Summary
生理学的に関連するモデルにおける卵巣腫瘍の進行を研究するために、多細胞スフェロイドは、シミュレートされた流体の流れの下でのマイクロデバイスで培養しました。このダイナミックな3Dモデルは、卵巣癌転移が起こる細胞および機械部品を腹腔内環境をエミュレートします。
Abstract
卵巣がんは、一般的に悪性腹水で見つかった腫瘍球で、広範な腹膜転移することを特徴とします。これは、不良な臨床転帰と関連しており、現在有効な治療を欠いています。 3次元（3D）環境と動的機械的な力の両方が、この転移カスケードにおいて非常に重要な因子です。しかし、従来の細胞培養物は、この自然の腫瘍微小環境を再現することができません。このように、腹腔内環境をエミュレートすることができますin vivoでの様モデルは明白重要です。本研究では、腹膜の新たなマイクロ流体プラットフォームは、転移の間に腹腔内に卵巣癌のスフェロイドの状況を模倣するために設立されました。非付着条件下で生成された卵巣癌のスフェロイドは、生理学的に関連するせん断応力に供腹膜中皮細胞で被覆されたマイクロ流体チャネル中で培養しました。要約すると、このダイナミックな3D卵巣癌、中皮マイクrofluidicプラットフォームは、基本的な癌生物学に新たな知見を提供し、潜在的な薬物スクリーニングおよび開発のためのプラットフォームとして機能することができます。
Introduction
卵巣癌は最も致命的な婦人科癌でありかつ広範な腹膜播種および悪性腹水1の形成によって特徴づけられます。この大規模な腹膜転移は、主要な臨床課題であると貧しい臨床転帰と関連しています。血液を介して転移する最も固形癌とは異なり、卵巣がんは主に腹腔内に発信しています。腫瘍細胞は転移2のプロセス中に、多骨材/球状体として存在します。浮遊培養は、卵巣癌の幹細胞/腫瘍開始細胞を濃縮することができるという事実は、これらのスフェロイドは、腫瘍の攻撃性と増強化学療法抵抗3,4の両方に関連することができることを示唆しています。おそらく別の分子機構5を持っている2Dおよび3Dの文化、間の薬物応答の違いがあります。
_contentは ">中皮との本質的な相互作用は、卵巣腫瘍の進行のための主要な微小環境を構築する。これらの中皮細胞は、フィブロネクチンが遍在成分である細胞外マトリックス（ECM）、上に位置する。増加した中皮細胞由来のフィブロネクチンの発現との間のリンクを腫瘍の進行が示されている。フィブロネクチンは、悪性腹水6,7に豊富に存在する。卵巣癌細胞はまた、初期の卵巣がん転移8を促進するために中皮細胞からのフィブロネクチンの分泌を誘導することができます。証拠が出現すると、せん断応力などの機械的な刺激が、細胞形態、遺伝子発現を調節し、そして、従って、腫瘍細胞9、10、11の表現型ができることを示しています。悪性腹水として 開発とtの間に蓄積しますumor進行、卵巣腫瘍細胞は、 流体の流れと、得られたずり応力に曝露されます。グループの数は、我々が含まれ、細胞骨格修飾、上皮-間葉移行、および癌の幹細胞性12、13、14、15を含む、卵巣癌の進行のせん断応力の影響を示しています。このように、生理学的に関連する微小環境は、腫瘍腹膜転移の調査のために重要です。しかし、現在のインビトロ流体力学培養系は、一定の、低い、生理学的に関連するせん断応力16、17、18、19を模倣し、制御上の限界があります。従来のin vitroではまだで制限されているいずれかの細胞または機械的な環境に焦点を当て近づきます適切な生理学的関連性と腹腔内微小環境の複雑さを模倣します。
ここで、従来の戦略の限界を克服し、癌転移における腹腔内コンパートメントの研究を進めるために腹膜の新しいモデルを設計するために、制御された流体の流れと3Dマイクロ流体ベースのプラットフォームを設計しました。このモデルでは、卵巣癌のスフェロイドは、連続的な流体の流れ（ 図 1A）の下で、マイクロ流体チップにおける一次ヒト腹膜中皮細胞と共培養しました。中皮細胞は、フィブロネクチン上に播種しました。非接着性卵巣癌のスフェロイドは、シリンジポンプによって灌流連続流媒体とマイクロ流体チャネルに播種しました。 3D環境と動的機械的な力の両方が転移カスケードの非常に重要な要因です。このプラットフォームは、複雑なセルの点で腹腔内微小環境を調査するために使用することができますlularと共培養相互作用だけでなく、動的機械的手がかりに関して。
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Protocol
1.マイクロ流体デバイスの設計・製作
- マイクロ流体マスターデザイン
- デザインとは、任意のコンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアとマイクロ流体チャネルのパターンを描画します。
注記：通常、CAD図面は、フォトマスクを生成するマスク会社に送信することができます。マイクロ流体設計では、3つの同一の並列チャネル、以下の寸法を持つ各から構成されていますが250μm（長さ×高さ×幅）×25ミリメートル×4ミリメートルと離れて2ミリメートルを設定します。両方のチャネルの端部は、液体入口と出口（ 図1B）を容易にするために、127°の角度で設計されていました。このプロトコルで使用されるチャンネルは、以前の刊行物13で報告されました。 - 15分ごとに、アセトン、イソプロパノール、および脱イオン水に超音波（500 W / 42 kHzの）とシリコンウエハを洗浄します。加圧された窒素ガスを用いてウエハを乾燥させます。完全に乾燥し、15分間250℃のホットプレート上にシリコンウェハを加熱しますそれ。
- スピンコート1,800 rpmでの紡糸速度を有するシリコンウェハ上に（125ミクロン厚）SU-8 2075フォトレジストの層。 （SU-8の製品マニュアルに従って）はそれぞれ、5〜25分間、過剰の溶媒を除去するために、65℃で、その後、95℃のホットプレート上に直接フォトレジスト塗布されたウエハを焼きます。
- ステップ3を繰り返しスピンコートSU-8 2075フォトレジストの別の層は、250μmの最終厚みを得ることができます。 7分間65℃のホットプレート上に直接フォトレジスト塗布ウェハ焼く、その後30分間95℃で。ゆっくりと室温にウェーハを冷却します。加圧された空気で冷却しないでください。
- 合わせて、ウエハの上に直接フォトマスクを置きます。パターンを架橋するために20秒間UV光にそれを公開します。
- 、それぞれ、5および12分間ホットプレート上で65℃と95℃でのフォトレジストを有するウェハのベーク（SU-8の製品マニュアルに従って）重合用溶媒を除去します。その後、ウエハへの冷却室温。
- 25分間のSU-8現像液にウェハを浸漬することにより非架橋フォトレジストを除去します。イソプロパノールでウエハを洗浄し、加圧された空気で乾燥させました。
注：イソプロパノールですすぎ時に乳白色の溶液が観察された場合は、不完全な発展を示し、バック長い開発期間のためのSU-8の開発者にウェハを浸します。 - 潜在的な亀裂からパターンを癒すために10分間、180℃のホットプレート上でウェーハを置きます。ホットプレートの電源をオフにして、ゆっくりとホットプレートの上に残して室温にウエハを冷却。
- バイアルキャップにトリクロロの（1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル）シランを数滴を追加します。真空デシケーター中でバイアルキャップを置きます。 10分間ウェハをsilanizeするバイアルキャップに次のウエハを配置します。
- デザインとは、任意のコンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアとマイクロ流体チャネルのパターンを描画します。
- PDMSチップ製造
- ホルダーを作成するために、アルミ箔でウエハをラップします。
- 1質量比：10でポリジメチルシロキサン（PDMS）ベースと硬化剤を混ぜます混合および脱ガス機能の下で遠心ミキサーで。周りに5ミリメートルの高さにウエハ上にゆっくりとPDMSの混合物を注ぎます。 40分間真空下でPDMSを脱気。 2時間65℃のオーブン中でPDMSを硬化させます。
- 慎重にマスターからPDMSスラブを剥離し、スライドガラスの大きさになるまで、チャネルに沿ってPDMSをトリミング。デバイスの入口と出口を作成するために、1 mmの生検パンチでPDMSをパンチ。
- ほこりやPDMSの破片を除去するために加圧された空気と粘着テープでPDMS表面を清掃してください。
- プラズマクリーナーに、チャネル側を上に向けた状態で、PDMSスラブを配置します。 PDMSスラブと一緒にプラズマクリーナーに清浄なスライドガラスを置きます。
- 1分間の高いRFレベルでの空気プラズマの下でPDMSとガラススライドを扱います。不可逆的な共有結合を作成するために、スライドガラスにPDMSをバインドします。
- 接合強度を高め、hydropを返すために、1時間、150℃のホットプレート上でPDMSチップを配置使用前にPDMSのhobicity。
2.播種原発腹膜中皮細胞とマイクロ流体チップ（のHPMC）
- マイクロ流体チャネルのフィブロネクチンコーティング
- 75％エタノールの30μLとマイクロ流体チャネルを滅菌します。エタノールを除去し、ピペットチップを使用して滅菌リン酸緩衝生理食塩水30μL（PBS）で2回すすぎます。徹底的チャンネルにPBSを吸引します。
注：汚染を最小限に抑えるために、マイクロ流体細胞培養を注意深く層流フードを使用することにより、完全に無菌条件下で行われるべきです。 - MCDB105（1：1）培地を無血清M199中10μg/ mLのフィブロネクチン溶液を調製します。気泡の形成を避けるために特別な注意を払って、上下ソリューションをピペット。ボルテックスしないでください。
- ゆっくりとフィブロネクチン溶液30μLで各チャンネルを埋めます。テープでチャンネルを密封し、4℃で一晩チップをインキュベートします。
- 75％エタノールの30μLとマイクロ流体チャネルを滅菌します。エタノールを除去し、ピペットチップを使用して滅菌リン酸緩衝生理食塩水30μL（PBS）で2回すすぎます。徹底的チャンネルにPBSを吸引します。
- 10％ウシ胎児血清（FBS）培地における培養のHPMC：80％コンフルエンスになるまで37℃、5％CO 2下（M199 MCDB105、10％FBSおよび100U / mLのペニシリン/ストレプトマイシンを補充しました）。
- PBSの3ミリリットルとのHPMCをすすぎ、30秒間、0.05％トリプシン/ 0.01％EDTA（TE）溶液2mLでトリプシン処理。 10％FBS培地4mLで中和し、5分間千×gで細胞をスピンダウン。
- 10％FBS培地2mL中のHPMCを再懸濁します。血球計数器を用いて細胞数をカウントし、3.5×10 6 / mLに細胞濃度を調整します。
- 使用前に5分間、37℃のインキュベーター中フィブロネクチンでコーティングされたマイクロ流体チップを温めます。完全フィブロネクチンソリューションを吸引。
- ゆっくりと、各チャネルにHPMC懸濁液30μLをピペット。テープでチャンネルを密封し、一晩CO 2インキュベーター内のデバイスを配置します。
- 卵巣がんスフェロイド形成
- 実験の前に37℃、5％CO 2下（5％FBSおよび100U / mLのペニシリン/ストレプトマイシンでMCDB105 M199）を5％FBS培地中のヒト上皮性卵巣癌細胞株SKOV-3を維持します。
- 煮沸して滅菌水に0.5％アガロースを溶解させます。 96ウェルプレートの各ウェルにアガロース溶液の50μLを分注します。アガロースが固化することを可能にするために20分間フード内でプレートを残します。アガロースウェルをコーティング固化する細胞接着を防止し、板が使用可能であることを示すことができます。
- PBS 3mLでSKOV-3細胞をすすぎます。 3分間のTE溶液2mLでトリプシン処理。 5％FBS培地4mLで中和し、5分間千×gで細胞をスピンダウン。
- 血球計数器でSKOV-3細胞数をカウントし、5,000細胞/ mLの密度で、5％FBS培地中で細胞を再懸濁。 Trの48時間、37℃で5％CO 2下の各アガロースでコーティングされたウェルと文化にansfer 200の細胞懸濁液μL。
- がんスフェロイドロード
- 無血清培地1mLで予め湿らせ、5分間750×gでスピンダウン50-mL遠心管にがんスフェロイドを転送します。
注：ピペットチップを事前に湿らせ、遠心分離管は、遠心分離管への望ましくない回転楕円体の付着を防止することができます。 - MCDB105培地：2.5μgの無血清M199中の5-クロロメチルジアセテート（CMFDA）の溶液/ mLのを準備します。 CMFDA溶液1mL中に再懸濁癌スフェロイドと37℃で30分間インキュベートします。 5分間、750×gで遠心分離します。
- 5分間750×gで無血清培地と遠心分離機の2 mLを有する癌スフェロイドをすすぎます。媒体から残りの蛍光色素を除去するために二回、この手順を繰り返します。
注：蛍光シグナルはより96時間スフェロイドに保持することができます。 - 癌を再懸濁し無血清M199中のスフェロイド：MCDB105培地とは、血球計数器との回転楕円体の数を数えます。無血清培地で2000スフェロイド/ mlに濃度を調整します。
- 回転楕円体のロードに先立って、ゆっくり無血清M199の100μLを注入：MCDB105培地は、チャンネルの内側に非付着した中皮細胞を洗い流します。
注：高速注入、吸引、または気泡形成は、中皮単層の剥離につながります。 - 各チャネルへの蛍光標識されたスフェロイドサスペンションの負荷30μL。 CO 2インキュベーターにマイクロ流体チップを置きます。
- 無血清培地1mLで予め湿らせ、5分間750×gでスピンダウン50-mL遠心管にがんスフェロイドを転送します。
- 潅流プラットフォームアセンブリと共培養
- 1メートルの長さのチューブにMCDB105培地：新鮮な無血清M199を搭載した注射器を取り付けます。
- シリンジポンプにシリンジを置き、プランジャと注射器の本体を固定します。インキュベーター内部のマイクロ流体チップと同じ高さに水平にシリンジポンプをインストールします。
NOTE：注射器の数と大きさは、使用するチャネル数と実験期間に依存します。 - 媒体がチューブをオーバーフローするまで迅速に早送りボタンを押し続けて培地でチューブ全体を注入。
- 所望の流量で注入を実行します。以下の式を使用して、壁せん断応力を推定します。
τは壁せん断室、Ǫ=流量内部応力、μ=粘度（0.01グラムCMS -1）を表し; H =フローチャンバーの高さ、およびW =フローチャンバ幅。 - チャネルの入口にチューブを接続します。チャネルに注入する前に、媒体が暖められることを保証するために、インキュベーター内で過剰入口チューブを置きます。チューブとチャネルとの間の接続を容易にするために、適切なコネクタを選択することができます。注：syrinに任意の気泡を導入しないことに注意してくださいGE、チューブ、および接続。
- 短い出力管と流出媒体を収集するために50-mLコニカルチューブにチャネルの出口を接続します。
注：完全な動的な共培養系は、 図1Dに示されています。
灌流後のHPMCとがんスフェロイドの4観測
- 明視野または蛍光顕微鏡でのHPMCとがんスフェロイドを観察し、灌流の1時間後に写真を撮ります。
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Representative Results
このプロトコルを使用して、マイクロ流体プラットフォームは、流体力学的条件の下で中皮細胞と卵巣癌のスフェロイドをモデル化するために設立されました。初代ヒト腹膜中皮細胞を16時間、マイクロデバイスで培養し、明視野顕微鏡下で観察しました。 図2Aに示すように、チャネルの底部が正常のHPMCの単層で覆われていました。フィブロネクチンまたはHPMCのパターニング時の気泡形成は、チャネルコーティングの失敗につながることに注意することが重要です。非接着性懸濁培養を通じて、患者の腹水中に見られるものと大きさが似ている約100μmの直径を持つ多細胞スフェロイドは、生成されたと緑色蛍光色素、CMFDAで標識しました。スフェロイドは、次いでHPMCでコーティングされたマイクロ流体チャネルに転送され、懸濁液中に残りました。細胞形態を顕微鏡下で観察し、画像が捕捉された（ 図2B）。蛍光標識癌スフェロイドを容易に蛍光顕微鏡（ 図2C）の下で中皮細胞と区別することができます。
図1.モデル卵巣癌多細胞スフェロイドの行動のためのAダイナミックな3D腹膜マイクロデバイス。 （A）フロー条件の下でのHPMCとの共培養卵巣癌スフェロイドに使用されるマイクロ流体チップの模式図。 （B）マイクロ流体チャネルの設計を示す模式図。 （C）明確な可視化のための染料溶液を注入し、そのチャンネルのプロトコルで使用されるマイクロ流体チップの写真、。バー= 1 cmです。 （D）実験を示す写真。 拡大版のOを表示するには、こちらをクリックしてください。この図F。
卵巣がんスフェロイド、中皮細胞の動的共培養モデルの2イメージ図。 （A）マイクロ流体チャネルで成長したHPMC単層のイメージ。 （B）位相差顕微鏡（左パネル）または（C）蛍光顕微鏡（グリーンCMFDA;右パネル）の下に腹膜中皮細胞で被覆されたマイクロ流体チャネルにおける卵巣癌スフェロイドの写真。バー=100μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このアッセイは、接着アッセイ、中皮クリアランスアッセイ、および薬物スクリーニングを含むがこれらに限定され、ではなく、様々な生化学的および細胞ベースのアッセイを用いて配合することができる生理的に柔軟で、関連するモデルを提供しています。これは、癌の進行に腹腔内微小環境の影響の評価に適用することができます。しかし、いくつかの実験条件は、プロジェクトの目的に応じて、最適化する必要があるかもしれません（ 例えば、チャネル、共培養時間等当たりの播種のHPMCとがんスフェロイドの数）。例えば、線維芽細胞、内皮細胞、または免疫細胞などの腹腔内微小環境における他の細胞型もまた、卵巣癌のスフェロイドと近隣の細胞との間の本質的な相互作用を研究するために、システムに含めることができます。例えばラミニン、ビトロネクチン、またはコラーゲンなどの他のECM成分を使用することもできます。考慮される必要があり、このプロトコルの一つの弱点は、しばらく、ということです栄養補給とせん断応力のカップリングは、 生体内で見られるものを彷彿とさせる、私たちの現在のシステムでの栄養補給とせん断応力のない独立した制御はありません。また、例えば蛍光活性化細胞選別と組み合わせたオンチップトリプシン処理のような技術は、別々のセルの異なるタイプについての分子的研究のために卵巣癌細胞とのHPMCを収集するために必要とされます。
従来のアプローチと比較した場合、この技術はいくつかの利点を示します。まず、3D共培養より良い模倣卵巣癌細胞と中皮細胞との間の生体内細胞間コミュニケーション。第二に、細胞は、流体の流れの下で培養されるが、潜在的にin vivoでの状況12、13の代表である細胞応答を生成し、静止状態ではありません。また、流体の流れを正確hydrodynamiを模倣し、制御することができます腫瘍進行の異なる段階でのC条件。
要約すると、ここで紹介するダイナミックな3D卵巣癌中皮共培養モデルは、腹腔内のモデリング腫瘍行動のための柔軟なフレームワークを提供します。このモデルでは、動的な流体力学的条件下で癌細胞及び中皮細胞との相互作用を総合的に分析することができます。それは非常に転移進行の基礎となるメカニズムの理解を進めることができ、また、治療の開発を促進する可能性があります。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、香港研究助成評議会（助成金17122014、C1013-15G、719813E、および17304514）によってサポートされていました。 ASTウォンはクラウチャー上級研究フェローシップの受領者です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafer | University wafer | #1196 | 100 mm |
| SU-8 2075 photoresist | Microchem | ||
| SU-8 developer | Microchem | 108-65-6 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 1673921 | Polydimethylsiloxane (PDMS) + curing agent kit |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31AA | 1 mm diameter |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Polyethylene tubing | SCI | BB31695-PE/5 | 0.86 mm (inner diameter) |
| Syringe | Terumo | ||
| Syringe pump | Longer precision pump | LSP01-2A | |
| Medium 199 | Invitrogen | 31100-035 | Add 2.2 g/L sodium bicarbonate |
| MCDB 105 Medium | Sigma | M6395 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30068.02 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Trypsin EDTA solution | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin - 0.01% EDTA, phenol red |
| Fibronectin human | BD | 354008 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| 5-chloromethylfluorescein diacetate | Life technologies | C7025 | Green CMFDA |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-18AIC | |
| Centrifuge | Hitachi | CT15RE | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Model: 80i or ECLIPSE Ti; software: SPOT | |
| SKOV-3 | Gift from Dr. N Auersperg (University of British Columbia) |
References
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