्वारा निष्फल पानी में 0.5% agarose भंग। 96 अच्छी तरह से प्लेटों के प्रत्येक कुएं में agarose समाधान के 50 μL बांटना। 20 मिनट के लिए हुड में प्लेटें छोड़ दो agarose जमना करने की अनुमति के लिए; जम agarose कोटिंग कुओं कोशिका आसंजन को रोकने और कर सकते हैं इंगित करता है कि प्लेटों का उपयोग करने के लिए तैयार हैं।
- पीबीएस के 3 एमएल के साथ SKOV -3 कोशिकाओं कुल्ला। 3 मिनट के लिए ते समाधान के 2 एमएल के साथ Trypsinize। 5% FBS संस्कृति के माध्यम से 4 एमएल के साथ बेअसर और 5 मिनट के लिए 1,000 XG पर कोशिकाओं नीचे स्पिन।
- एक hemocytometer साथ SKOV-3 सेल संख्या की गणना और 5000 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर 5% FBS मध्यम संस्कृति में कोशिकाओं resuspend। trप्रत्येक में सेल निलंबन के ansfer 200 μL 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के तहत अच्छी तरह से और संस्कृति agarose लेपित।
- कर्क अंडाकार आकृति लोड हो रहा है
- एक 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब सीरम मुक्त माध्यम के 1 एमएल के साथ पहले से गीला करने के लिए कैंसर spheroids स्थानांतरण और 5 मिनट के लिए 750 XG पर नीचे स्पिन।
नोट: पिपेट सुझावों के पूर्व गीला और अपकेंद्रित्र ट्यूब अपकेंद्रित्र ट्यूब पर अवांछित अंडाकार आकृति लगाव रोका जा सकता है। - सीरम मुक्त M199 में 5-chloromethylfluorescein diacetate (CMFDA) समाधान के 2.5 माइक्रोग्राम / एमएल तैयार: MCDB105 माध्यम। CMFDA समाधान के 1 एमएल में Resuspend कैंसर spheroids और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। 5 मिनट के लिए 750 XG पर अपकेंद्रित्र।
- 5 मिनट के लिए 750 XG पर सीरम मुक्त मध्यम और सेंट्रीफ्यूज के 2 एमएल के साथ कैंसर spheroids कुल्ला। मध्यम से शेष फ्लोरोसेंट रंजक दूर करने के लिए दो बार इस चरण को दोहराएँ।
नोट: फ्लोरोसेंट संकेत अधिक से अधिक 96 घंटे के लिए spheroids में बनाए रखा जा सकता है। - कैंसर resuspendसीरम मुक्त M199 में spheroids: MCDB105 मध्यम और एक hemocytometer साथ अंडाकार आकृति संख्या गिनती। सीरम मुक्त मध्यम के साथ 2,000 spheroids / एमएल एकाग्रता को समायोजित करें।
- चैनलों के अंदर गैर-पालन mesothelial कोशिकाओं दूर धोने के लिए MCDB105 मध्यम: लोड हो रहा है अंडाकार आकृति, धीरे धीरे सीरम मुक्त M199 के 100 μL इंजेक्षन करने से पहले।
नोट: एक तेजी से इंजेक्शन, आकांक्षा, या बुलबुला गठन mesothelial monolayer की टुकड़ी का नेतृत्व करेंगे। - हर चैनल में फ्लोरोसेंट लेबल अंडाकार आकृति निलंबन का लोड 30 μL। Microfluidic चिप सीओ 2 इनक्यूबेटर में रखें।
- एक 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब सीरम मुक्त माध्यम के 1 एमएल के साथ पहले से गीला करने के लिए कैंसर spheroids स्थानांतरण और 5 मिनट के लिए 750 XG पर नीचे स्पिन।
- छिड़काव मंच विधानसभा और सह संस्कृति
- एक 1 मीटर लंबी ट्यूब के लिए MCDB105 मध्यम: एक सिरिंज ताजा, सीरम मुक्त M199 के साथ भरी हुई संलग्न।
- सिरिंज पंप पर सिरिंज रखें और सवार और सिरिंज के शरीर सुरक्षित है। मशीन के अंदर microfluidic चिप के रूप में एक ही ऊंचाई पर एक क्षैतिज स्थिति में सिरिंज पंप स्थापित करें।
एनOTE: संख्या और सीरिंज के आकार का इस्तेमाल किया चैनलों की संख्या और प्रयोग की अवधि पर निर्भर करती है। - जल्दी से दबाने और तेजी से आगे बटन पकड़ जब तक मध्यम ट्यूबिंग overflows से मध्यम के साथ पूरे ट्यूब दिखे।
- वांछित प्रवाह दर पर इंजेक्शन चलाएँ। निम्न समीकरण का उपयोग दीवार कतरनी तनाव का अनुमान है:
जहां τ चैम्बर, Ǫ = प्रवाह की दर के अंदर दीवार कतरनी तनाव, μ = चिपचिपापन (0.01 छ सीएमएस -1) का प्रतिनिधित्व करता है; एच = प्रवाह कक्ष ऊंचाई, और डब्ल्यू = प्रवाह कक्ष चौड़ाई। - चैनल के प्रवेश करने के लिए ट्यूबिंग कनेक्ट करें। इनक्यूबेटर में अतिरिक्त प्रवेश ट्यूबिंग जगह सुनिश्चित करने के लिए कि मध्यम से पहले चैनलों में इंजेक्शन गरम है। ट्यूबिंग और चैनल के बीच कनेक्शन की सुविधा के लिए, उपयुक्त कनेक्टर्स चुना जा सकता है। नोट: syrin के लिए किसी भी बुलबुले परिचय नहीं खबरदारजीई, ट्यूबिंग, और कनेक्शन।
- एक छोटी उत्पादन ट्यूब के साथ बहिर्वाह मध्यम इकट्ठा करने के लिए एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब चैनल के आउटलेट से कनेक्ट करें।
ध्यान दें: पूरा गतिशील प्रणाली सह संस्कृति चित्रा -1 में दिखाया गया है।
छिड़काव के बाद HPMCs और कैंसर spheroids के 4. अवलोकन
- एक उज्ज्वल क्षेत्र या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ HPMCs और कैंसर spheroids का निरीक्षण करें और छिड़काव के 1 घंटे के बाद तस्वीरें ले लो।
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, एक microfluidic मंच hydrodynamic की शर्तों के तहत mesothelial कोशिकाओं के साथ या गर्भाशय के कैंसर spheroids मॉडल करने के लिए स्थापित किया गया था। प्राथमिक मानव पेरिटोनियल mesothelial कोशिकाओं 16 घंटे के लिए microdevice में सुसंस्कृत और एक उज्ज्वल क्षेत्र खुर्दबीन के नीचे मनाया गया। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 2A, चैनल नीचे सफलतापूर्वक HPMCs की एक monolayer के साथ कवर किया गया था। यह फ़ाइब्रोनेक्टिन या एचपीएमसी patterning के दौरान कहा कि बुलबुला गठन नोट करने के लिए चैनल कोटिंग की विफलता के लिए नेतृत्व करेंगे महत्वपूर्ण है। गैर पक्षपाती निलंबन संस्कृति के माध्यम से, लगभग 100 माइक्रोन का व्यास, जो मरीजों के जलोदर में पाए जाने वाले के आकार में समान हैं साथ बहुकोशिकीय spheroids, उत्पन्न होता है और हरी फ्लोरोसेंट डाई, CMFDA साथ लेबल रहे थे। spheroids तो एचपीएमसी लेपित microfluidic चैनलों को हस्तांतरित और निलंबन में बने रहे थे। सेल morphologies चित्रा 2 खुर्दबीन के नीचे मनाया गया और छवियों पर कब्जा कर लिया गया था (बी)। फ्लोरोसेंट लेबल कैंसर spheroids आसानी से एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (चित्रा 2 सी) के तहत mesothelial कोशिकाओं से भेदभाव किया जा सकता है।
चित्रा 1. मॉडलिंग डिम्बग्रंथि के कैंसर बहुकोशिकीय उपगोल व्यवहार के लिए एक गतिशील 3 डी पेरिटोनियल microdevice। (ए) एक microfluidic-संस्कृति सह करने के लिए प्रवाह शर्त के तहत HPMCs साथ डिम्बग्रंथि के कैंसर spheroids इस्तेमाल किया चिप के योजनाबद्ध आरेख। (बी) योजनाबद्ध microfluidic चैनलों के डिजाइन दिखा आरेख। (सी) एक microfluidic प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया चिप की तस्वीर, अपने चैनलों स्पष्ट दृश्य के लिए डाई समाधान के साथ संचार के साथ। बार = 1 सेमी। (डी) फोटोग्राफ प्रयोगात्मक स्थापना दिखा। एक बड़ा संस्करण ओ देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा च।
2. डिम्बग्रंथि के कैंसर उपगोल-मेसोथेलियल सेल गतिशील सह संस्कृति मॉडल की छवियों चित्रा। (ए) एचपीएमसी monolayer microfluidic चैनल में उगाया की छवि। (बी) के चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी (बाएं पैनल) या (सी) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (ग्रीन, CMFDA, सही पैनल) के तहत पेरिटोनियल mesothelial कोशिकाओं के साथ लेपित microfluidic चैनल में डिम्बग्रंथि के कैंसर spheroids की छवियाँ। बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
इस परख एक लचीला और physiologically प्रासंगिक मॉडल है कि सहित विभिन्न जैव रासायनिक और सेल आधारित assays के साथ शामिल किया जा सकता है, लेकिन नहीं करने के लिए, आसंजन assays, mesothelial क्लीयरेंस assays, और दवा स्क्रीनिंग के लिए सीमित है। यह कैंसर की प्रगति पर intraperitoneal microenvironment के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए लागू किया जा सकता है। हालांकि, कई प्रयोगात्मक शर्तों परियोजना के उद्देश्य पर निर्भर करता है, अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है (जैसे, HPMCs और कैंसर spheroids चैनल, सह संस्कृति समय, आदि प्रति वरीयता प्राप्त की संख्या)। ऐसे fibroblasts, endothelial कोशिकाओं, या प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में intraperitoneal microenvironment में अन्य प्रकार की कोशिकाओं, यह भी डिम्बग्रंथि के कैंसर spheroids और आसपास की कोशिकाओं के बीच आवश्यक बातचीत का अध्ययन करने के क्रम में इस प्रणाली में शामिल किया जा सकता है। ऐसे laminin, vitronectin, या कोलेजन के रूप में अन्य ईसीएम घटकों, भी इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल पर विचार करने की आवश्यकता हो सकती है कि एक कमजोरी यह है कि, जबकिपोषक तत्वों की भरपाई और कतरनी तनाव के युग्मन विवो में देखा है कि की याद ताजा करती है, वहाँ पोषक तत्व भरपाई और हमारे वर्तमान प्रणाली में कतरनी तनाव का अलग से कोई नियंत्रण है। इसके अलावा, इस तरह के प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई के साथ संयुक्त पर चिप trypsinization के रूप में तकनीक अलग से कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के बारे में आगे की पढ़ाई के लिए आणविक या गर्भाशय के कैंसर की कोशिकाओं और HPMCs इकट्ठा करने के लिए आवश्यक हो जाएगा।
इस तकनीक के कई फायदे दर्शाती है जब पारंपरिक तरीकों के साथ तुलना में। पहला, 3 डी सह संस्कृति बेहतर mimics इन विवो या गर्भाशय के कैंसर की कोशिकाओं और mesothelial कोशिकाओं के बीच संचार कहनेवाला। दूसरा, कोशिकाओं fluidic प्रवाह के तहत सुसंस्कृत हैं, लेकिन एक सेलुलर प्रतिक्रिया संभावित vivo स्थिति 12, 13 का प्रतिनिधि है कि पैदा स्थिर हालत में नहीं हैं। इसके अलावा, द्रव का प्रवाह ठीक से नियंत्रित किया जा सकता है, hydrodynami नकल उतारट्यूमर प्रगति के विभिन्न चरणों में ग की स्थिति।
सारांश में, गतिशील 3 डी डिम्बग्रंथि कैंसर mesothelium सह संस्कृति यहाँ प्रस्तुत मॉडल पेरिटोनियल गुहा में मॉडलिंग ट्यूमर व्यवहार के लिए एक लचीला रूपरेखा प्रदान करता है। इस मॉडल के साथ, एक गतिशील hydrodynamic शर्त के तहत कैंसर की कोशिकाओं और mesothelial कोशिकाओं के बीच बातचीत का व्यापक विश्लेषण किया जा सकता है। यह बहुत मेटास्टेटिक प्रगति की अंतर्निहित तंत्र के बारे में हमारी समझ को अग्रिम कर सकते हैं और यह भी चिकित्सीय विकास की सुविधा हो सकती है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
यह काम हांगकांग अनुसंधान अनुदान परिषद द्वारा समर्थित किया गया था (अनुदान 17122014, C1013-15G, 719813E, और 17304514)। एएसटी वोंग Croucher सीनियर रिसर्च फैलोशिप के एक प्राप्तकर्ता है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafer | University wafer | #1196 | 100 mm |
| SU-8 2075 photoresist | Microchem | ||
| SU-8 developer | Microchem | 108-65-6 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 1673921 | Polydimethylsiloxane (PDMS) + curing agent kit |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31AA | 1 mm diameter |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Polyethylene tubing | SCI | BB31695-PE/5 | 0.86 mm (inner diameter) |
| Syringe | Terumo | ||
| Syringe pump | Longer precision pump | LSP01-2A | |
| Medium 199 | Invitrogen | 31100-035 | Add 2.2 g/L sodium bicarbonate |
| MCDB 105 Medium | Sigma | M6395 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30068.02 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Trypsin EDTA solution | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin - 0.01% EDTA, phenol red |
| Fibronectin human | BD | 354008 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| 5-chloromethylfluorescein diacetate | Life technologies | C7025 | Green CMFDA |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-18AIC | |
| Centrifuge | Hitachi | CT15RE | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Model: 80i or ECLIPSE Ti; software: SPOT | |
| SKOV-3 | Gift from Dr. N Auersperg (University of British Columbia) |
References
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