Summary
생리 관련 모델에서 난소 종양의 진행을 연구하기 위해, 다세포 회전 타원체는 시뮬레이션 된 유체의 흐름에 따라 마이크로 디바이스에서 배양 하였다. 이 동적 3D 모델은 난소 암 전이가 발생 셀룰러 및 기계 부품과 복강 환경을 에뮬레이트합니다.
Abstract
난소 암은 일반적으로 악성 복수에서 발견 된 종양 분야와 광범위한 복막 전이 특징으로한다. 이것은 가난한 임상 결과와 관련, 현재 효과적인 치료가 부족합니다. 모두 3 차원 환경과 동적 기계적 힘이 전이성 캐스케이드에서 매우 중요한 요소이다. 그러나, 기존의 세포 배양이 자연 종양 미세 환경 요점을 되풀이하지 못한다. 따라서, 복강 환경을 에뮬레이션 할 수 있습니다 생체 -like 모델은 분명 중요하다. 이 연구에서, 복막의 새로운 미세 전이 플랫폼 동안 복강 난소 암 타원체의 상황을 모방하기 위해 설립되었다. 비 - 부착 성 조건하에 생성 된 난소 암 타원체는 생리 학적으로 관련이 전단 응력을 실시 복막 중피 세포로 코팅 된 미세 채널에서 배양 하였다. 요약하면,이 역동적 인 3D 난소 암 mesothelium 마이크rofluidic 플랫폼은 기본 암 생물학에 새로운 지식을 제공하고 잠재적 인 약물 검사 및 개발을위한 플랫폼 역할을 할 수 있습니다.
Introduction
난소 암은 부인과에서 가장 치명적인 암이며 널리 보급 복막 악성 복수 형성 한 것을 특징으로한다. 이 광범위한 복막 전이 주요 임상 도전을 나타내고 빈약 한 임상 결과와 연결되어 있습니다. 혈액을 통해 전이 가장 단단한 암과는 달리, 난소 암은 주로 복강 내에서 발신. 종양 세포는 전이 (2)의 과정에서와 같은 다세포 응집체 / 타원체 존재한다. 현탁 배양은 줄기 난소 암 / 종양 세포를 풍부하게 개시 할 수 있다는 사실이 상기 스페 로이드는 모두 종양의 공격성과 연관 chemoresistance 3,4- 향상 될 수 있음을 시사한다. 아마도 다른 분자 메커니즘 5가 2D 및 3D 문화 사이의 약물 반응에 차이가 있습니다.
_content는 ">는 mesothelium에 필수적인 상호 작용은 난소 종양 진행에 대한 기본 미세 환경을 구성한다.이 중피 세포를 피브로넥틴은 유비쿼터스 성분 인 세포 외 기질 (ECM)에 거짓말. 증가 중피 세포 유래 피브로넥틴의 표현 사이의 링크를 종양의 진행을 도시하고있다. 피브로넥틴 악성 복수 (6, 7)에 풍부하게 존재한다. 난소 암 세포는 또한 초기 난소 암 전이 (8)을 촉진하기 위해 중피 세포에서 파이브로 넥틴의 분비를 유도 할 수있다.증거 신흥 전단 응력을 포함한 기계적 자극, 세포 형태, 유전자 발현을 조절하고, 따라서, 종양 세포를도 9,도 10,도 11의 표현형 수 있음을 보여준다. 악성 복수로 개발 및 t 동안 축적umor 진행성 난소 종양 세포는 유체 유동하고, 생성 된 전단 응력에 노출된다. 그룹의 수는 우리가 포함 골격 변형, 상피 간 간엽 전환 및 암 stemness 12, 13, 14, 15을 포함하여, 난소 암의 진행에 대한 전단 응력의 영향을 보여준다. 따라서, 생리 학적으로 관련 미세 종양 복막 전이의 조사를 위해 중요하다. 그러나, 현재의 체외 배양 유체 시스템은 일정한 낮은 생리 학적 관련성 전단 응력 16, 17, 18, 19를 모방하고 제어하는 방법에 제한이있다. 체외에서 기존 여전히 제한되어 세포 또는 기계적 환경 중 하나에 초점을 맞추고 접근적절한 생리 학적 관련성과 복강 내 미세 환경의 복잡성을 흉내 낸.
여기서, 종래의 전략의 한계를 극복하고, 암전의 복강 구획 연구를 진행하는 복막의 새로운 모델을 설계하기 위해서는, 제어 된 유체 유동을 가진 3 차원 미세 기반 플랫폼을 설계 하였다. 이 모델에서, 난소 암 타원체 연속 유체 흐름 (도 1a) 아래에 미세 유체 칩 차 인간 복막 중피 세포와 공동 배양 하였다. 중피 세포를 피브로넥틴에 도금했다. 비 - 부착 성 난소 암 타원체는 시린지 펌프에 의해 관류 연속 유동 매질과 미세 유체 채널로 접종 하였다. 3 차원 환경과 동적 기계적 힘 모두 전이성 캐스케이드 매우 중요한 요인이다. 이 플랫폼은 복잡한 CEL의 관점에서 복강 미세 조사를 위해 사용될 수있다뿐만 아니라 동적 기계적 큐에 관해서적인 다공질 공동 배양 상호 작용.
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Protocol
1. 미세 유체 장치 설계 및 제작
- 미세 유체 마스터 디자인
- 디자인은 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 소프트웨어를 사용하여 미세 유체 채널 패턴을 그린다.
주 : 일반적으로, CAD 도면은 포토 마스크를 제조하는 마스크 회사에 전송 될 수있다. 미세 유체 설계는 3 개의 동일한 병렬 채널, 다음과 같은 크기와 각 구성 : 4 mm μm의 250 × mm 25 × (폭 × 높이 × 길이)와 떨어져 2mm를 설정합니다. 두 채널이 종료 된 액체 입구와 출구 (그림 1B)를 용이하게하기 위해 127 ° 각도로 설계되었다. 이 프로토콜에서 사용되는 채널이 이전에 발행 (13)에보고되었다. - 15 분마다 아세톤, 이소프로판올 초음파 처리 (500 W / 42 KHZ), 탈 이온수로 상기 실리콘 웨이퍼를 세척 하였다. 압축 된 질소 가스는 웨이퍼를 건조. 15 분 완전히 건조에 250 ° C에서 핫 플레이트에 실리콘 웨이퍼를 가열그것.
- 스핀 코트 1800 rpm의 회전 속도로 실리콘 웨이퍼 상 (125 μm의 두께) SU-8 2075 포토 레지스트 층을 포함한다. 합니다 (SU-8 제품 설명서에 따라), 각각 5 및 25 분 동안, 과량의 용매를 제거하고, 65 ℃로 한 후 95 ℃의 핫 플레이트 상에 직접 레지스트 코팅 된 웨이퍼를 굽는다.
- 3 단계를 반복 스핀 코팅 SU-8 2,075 포토 레지스트의 또 다른 층은 250 ㎛의 최종 두께을 얻었다. 7 분 동안 65 ℃에서 핫 플레이트 상에 직접 레지스트 - 코팅 된 웨이퍼 베이크 한 다음 30 분 동안 95 ° C에서. 천천히 실온까지 웨이퍼를 냉각. 압축 공기로 냉각하지 마십시오.
- 정렬 및 웨이퍼 위에 직접 포토 마스크를 넣어. 패턴 가교 20 초 동안 UV 광에 노출.
- 65 ° C에서 포토 레지스트와 웨이퍼, 5, 12 분 동안 핫 플레이트에 95 ° C 구워 각각합니다 (SU-8 제품 설명서에 따라) 중합 용매를 제거합니다. 그 후, 웨이퍼를 냉각실온.
- 25 분 동안 SU-8 개발자의 웨이퍼를 침지하여 비가 교 포토 레지스트를 제거합니다. 이소프로판올로 웨이퍼를 씻어 압력을 공기로 건조.
참고 : 이소프로판올로 세척 불완전 개발을 표시 할 때 우유 용액이 관찰 된 경우, 긴 개발 시간 SU-8 개발에 다시 웨이퍼를 담가. - 10 분 잠재적 인 균열 패턴을 치유하는 180 ° C에서 뜨거운 접시에 웨이퍼를 놓습니다. 핫 플레이트를 끄고 천천히 핫 플레이트에 두어 실내 온도로 웨이퍼를 냉각.
- 유리 병 모자 트리클로로 (1H, 1H, 2H, 2H-퍼플 루오로 옥틸) 실란을 몇 방울을 추가합니다. 진공 데시 케이 터에서 병 뚜껑을 넣습니다. 10 분 동안 웨이퍼를 silanization합니다하기 위해 병 뚜껑 옆에 웨이퍼를 놓습니다.
- 디자인은 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 소프트웨어를 사용하여 미세 유체 채널 패턴을 그린다.
- PDMS 칩 제조
- 홀더를 만들기 위해 알루미늄 호일로 웨이퍼 감싸.
- 1 질량 비율 : 10의 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)베이스와 경화제를 혼합혼합 및 탈기 기능에서 원심 믹서. 약 5 mm의 높이로 웨이퍼 상에 천천히 PDMS 액을 붓는다. 40 분 동안 진공 하에서 탈기를 PDMS. 2 시간 동안 65 ° C의 오븐에서 PDMS 큐어.
- 조심 마스터 오프 PDMS 슬래브를 박리하고 유리 슬라이드의 크기까지의 채널을 따라 PDMS 트림. 장치의 입구와 출구를 만들 수있는 1-mm 생검 펀치와 PDMS를 펀치.
- 먼지와 PDMS 파편을 제거하기 위해 압축 공기 및 접착 테이프와 PDMS 표면을 청소합니다.
- 채널 측이 플라즈마 클리너로, 위쪽으로 향하도록 PDMS의 슬래브를 놓습니다. PDMS의 슬래브와 함께 플라즈마 클리너로 청소 유리 슬라이드를 놓습니다.
- 1 분 동안 높은 RF 레벨에서 공기 플라즈마에서 PDMS와 유리 슬라이드를 취급합니다. 비가 역적 공유 결합을 생성하기 위해 유리 슬라이드에 PDMS를 바인딩합니다.
- 접합 강도를 향상시키기 위해 1 시간 동안 150 ℃에서 핫 플레이트상의 PDMS 칩을 놓고 hydrop를 반환사용하기 전에 PDMS의 hobicity.
2. 시드 차 복막 중피 세포와 미세 유체 칩 (HPMCs)
- 미세 유체 채널의 피브로넥틴 코팅
- 75 %의 에탄올을 30 μL와 미세 유체 채널을 소독. 에탄올을 제거하고 피펫 팁을 사용하여 멸균 인산 완충 생리 식염수 30 μL (PBS)로 두 번 씻어. 철저히 채널에서 PBS를 대기음.
주 : 오염을 최소화하기 위해, 미세 세포 배양 신중 층류 후드의 사용을 통해 완전히 무균 조건 하에서 수행되어야한다. - MCDB105 (1 : 1) 매체 무 혈청 M199에서 10 μg의 / ML의 피브로넥틴 솔루션을 준비합니다. 기포 형성을 방지하기 위해 특별한주의를 상하 용액을 피펫. 소용돌이하지 마십시오.
- 천천히 피브로넥틴 용액 30 μL 각 채널을 입력합니다. 테이프로 채널을 밀봉하고 4 ℃에서 하룻밤 칩을 품어.
- 75 %의 에탄올을 30 μL와 미세 유체 채널을 소독. 에탄올을 제거하고 피펫 팁을 사용하여 멸균 인산 완충 생리 식염수 30 μL (PBS)로 두 번 씻어. 철저히 채널에서 PBS를 대기음.
- 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 배지에서 배양 HPMCs : 80 % 합류 할 때까지 37 ℃에서 5 % CO 2에서 (M199 MCDB105 10 % FBS, 100 U / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된).
- PBS의 3 mL를 HPMCs을 씻어 0.05 % 트립신 2 ㎖ / 30 초 동안 0.01 % EDTA (TE) 솔루션를 Trypsinize. 10 % FBS 배지 4 mL로 중화 5 분 동안 1,000 XG에서 세포를 스핀 다운.
- 10 % FBS 배지 2ml를 상기 HPMCs를 재현 탁. 혈구와 세포 수를 계산하고 3.5 × 106 / mL의 세포 농도를 조정합니다.
- 사용하기 전에 5 분 동안 37 ° C를 인큐베이터에서 피브로넥틴 코팅 된 미세 유체 칩을 따뜻하게. 완전히 피브로넥틴 용액 대기음.
- 천천히 각 채널에 HPMC 현탁액의 30 μL를 피펫. 테이프로 채널을 밀봉하고 하룻밤 CO 2 배양기에서 장치를 배치합니다.
- 난소 암 타원체 형성
- 실험 전에 37 ℃에서 5 % CO 2 미만, (5 % FBS, 100 U / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신 MCDB105 M199) 5 % FBS 배지에 인간 난소 암 세포주 SKOV-3을 유지한다.
- 끓는 소독 물에 0.5 % 아가 로스를 녹여. 96 웰 플레이트의 각 웰에 아가 용액을 50 μL 분주. 아가로 오스가 고형화 할 수 있도록 20 분 동안 후드에있는 접시를 남겨; 우물은 세포 부착을 방지 할 수 있습니다 코팅 응고 아가로 오스는 플레이트를 사용할 준비가되어 있음을 나타냅니다.
- PBS 3 mL로 SKOV-3 세포를 씻어. 3 분 TE 용액 2 mL로를 Trypsinize. 5 % FBS 배지 4 mL로 중화 5 분 동안 1,000 XG에서 세포를 스핀 다운.
- 혈구와 SKOV-3 세포 수를 계산하고 5000 세포 / ㎖의 밀도로 5 % FBS 배지에서 세포를 재현 탁. TR각각에 세포 현탁액 ansfer 200 μL을 48 시간 동안 37 ℃에서 5 % CO 2하에 웰 배양 아가는 코팅.
- 암 회전 타원체로드
- 50 mL의 원심 분리 튜브 혈청 배지 1 ㎖의 사전 - 습윤에 암 타원체를 전송하고 5 분 동안 750 XG에서 스핀 다운.
참고 : 피펫 팁을 전 습윤 및 원심 분리기 튜브는 원심 분리기 튜브 상 바람직하지 않은 회전 타원체의 부착을 방지 할 수 있습니다. - 무 혈청 M199에 5 chloromethylfluorescein 디 아세테이트 (CMFDA) 솔루션의 2.5 μg의 / mL로 준비 : MCDB105 매체를. CMFDA 용액 1 ㎖에 재현 탁 암 타원체와 30 분 동안 37 ℃에서 배양한다. 5 분 동안 750 XG에 원심 분리기.
- 5 분 동안 750 XG에서 무 혈청 배지 원심 2 mL를 암 타원체 린스. 매체에 남아있는 형광 염료를 제거하기 위해 두 번이 단계를 반복합니다.
주 : 형광 신호보다 96 시간 동안 회전 타원체로 유지 될 수있다. - 암 재현 탁무 혈청 M199의 회전 타원체 : MCDB105 매체와는 혈구와 회전 타원체 수를 계산합니다. 무 혈청 배지로 000 타원체 / ㎖의 농도를 조정한다.
- 채널 내부에 비 부착 중피 세포를 씻어 MCDB105 배지 : 서서히 로딩 타원체 무 혈청 M199 100 μL를 주입하기 이전.
참고 : 빠른 주사, 흡입, 또는 거품 형성은 중피 단일 층의 분리로 이어질 것입니다. - 각 채널에 형광 표지 된 회전 타원체 현탁액의 부하 30 μL. 이산화탄소 배양기에 미세 유체 칩을 놓습니다.
- 50 mL의 원심 분리 튜브 혈청 배지 1 ㎖의 사전 - 습윤에 암 타원체를 전송하고 5 분 동안 750 XG에서 스핀 다운.
- 관류 플랫폼 조립 및 공동 문화
- 1 M-긴 튜브 MCDB105 매체 : 신선한, 무 혈청 M199로드 주사기를 연결합니다.
- 주사기 펌프의 주사기를 배치하고, 플런저와 주사기 본체를 고정. 배양기 내부의 마이크로 유체 칩과 동일한 높이에서 수평 위치에서 주사기 펌프를 설치한다.
엔OTE는 : 개수 및 주사기의 크기는 사용 채널 수 및 실험 기간에 의존한다. - 빠르게 눌러 매체가 튜브를 오버 플로우 때까지 빨리 감기 버튼을 길게 매체와 전체 튜브를 주입.
- 원하는 유량의 주입을 실행. 다음 식을 사용하여 벽 전단 응력을 측정 :
τ는 벽 전단 챔버, Ǫ = 유량 내부 응력 μ = 점도 (0.01 g CMS -1)을 나타내고; 시간 = 유량 용기의 높이 및 w = 흐름 챔버의 폭입니다. - 채널의 입구에 튜브를 연결합니다. 매체가 전 채널에 주입 가온 수 있도록 인큐베이터의 과잉 입구 튜브를 배치합니다. 튜브 및 상기 채널 사이의 연결을 용이하게하기 위해, 적절한 커넥터가 선택 될 수있다. 참고 : syrin 모든 거품을 소개하지 조심GE, 배관 및 연결.
- 짧은 출력 튜브 유출 매체를 수집하기 위해 50 ML 원뿔 튜브에 채널의 출구를 연결합니다.
참고 : 전체 동적 공동 배양 시스템은 그림 1D에 표시됩니다.
관류 후 HPMCs 및 암 회전 타원체 4. 관측
- 밝은 필드 또는 형광 현미경으로 HPMCs 암 회전 타원체를 관찰하고 관류 1 시간 후 사진을 촬영.
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Representative Results
이 프로토콜을 이용하여 미세 유체 플랫폼은 유체 역학적 조건 중피 세포 난소 암 타원체를 모델링하기 위해 설정되었다. 차 인간 복막 중피 세포는 16 시간을위한 마이크로 디바이스에서 배양하고, 명 시야 현미경으로 관찰 하였다. 도 2a에 도시 된 바와 같이, 채널 하부 성공적 HPMCs의 단층으로 덮었다. 이는 채널 코팅 실패로 이어질 피브로넥틴 또는 HPMC 패터닝 동안 그 기포 형성을 주목하는 것이 중요하다. 비 접착 현탁 배양을 통해 환자의 복수에있는 것과 비슷한 크기입니다 약 100 μm의 직경을 가진 다세포 회전 타원체는 생성 된 녹색 형광 염료, CMFDA으로 표시. 타원체는 HPMC 코팅 된 미세 유체 채널에 옮기고 현탁액에 남아 있었다. 셀 모폴로지는도 2 (현미경 관찰 및 이미지 캡처 된B). 형광 표지 된 암 타원체 용이 형광 현미경 (도 2c) 아래 중피 세포로부터 구별 할 수있다.
그림 1. 모델링 난소 암 다세포 회전 타원체 동작을위한 동적 3D 복막 마이크로 디바이스. (A) 유동 조건 HPMCs 난소 암 타원체를 배양을 공동 사용되는 마이크로 유체 칩의 개략도. (B) 미세 유체 채널의 설계를 도시 한 개략도. 명확한 시각화를위한 염료 용액 주입의 채널 프로토콜에 사용되는 미세 유체 칩 (C) 사진. 바 = 1cm. 실험 설정을 보여주는 (D)의 사진. 더 큰 버전 O를 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림 F.
난소 암 회전 타원체-중피 세포의 동적 공동 문화 모델 2. 이미지를 그림. 미세 유체 채널의 재배 HPMC 단층의 (A) 이미지. (B) 위상차 현미경 (좌측 패널) 또는 (C) 형광 현미경 (녹색, CMFDA; 오른쪽 패널) 이하 복막 중피 세포로 코팅 된 미세 유체 채널의 난소 암 타원체 이미지. 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 분석은 접착 분석, 중피 통관 분석, 약물 검사, 제한 등의 다양한 생화학 및 세포 기반 분석과 통합,하지만 할 수있는 유연하고 생리 학적으로 관련 모델을 제공합니다. 이것은 암 진행에 복강 내 미세 환경의 영향의 평가에 적용 할 수있다. 그러나, 여러 실험 조건은 프로젝트의 목적에 따라 최적화 할 수있다 (예를 들어, 채널, 공동 배양 시간 등 당 시드 HPMCs 암 타원체의 수). 이러한 섬유 아세포, 내피 세포 또는 면역 세포로 복강 내 미세 환경에서 다른 세포 유형은 또한 난소 암 타원체와 주변 셀 간의 중요한 상호 작용을 연구하기 위해 시스템에 포함될 수있다. 이러한 라미닌, 비트로 넥틴, 콜라겐과 같은 다른 ECM 성분이 사용될 수도있다. 고려 될 필요가있다이 프로토콜의 하나의 약점은, 그 동안영양 보충 및 전단 응력의 결합은 생체 내에서 본 그 연상, 우리의 현재 시스템에서 영양 보충과 전단 응력의 별도의 제어가 없습니다. 또한, 이러한 형광 - 활성화 세포 분류와 함께 온칩 트립신과 같은 기술은 개별적 세포의 다른 유형의 관련 분자 연구에 난소 암 세포 HPMCs를 수집하기 위해 필요한 것이다.
전통적인 접근법에 비해이 기술은 여러 가지 장점을 나타낸다. 먼저 3D 공 배양 잘 모방 난소 암 세포 중피 세포의 생체 내 간 통신. 둘째, 세포가 유체 유동에서 배양이지만 잠재적으로 생체 내 상황 (12), (13)의 대표적인 셀룰러 응답을 생성하는 정적 인 상태로된다. 또한, 상기 유체 흐름은 정확하게 hydrodynami을 모방 제어 할 수있다종양 진행의 다른 단계에서 C 상태.
요약하면, 여기에 제시된 동적 3D 난소 암 mesothelium 공동 문화 모델은 복강의 모델링 종양 행동을위한 유연한 프레임 워크를 제공합니다. 이 모델을 통해 동적 역학적 조건 하에서 암세포 중피 세포 간의 상호 작용은 종합적으로 분석 할 수있다. 그것은 크게 전이성 진행의 기본 메커니즘에 대한 우리의 이해를 발전 할 수 있고 또한 치료 개발을 촉진 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 작품은 홍콩 연구 보조금위원회에 의해 지원되었다 (보조금 17,122,014, C1013-15G, 719813E 및 17,304,514). AST 웡은 Croucher 수석 연구 활동의받는 사람입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafer | University wafer | #1196 | 100 mm |
| SU-8 2075 photoresist | Microchem | ||
| SU-8 developer | Microchem | 108-65-6 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 1673921 | Polydimethylsiloxane (PDMS) + curing agent kit |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31AA | 1 mm diameter |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Polyethylene tubing | SCI | BB31695-PE/5 | 0.86 mm (inner diameter) |
| Syringe | Terumo | ||
| Syringe pump | Longer precision pump | LSP01-2A | |
| Medium 199 | Invitrogen | 31100-035 | Add 2.2 g/L sodium bicarbonate |
| MCDB 105 Medium | Sigma | M6395 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30068.02 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Trypsin EDTA solution | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin - 0.01% EDTA, phenol red |
| Fibronectin human | BD | 354008 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| 5-chloromethylfluorescein diacetate | Life technologies | C7025 | Green CMFDA |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-18AIC | |
| Centrifuge | Hitachi | CT15RE | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Model: 80i or ECLIPSE Ti; software: SPOT | |
| SKOV-3 | Gift from Dr. N Auersperg (University of British Columbia) |
References
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