Summary
At studere i æggestokkene tumor progression i en fysiologisk relevant model, flercellede spheroids blev dyrket i en microdevice under simuleret væske flow. Denne dynamiske 3D-model emulerer intraperitoneal miljø med de cellulære og mekaniske komponenter, hvor kræft i æggestokkene metastaser forekommer.
Abstract
Kræft i æggestokkene er karakteriseret ved omfattende peritoneal metastaser, med tumor kugler almindeligvis findes i de maligne ascites. Dette er forbundet med dårlige kliniske resultater og mangler i øjeblikket effektiv behandling. Både det tredimensionale (3D) miljø og de dynamiske mekaniske kræfter er meget vigtige faktorer i denne metastatiske kaskade. De traditionelle cellekulturer undlader at rekapitulere denne naturlige tumormikromiljøet. Således in vivo-lignende modeller, der kan efterligne den intraperitoneale miljø er af indlysende betydning. I denne undersøgelse blev en ny mikrofluid platform i bughinden sat op til at efterligne situationen for ovariecancer sfæroider i bughulen under metastase. Ovariecancer sfæroider fremkommet under en ikke-klæbende tilstand blev dyrket i mikrofluidkanaler overtrukket med peritoneale mesotelceller underkastet fysiologisk relevant forskydningsspænding. Sammenfattende denne dynamiske 3D ovariecancer-mesothelium microfluidic platform kan give ny viden om grundlæggende kræft biologi og fungere som en platform for potentiel screening og udvikling af lægemidler.
Introduction
Kræft i æggestokkene er den mest dødelige gynækologiske kræft og er kendetegnet ved udbredt peritoneal formidling og dannelsen af maligne ascites 1. Denne omfattende peritoneal metastase er en stor klinisk udfordring og er forbundet med dårlige kliniske resultater. Modsætning til de fleste faste karcinomer, der metastaserer via blodet, ovariecancer formidler primært inden bughulen. Tumorceller eksistere som multicellulære aggregater / sfæroider under processen med metastase 2. Den omstændighed, at suspensionskultur kan berige ovariecancer spindel / tumor-initierende celler foreslår endvidere, at disse sfæroider kan være forbundet med både tumor aggressivitet og forbedret kemoresistens 3, 4. Der er forskelle i lægemiddelrespons mellem 2D- og 3D kulturer, hvilket formentlig har forskellige molekylære mekanismer 5.
_content "> Det væsentlige interaktion med mesothelium konstruerer den primære mikromiljø for ovariecancer tumorprogression. Disse mesotelceller ligge på en ekstracellulær matrix (ECM), hvor fibronectin er et allestedsnærværende bestanddel. En forbindelse mellem forøget ekspression af mesotelial celleafledt fibronectin og tumorprogression er blevet vist. fibronectin findes i stort omfang i malign ascites 6, 7. Æggestokkræftceller er også i stand til at inducere sekretion af fibronectin fra mesotelceller for at fremme tidlig ovariecancer metastase 8.Ny dokumentation viser, at mekaniske stimuli, herunder forskydningsspænding, kan modulere cellemorfologi, genekspression, og dermed de fænotyper af tumorceller 9, 10, 11. Som malign ascites udvikle og akkumulerer gennem tumor progression, er ovarietumorceller udsat for fluidstrøm og den resulterende forskydningsspænding. Et antal grupper, vores inkluderet, har vist virkningen af forskydningsspænding på ovariecancer progression, herunder cytoskeleton modifikationer, epithelial-til-mesenchymale overgange og cancer stemness 12, 13, 14, 15. Således er en fysiologisk relevant mikromiljø er vigtigt for undersøgelse af tumor peritoneal metastaser. De nuværende in vitro hydrodynamiske dyrkningssystemer har begrænsninger på at efterligne og styring af en konstant, lav, fysiologisk relevant forskydningsspænding 16, 17, 18, 19. Konventionel in vitro metoder fokuserer på enten celle- eller mekaniske miljø er stadig begrænset iefterligne kompleksiteten af intraperitoneal mikromiljø med ordentlig fysiologiske relevans.
Her, med henblik på at konstruere en ny model for peritoneum at overvinde begrænsningerne ved konventionelle strategier og fremme studiet af intraperitoneal rum i cancermetastase, blev et 3D mikrofluidanordning-baseret platform med styret fluidstrømning designet. I denne model, ovariecancer sfæroider blev co-dyrket med primære humane peritoneale mesoteliale celler i mikrofluide chips under kontinuerlig strømningsteknisk flow (figur 1A). Mesothelial celler blev udpladet på fibronectin. Ikke-adhærente ovariecancer sfæroider blev podet i mikrofluidkanaler med kontinuerligt flow medium perfunderet ved en sprøjtepumpe. Både 3D-miljø og de dynamiske mekaniske kræfter er meget vigtige faktorer i den metastatiske kaskade. Denne platform kan anvendes til undersøgelse af intraperitoneal mikromiljø i form af komplekse cellastet, og co-kultur interaktioner, samt med hensyn til dynamiske mekaniske signaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Design og Fabrication mikrofluidapparat
- Mikrofluid mester design
- Design og tegne mikrofluid kanal mønster med enhver computer-aided design (CAD) software.
BEMÆRK: Normalt CAD-tegning kan sendes til en fotomaske selskab til at producere fotomasken. Mikrofluid design består af tre identiske parallelle kanaler, hver med følgende dimensioner: 4 mm × 25 mm x 250 um (bredde x længde x højde) og sæt 2 mm fra hinanden. Begge kanal ender blev designet med 127 ° vinkler for at lette flydende indgang og udgang (figur 1B). Kanalen anvendes i denne protokol blev rapporteret i en tidligere publikation 13. - Vask siliciumskiven med ultralydsbehandling (500 W / 42 kHz) i acetone, isopropanol og deioniseret vand i 15 minutter hver. Tør wafer med tryksat nitrogen gas. Varm siliciumskiven på en varmeplade ved 250 ° C i 15 min til fuldstændig tørdet.
- Spin-coat et lag af SU-8 2075 fotoresist (125 um tyk) på siliciumwafer med en roterende hastighed på 1.800 rpm. Bage fotoresist-coatede wafer direkte på en varmeplade ved 65 ° C og derefter ved 95 ° C, for at fjerne overskydende opløsningsmiddel i 5 og 25 min, henholdsvis (ifølge SU-8 produktmanual den).
- Gentag trin 3 og spin-coat andet lag af SU-8 2075 fotoresist at opnå en endelig tykkelse på 250 um. Bag fotoresist-coatede wafer direkte på en varmeplade ved 65 ° C i 7 minutter og derefter ved 95 ° C i 30 minutter. afkøle langsomt skiven til stuetemperatur. Må ikke cool med trykluft.
- Juster og sætte fotomasken direkte oven på skiven. Udsættes for UV-lys i 20 s for at tværbinde det mønster.
- Bage wafer med fotoresist ved 65 ° C og 95 ° C på en varmeplade i 5 og 12 min, henholdsvis at fjerne opløsningsmidlet til polymerisation (ifølge SU-8 produktmanual den). Bagefter afkøle waferen tilstuetemperatur.
- Fjern den ikke-tværbundne fotoresist ved at nedsænke skiven i SU-8 fremkalder i 25 min. Skyl wafer med isopropanol og tørres med trykluft.
BEMÆRK: Hvis der blev observeret en mælkeagtig løsning, når skylning med isopropanol, hvilket indikerer ufuldstændig udvikling, fordybe wafer tilbage i SU-8 udvikler for en længere udviklingstid. - Placer skiven på en varmeplade ved 180 ° C i 10 min for at helbrede mønsteret fra potentielle revner. Sluk varmepladen og langsomt afkøle waferen til stuetemperatur ved at lade det på den varme plade.
- Tilføj et par dråber af trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyl) silan i et hætteglas hætte. Sæt hætteglasset cap i vakuum ekssikkator. Anbring wafer siden hætteglassets hætte til silanize waferen i 10 min.
- Design og tegne mikrofluid kanal mønster med enhver computer-aided design (CAD) software.
- PDMS chip fabrikation
- Wrap wafer med aluminiumsfolie for at skabe en holder.
- Bland polydimethylsiloxan (PDMS) base og hærder ved en 10: 1 masseforholdmed en centrifugal mixer under blanding og afgasse funktion. Hæld PDMS blandingen langsomt på skiven til en højde på omkring 5 mm. Afgasses PDMS under vakuum i 40 min. Hærde PDMS i en ovn ved 65 ° C i 2 timer.
- Træk forsigtigt PDMS plade off master og trim PDMS langs kanalerne, indtil det er på størrelse med en glasplade. Punch PDMS med en 1-mm biopsitang at skabe indløb og udløb af indretningen.
- Rengør PDMS overflade med trykluft og tape til at fjerne støv og PDMS snavs.
- Placer PDMS slab, med kanalen side opad, ind i et plasma renere. Placer en ren objektglas i plasma renere siden af PDMS slab.
- Behandl PDMS og objektglas under luft plasma ved høj RF niveau i 1 min. Bind PDMS til objektglasset for at skabe en irreversibel kovalent binding.
- Placer PDMS chip på en varmeplade ved 150 ° C i 1 time for at øge bindingsstyrken og returnere hydrophobicity af PDMS før brug.
2. Seeding mikrofluid chip med primær peritonealcancer mesotelceller (HPMC'er)
- Fibronectin belægning af mikrofluidkanaler
- Steriliser mikrofluid kanal med 30 pi af 75% ethanol. Fjerne ethanolen og skyl to gange med 30 pi steriliseret phosphatbufret saltvand (PBS) under anvendelse af en pipettespids. Grundigt aspireres PBS i kanalerne.
BEMÆRK: For at minimere forurening, bør den mikro cellekultur udføres omhyggeligt under fuldt aseptiske betingelser ved anvendelse af en laminar flow hætte. - Der fremstilles en 10 ug / ml fibronectin opløsning i serumfrit M199: MCDB105 (1: 1) medium. Pipette løsningen op og ned, med særlig omhu for at undgå bobledannelse. Undlad at slynge.
- Fyld langsomt op hver kanal med 30 uL af fibronektin løsning. Forsegl kanaler med tape og inkuberes chippen natten over ved 4 ° C.
- Steriliser mikrofluid kanal med 30 pi af 75% ethanol. Fjerne ethanolen og skyl to gange med 30 pi steriliseret phosphatbufret saltvand (PBS) under anvendelse af en pipettespids. Grundigt aspireres PBS i kanalerne.
- Kultur HPMC'er i 10% føtalt bovint serum (FBS) dyrkningsmedium (M199: MCDB105 suppleret med 10% FBS og 100 U / ml penicillin / streptomycin) under 5% CO2 ved 37 ° C, indtil 80% konfluens.
- Skyl HPMC'er med 3 ml PBS og Trypsinisér med 2 ml 0,05% trypsin / 0,01% EDTA (TE) opløsning til 30 s. Neutraliser med 4 ml 10% FBS dyrkningsmedium og spin ned cellerne ved 1.000 xg i 5 min.
- Resuspendere HPMC'er i 2 ml 10% FBS dyrkningsmedium. Tæl celletallet med et hæmocytometer og justeres cellekoncentrationen til 3,5 x 10 6 / ml.
- Varm fibronectin-overtrukne mikrofluid chip i et 37 ° C inkubator i 5 minutter før brug. Aspirér fibronectin opløsning.
- pipette langsomt 30 pi af HPMC suspensionen i hver kanal. Forsegl kanaler med tape og placere enhederne i CO2-inkubator natten over.
- Kræft i æggestokkene klumpformet dannelse
- Opretholde den humane epitelial ovariecancer cellelinje SKOV-3 i 5% FBS dyrkningsmedium (M199: MCDB105 med 5% FBS og 100 U / ml penicillin / streptomycin) under 5% CO2 ved 37 ° C før forsøgene.
- Opløs 0,5% agarose i steriliseret vand ved kogning. Dispensere 50 pi agaroseopløsning i hver brønd i 96-brønds plader. Efterlad pladerne i stinkskab i 20 min for at tillade agarose at størkne; størknet agarose overtrækning brøndene kan forhindre celleadhæsion og viser, at pladerne er klar til brug.
- Skyl SKOV-3 celler med 3 ml PBS. Trypsinisér med 2 ml TE løsning for 3 min. Neutraliser med 4 ml 5% FBS dyrkningsmedium og spin ned cellerne ved 1.000 xg i 5 min.
- Tæl SKOV-3 celleantal med et hæmocytometer og resuspender cellerne i 5% FBS dyrkningsmediet ved en densitet på 5.000 celler / ml. transfer 200 pi cellesuspension i hver agarose-coatet brønd og kultur under 5% CO2 ved 37 ° C i 48 timer.
- Kræft klumpformet lastning
- Overfør cancer sfæroider til et 50-ml centrifugerør allerede vædet med 1 ml serum-frit medium og spin ned ved 750 x g i 5 min.
BEMÆRK: Pre-fugtet pipettespidser og centrifugerør kan forhindre uønsket klumpformet vedhæftning på de centrifugerør. - Forbered 2,5 ug / ml 5-chloromethylfluorescein diacetat (CMFDA) opløsning i serumfrit M199: MCDB105 medium. Resuspender cancer sfæroider i 1 ml CMFDA opløsning og inkuber ved 37 ° C i 30 minutter. Centrifuger ved 750 xg i 5 min.
- Skyl cancer sfæroider med 2 ml serumfrit medium og centrifugeres ved 750 xg i 5 min. Gentag dette trin to gange for at fjerne det resterende fluorescerende farvestof fra mediet.
BEMÆRK: fluorescerende signal kan bevares i sfæroider i mere end 96 timer. - Resuspender kræftsphæroider i serum-frit M199: MCDB105 medium og tælle klumpformet nummer med et hæmocytometer. Indstille koncentrationen til 2.000 sfæroider / ml med serum-frit medium.
- Før kugleformet lastning, langsomt tilføre 100 pi serumfrit M199: MCDB105 medium til at vaske væk de ikke-klæbet mesotelceller inde i kanalerne.
BEMÆRK: En hurtig injektion, aspiration, eller bobledannelse vil føre til løsrivelse af mesothelial monolag. - Belastning 30 pi fluorescensmærket sfæroid suspensionen i hver kanal. Placer mikrofluid chip i CO2-inkubator.
- Overfør cancer sfæroider til et 50-ml centrifugerør allerede vædet med 1 ml serum-frit medium og spin ned ved 750 x g i 5 min.
- Perfusion platform samling og co-kultur
- Sæt en sprøjte fyldt med frisk, serum-frit M199: MCDB105 medium til en 1 meter lang slange.
- Anbring sprøjten på sprøjtepumpen og fastgør stemplet og legemet af sprøjten. Installere sprøjtepumpen i vandret stilling i samme højde som den mikrofluid chip inden i kuvøsen.
NOTE: Antal og størrelse af sprøjter afhænger af antallet af anvendte kanaler og varigheden af forsøget. - Hurtigt indgyde hele rør med medium ved at holde den hurtige knappen fremad, indtil mediet løber over slangen.
- Kør injektion på det ønskede flow. Skøn væg forskydningsspænding den ved hjælp af følgende ligning:
hvor τ repræsenterer væg forskydningsspænding den inde i kammeret, Ǫ = flowhastighed, μ = viskositet (0,01 g cms -1); h = strømningskammeret højde, og w = strømningskammeret bredde. - Tilslut slangen til indløbet af kanalen. Placer overskydende indløbsrøret i inkubatoren for at sikre, at mediet opvarmes før injiceres i kanalerne. For at lette forbindelsen mellem slangen og kanalen, kan passende konnektorer vælges. BEMÆRK: Pas på ikke at indføre nogen boble til Syringe, slanger og forbindelser.
- Tilslut udløbet fra kanalen til en 50-mL konisk rør til opsamling af udstrømningen medium med en kort udgangsrør.
BEMÆRK: Den komplette dynamiske co-kultursystem er vist i figur 1D.
4. Observation af HPMC'er og Kræft Spheroids efter Perfusion
- Overhold HPMC'er og kræft sfæroider med en lys-felt eller fluorescens mikroskop og tage billeder efter 1 time af perfusion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af denne protokol blev en mikrofluid platform sat op til at modellere ovariecancer sfæroider med mesothelial celler under hydrodynamiske forhold. Primære humane peritoneale mesoteliale celler blev dyrket i microdevice i 16 timer og observeret under et lys-felt mikroskop. Som vist i figur 2A, blev kanalen bunden held dækket med et monolag af HPMC'er. Det er vigtigt at bemærke, at bobledannelse under fibronectin eller HPMC mønsterdannelse vil føre til kanal belægning fiasko. Gennem ikke-klæbende suspension kultur, flercellede spheroids med en diameter på ca. 100 um, som svarer i størrelse til dem, der findes i patienternes ascites, blev genereret og mærket med grønt fluorescerende farvestof, CMFDA. Sfæroiderne blev derefter overført til HPMC-overtrukne mikrofluidkanaler og forblev i suspension. Cell morfologier blev iagttaget under mikroskop og billeder blev indfanget (figur 2B). De fluorescerende-mærkede kræft sfæroiderne kan let skelnes fra mesothelial celler under et fluorescensmikroskop (figur 2C).
Figur 1. Et dynamisk 3D peritoneal Microdevice for Modeling kræft i æggestokkene Multicellulære klumpformet Behaviors. (A) Skematisk diagram af en mikrofluid chip anvendes til at co-kultur ovariecancer sfæroider med HPMC'er under flow tilstand. (B) Skematisk diagram, der viser udformningen af mikrofluidkanaler. (C) Fotografi af en mikrofluid chip, der anvendes i protokollen, med sine kanaler infunderes med farveopløsning for klar visualisering. Bar = 1 cm. (D) fotografi, der viser forsøgsopstillingen. Klik her for at se en større version of denne figur.
Figur 2. Billeder af kræft i æggestokkene Sfæroide-mesothelial Cell Dynamic Co-kultur Model. (A) Billede af HPMC monolaget dyrket i mikrofluid kanal. (B) billeder af ovariecancer sfæroider i mikrofluid kanal overtrukket med peritoneale mesoteliale celler under fasekontrastmikroskopi (venstre panel) eller (C) fluorescensmikroskopi (Green, CMFDA, højre panel). Bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette assay giver en fleksibel og fysiologisk relevant model, der kan inkorporeres med forskellige biokemiske og cellebaserede assays, herunder, men ikke begrænset til, adhæsionsassays, mesothelial clearance assays og lægemiddelscreening. Det kan anvendes til evalueringen af virkningen af intraperitoneal mikromiljø på cancer progression. Men måske har brug for flere eksperimentelle betingelser, der skal optimeres, afhængigt af formålet med projektet (f.eks antallet af HPMC'er og kræft sfæroider seedet per kanal, co-kultur tid osv). Andre celletyper i intraperitoneal mikromiljø, såsom fibroblaster, endotelceller eller immunceller, kan også inkluderes i systemet for at studere de væsentlige interaktioner mellem ovariecancer sfæroider og nærliggende celler. Andre ECM komponenter, såsom laminin, vitronectin, eller collagen, kan også anvendes. En svaghed ved denne protokol, kan være nødvendigt skal overvejes, er, at selv omkobling af næringsstof påfyldning og forskydningsspænding minder om den, der ses in vivo, er der ingen separat styring af næringsstof påfyldning og forskydningsspænding i vores nuværende system. Desuden vil teknikker, såsom on-chip trypsinisering kombineret med fluorescensaktiveret cellesortering være nødvendig til separat indsamling ovariecancerceller og HPMC'er til yderligere molekylære undersøgelser om forskellige typer af celler.
Denne teknik udviser flere fordele sammenlignet med traditionelle fremgangsmåder. Først 3D co-kultur bedre efterligner in vivo intercellulære kommunikation mellem ovariecancerceller og mesotelceller. For det andet, celler dyrkes under strømningsteknisk flow men ikke er i statisk tilstand, genererer et cellulært respons, der er potentielt repræsenterer in vivo situationen 12, 13. Endvidere kan væskestrømmen styres præcist, efterligner hydrodynamic forhold på forskellige stadier af tumor progression.
Sammenfattende det dynamiske 3D ovariecancer-mesothelium co-kultur model præsenteres her giver en fleksibel ramme for modellering tumor adfærd i bughulen. Med denne model, kan analyseres udtømmende interaktionen mellem cancerceller og mesotelceller under en dynamisk hydrodynamisk tilstand. Det kan i høj grad fremme vores forståelse af de underliggende mekanismer for metastatisk progression og måske også lette terapeutisk udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Hongkong Research Grant Rådet (tilskud 17.122.014, C1013-15G, 719813E, og 17.304.514). AST Wong er en modtager af Croucher Senior Research Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafer | University wafer | #1196 | 100 mm |
| SU-8 2075 photoresist | Microchem | ||
| SU-8 developer | Microchem | 108-65-6 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 1673921 | Polydimethylsiloxane (PDMS) + curing agent kit |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31AA | 1 mm diameter |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Polyethylene tubing | SCI | BB31695-PE/5 | 0.86 mm (inner diameter) |
| Syringe | Terumo | ||
| Syringe pump | Longer precision pump | LSP01-2A | |
| Medium 199 | Invitrogen | 31100-035 | Add 2.2 g/L sodium bicarbonate |
| MCDB 105 Medium | Sigma | M6395 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30068.02 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Trypsin EDTA solution | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin - 0.01% EDTA, phenol red |
| Fibronectin human | BD | 354008 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| 5-chloromethylfluorescein diacetate | Life technologies | C7025 | Green CMFDA |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-18AIC | |
| Centrifuge | Hitachi | CT15RE | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Model: 80i or ECLIPSE Ti; software: SPOT | |
| SKOV-3 | Gift from Dr. N Auersperg (University of British Columbia) |
References
- Jemal, A., et al. Global cancer statistics. CA: Cancer J. Clin. 61, 69-90 (2011).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Chau, W. K., Ip, C. K., Mak, A. S., Lai, H. C., Wong, A. S. c-Kit mediates chemoresistance and tumor-initiating capacity of ovarian cancer cells through activation of Wnt/beta-catenin-ATP-binding cassette G2 signaling. Oncogene. 32, 2767-2781 (2013).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).
- Tang, M. K. S., Zhou, H. Y., Yam, J. W. P., Wong, A. S. T. c-Met overexpression contributes to the acquired apoptotic resistance of nonadherent ovarian cancer cells through a cross talk mediated by phosphatidylinositol 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase 1/2. Neoplasia. 12, 128-144 (2010).
- Ksiazek, K., et al. Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin. Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).
- Hafter, R., Klaubert, W., Gollwitzer, R., Vonhugo, R., Graeff, H. Crosslinked Fibrin Derivatives and Fibronectin in Ascitic Fluid from Patients with Ovarian-Cancer Compared to Ascitic Fluid in Liver-Cirrhosis. Thromb Res. 35, 53-64 (1984).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307, 58-62 (2005).
- Chang, S. F., et al. Tumor cell cycle arrest induced by shear stress: Roles of integrins and Smad. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 3927-3932 (2008).
- Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator. Trends Cell Biol. 17, 44-50 (2007).
- Rizvi, I., et al. Flow induces epithelial-mesenchymal transition, cellular heterogeneity and biomarker modulation in 3D ovarian cancer nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, E1974-E1983 (2013).
- Ip, C. K., et al. Stemness and chemoresistance in epithelial ovarian carcinoma cells under shear stress. Sci. Rep. 6, 26788 (2016).
- Avraham-Chakim, L., et al. Fluid-flow induced wall shear stress and epithelial ovarian cancer peritoneal spreading. PloS one. 8, e60965 (2013).
- Burkhalter, R. J., et al. Peritoneal mechanobiology and metastatic success in epithelial ovarian cancer. Faseb Journal. 26, (2012).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Botta, G. P., Manley, P., Miller, S., Lelkes, P. I. Real-time assessment of three-dimensional cell aggregation in rotating wall vessel bioreactors in vitro. Nat. Protoc. 1, 2116-2127 (2006).
- Ismadi, M. Z., et al. Flow characterization of a spinner flask for induced pluripotent stem cell culture application. PloS one. 9, e106493 (2014).
- Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PloS one. 9. 9, e89966 (2014).
