Summary
fizyolojik olarak ilgili model yumurtalık tümör progresyonunu incelemek için, çok hücreli küreler simüle sıvı akışı altında microdevice kültürlenmiştir. Bu dinamik 3D modeli yumurtalık kanseri metastazı meydana hücresel ve mekanik bileşenleri ile intraperitoneal ortamı benzetilmiştir.
Abstract
Yumurtalık kanseri sık malign asit bulunan tümör küreler ile geniş periton metastazı ile karakterizedir. Bu kötü klinik sonuçlarla ilişkili ve halen etkin bir tedavi yoksun. Hem üç boyutlu (3D) çevre ve dinamik mekanik kuvvetler bu metastatik kaskad çok önemli faktörlerdir. Ancak, geleneksel hücre kültürleri bu doğal tümör mikro özetlemek için başarısız. Böylece, periton ortamı taklit in vivo benzeri modeller belirgin öneme sahiptir. Bu çalışmada, periton yeni bir mikroakışkan platformu metastaz sırasında periton boşluğuna yumurtalık kanseri sferoidler durumu taklit etmek için kurulmuştur. Bir yapışkan olmayan koşullar altında üretilen Yumurtalık kanseri sferoidler fizyolojik olarak ilgili kesme stresine maruz periton mezotel hücreleri ile kaplanmış mikroakışkan kanal kültürlenmiştir. Özetle, bu dinamik 3D yumurtalık kanseri-Mesothelium mikrofonrofluidic platformu temel kanser biyolojisi üzerine yeni bilgi vermek ve potansiyel ilaç tarama ve geliştirme için bir platform olarak hizmet verebilir.
Introduction
Yumurtalık kanseri en ölümcül jinekolojik kanser ve yaygın periton yaygınlaştırılması ve malign asit 1 oluşumu ile karakterizedir. Bu geniş periton metastazı önemli bir klinik zorluk temsil eder ve kötü klinik sonuçlarla ilişkilidir. kan yoluyla metastaz en sağlam karsinom aksine, yumurtalık kanseri başta periton boşluğuna içinde yaymaktadır. Tümör hücreleri metastaz 2 sürecinde olduğu gibi çok hücreli agrega / parçacıklarının var. Süspansiyon kültürü yumurtalık kanseri kök / tümör başlatılması hücreleri zenginleştirmek gerçeği ayrıca bu sferoidler iki tümörün agresif oluş ile ilişkili olan ve kemoterapi direncinin 3, 4 gelişmiş olabileceğini düşündürmektedir. Muhtemelen farklı moleküler mekanizmaları 5 var 2D ve 3D kültürler arasındaki ilaç yanıt farklılıklar vardır.
_content "> mesothelium ile temel etkileşim yumurtalık tümörü ilerlemesi için temel mikro oluşturur. Bu mezotel hücre fibronektin bir yerde kurucu olan bir hücre dışı matriks (ECM), üzerinde yalan. artan mezotel hücre kaynaklı fibronektin ifadesi arasındaki bir bağlantıyı tümör ilerlemesi gösterilmiştir. fibronektin malign asit 6, 7 bol miktarda mevcuttur. yumurtalık kanseri hücreleri, erken yumurtalık kanseri metastazı 8 teşvik etmek için mezotel hücreleri fibronektin salgılanmasını uyarabildiği.Kanıtlar ortaya çıkan kesme stresi dahil olmak üzere, mekanik uyarı, hücre morfolojisi, gen ekspresyonunu modüle eden ve bu nedenle, tümör hücresi 9, 10, 11 fenotipleri göstermektedir. malign asit gibi geliştirmek ve t sırasında birikirumor ilerlemesi, yumurtalık tümör hücreleri sıvı akışı ve ortaya çıkan kesme stresine maruz kalır. Bir çok grup,, bizim dahil hücre iskeleti modifikasyonlar, epitelyal-to-mezenkimal geçişler ve kanser stemness 12, 13, 14, 15 dahil olmak üzere, yumurtalık kanser oluşumunu kesme stresi etkilerini göstermiştir. Böylece, fizyolojik olarak ilgili mikro-tümör periton metastazı araştırmak için önemlidir. Bununla birlikte, mevcut in vitro hidrodinamik kültür sistemleri sürekli, düşük, fizyolojik ilgili kayma gerilmesi 16, 17, 18, 19 taklit ve kontrol sınırlamalar var. Vitro geleneksel hala sınırlıdır hücresel veya mekanik çevre ya odaklanan yaklaşımlarUygun fizyolojik alaka ile intraperitoneal mikroçevresinin karmaşıklığını taklit.
Burada, geleneksel stratejilerin sınırlamaları aşmak için ve kanser metastazı intraperitoneal bölmesinin çalışma ilerlemek için periton yeni bir model mühendisi için, kontrollü sıvı akışı ile 3D mikroakışkan tabanlı bir platform dizayn edilmiştir. Bu modelde, yumurtalık kanseri sferoidler, sürekli akışkan akışı (Şekil 1A) altında mikroakışkan fiş primer insan periton mezotel hücreleri ile birlikte kültürlendi. mezotel hücreleri fibronektin ekildi. Yapışkan olmayan yumurtalık kanseri sferoidler bir şırınga pompası ile perfüze sürekli akış ortamı ile mikroakışkan kanal içine ekilmiştir. 3D çevre ve dinamik mekanik kuvvetlerin hem metastatik kaskad çok önemli faktörlerdir. Bu platform, karmaşık cel açısından intraperitonal mikro-araştırmak için kullanılabiliryanı sıra, dinamik mekanik işaretlere ilişkin lular ve ortak kültürlenme etkileşimi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mikroakışkan Cihaz Tasarımı ve Üretimi
- Mikroakışkan ana tasarım
- Tasarım ve herhangi bir bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı ile mikroakışkan kanal deseni çizin.
NOT: Normalde, CAD-Çizimi photomask üretmek için bir photomask şirkete gönderilebilir. mikroakışkan tasarımı üç aynı paralel kanal, aşağıdaki boyutlara sahip, her oluşur: 4 mm ile 250 um x 25 mm x (genişlik x yükseklik x uzunluk) ve 2 mm aralıkla konulmuş. Her iki kanal uçları sıvı giriş ve çıkışları (Şekil 1B) kolaylaştırmak için 127 ° açılarla tasarlanmıştır. Bu protokolde kullanılan kanal önceki yayın 13 bildirilmiştir. - Her biri 15 dakika için aseton, izopropanol ultrasonikasyon (500 W / 42 kHz) ve iyonu giderilmiş su ile silikon gofret yıkayın. basınçlı nitrojen gazı ile gofret kurutun. 15 dakika tamamen kuruyana kadar 250 ° C'de bir sıcak plaka üzerinde silikon gofret Isıo.
- Spin-kaplama 1800 rpm'lik bir eğirme hızında silikon gofret üzerine (125 mikron kalınlığında) SU-8 2075 Fotorezist tabaka. (SU-8 ürün kılavuzuna göre), sırasıyla 5 ve 25 dakika süreyle, fazla çözücüyü yok etmek için, 65 ° C'de ve daha sonra 95 ° C'de bir sıcak plaka üzerinde, doğrudan fotorezist kaplı gofret fırında.
- Adım 3 ve eğirme kat SU-8 2075 Fotorezist bir kat 250 um'lik bir son kalınlığı elde edilmiştir. 7 dakika için 65 ° C'de bir sıcak plaka üzerinde, doğrudan fotorezist kaplı çok ince bisküvi fırınlama ve daha sonra 30 dakika boyunca 95 ° C 'de. Yavaş yavaş oda sıcaklığına soğumaya gofret. basınçlı hava ile soğutmak etmeyin.
- Hizalayın ve gofret üstüne doğrudan photomask koydu. desen çapraz bağlanması için 20 saniye süreyle UV ışınlarına maruz kalmaktadır.
- 65 ° C sıcaklıkta fotorezist ile gofret ve 5 ile 12 dakika boyunca bir sıcak plaka üzerinde 95 ° C'de pişirin, sırasıyla (SU-8 ürün kılavuzuna göre) polimerizasyonu için çözücünün ayrılması için. Daha sonra, gofretin soğumayaoda sıcaklığı.
- 25 dakika SU-8 geliştirici gofret daldırarak olmayan çapraz ışığa çıkarın. izopropanol ile gofret durulayın ve basınçlı hava ile kurutun.
NOT: izopropanol ile durulama eksik gelişimini gösteren zaman sütlü çözüm gözlendi ise, daha uzun bir geliştirme zamanı için SU-8 geliştirici geri gofret batırmayın. - 10 dk potansiyel çatlaklardan desen iyileşmesi için 180 ° C'de sıcak bir plaka üzerinde gofret yerleştirin. sıcak plaka kapatın ve yavaş yavaş sıcak plaka üzerinde bırakarak oda sıcaklığına gofret soğumasını.
- Bir şişe kapağı trikloro (1H, 1H, 2H, 2H-perflorooktil) silan, bir kaç damla ekleyin. Vakum desikatörde flakon kap koyun. 10 dakika için gofret Silanize flakon kapağının yanında gofret yerleştirin.
- Tasarım ve herhangi bir bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı ile mikroakışkan kanal deseni çizin.
- PDMS çip üretim
- Bir tutucu oluşturmak için alüminyum folyo ile gofret sarın.
- 1 kütle oranına: 10 de polidimetilsiloksan (PDMS) taban ve sertleştirici karıştırınkarıştırma ve gazını fonksiyon altında bir santrifüj mikser ile. yaklaşık 5 mm yüksekliğe kadar gofret üzerine yavaş yavaş PDMS karışımı dökün. 40 dakika boyunca vakum altında PDMS gazdan arındırın. 2 saat boyunca 65 ° C'de bir fırın içinde PDMS Cure.
- Dikkatle ana kapalı PDMS levha soyma ve bir cam slayt boyutu kadar kanallar boyunca PDMS kırpın. Cihazın giriş ve çıkışlarının oluşturmak için 1 mm biyopsi yumruk PDMS yumruk.
- toz ve PDMS enkaz kaldırmak için basınçlı hava ve yapışkan bant ile PDMS yüzeyi temizleyin.
- Kanal tarafı plazma süpürge içine, yukarı bakacak şekilde, PDMS levha yerleştirin. PDMS levha yanında plazma süpürge içine temiz bir cam slayt yerleştirin.
- 1 dakika boyunca yüksek RF düzeyinde hava plazması altında PDMS ve cam slayt davranın. geri dönüşü olmayan bir kovalent bağ oluşturmak için cam slayt PDMS bağlayın.
- yapışma gücünü artırmak için, 1 saat boyunca 150 ° C'de bir sıcak plaka üzerinde PDMS çip yerleştirilir ve hydrop dönmekKullanmadan önce PDMS hobicity.
2. Tohumlama Primer Periton Mezotelyal Hücreleri ile mikroakışkan Chip (HPMCs)
- mikroakışkan kanalların Fibronektin kaplama
- % 75 etanol içinde 30 uL mikroakışkan kanal sterilize edin. etanolü ortadan kaldırmak ve bir pipet ucu kullanılarak steril fosfat tamponlu tuz, 30 uL (PBS) ile iki kez yıkayın. İyice kanallarda PBS aspire.
NOT: kirlenmesini en aza indirmek için, mikroakışkan hücre kültürü dikkatli bir laminar akış başlığı aracılığıyla tamamen aseptik koşullar altında gerçekleştirilmelidir. - MCDB105 (1: 1) ortamı, serumsuz M199 bir 10 ug / ml fibronektin çözeltisi hazırlayın. kabarcık oluşumunu önlemek için özel bakım ile, yukarı ve aşağı çözüm pipetle. vorteks etmeyin.
- Yavaşça fibronektin solüsyonu 30 uL ile her kanalı doldurmak. bant ile kanal kapatılır ve 4 ° C'de bir gece inkübe çip.
- % 75 etanol içinde 30 uL mikroakışkan kanal sterilize edin. etanolü ortadan kaldırmak ve bir pipet ucu kullanılarak steril fosfat tamponlu tuz, 30 uL (PBS) ile iki kez yıkayın. İyice kanallarda PBS aspire.
- % 10 fetal sığır serumu (FBS) kültür ortamı içinde kültürü HPMCs:% 80 konflüense kadar 37 ° C 'de% 5 CO2 altında (M199 MCDB105% 10 FBS ve 100 U / ml penisilin / streptomisin ile takviye edilmiştir).
- 3 mL PBS ile durulayın HPMCs ve% 0.05 tripsin, 2 mL / 30 sn için,% 0.01 EDTA (TE) çözeltisi ile tripsinize edin. % 10 FBS kültür ortamının 4 ml ile nötralize edildi ve 5 dakika 1000 xg'de hücreleri aşağı doğru döndürün.
- % 10 FBS kültür ortamı 2 mL HPMCs yeniden süspanse edin. Bir hemasitometre ile hücre sayısını ve 3.5 × 10 6 / mL hücre konsantrasyonunu ayarlamak.
- kullanımdan önce 5 dakika için 37 ° C kuluçka makinesi içinde fibronektin kaplı mikroakışkan çip ısıtın. Tamamen fibronektin çözüm aspire.
- Yavaş yavaş her kanal içine HPMC süspansiyonu 30 mcL pipetle. Bant ile kanal Seal ve bir gecede CO 2 inkübatör cihazları yerleştirin.
- Yumurtalık kanseri sfero oluşumu
- Deney yapılmadan önce 37 ° C 'de% 5 CO2 altında: (% 5 FBS ve 100 U / ml penisilin / streptomisin ile MCDB105 M199)% 5 FBS kültür ortamı insan epitelyal yumurtalık kanseri hücre çizgisi SKOV-3 korur.
- kaynatılarak steril su içinde% 0.5 agaroz içinde çözülür. 96 oyuklu plakalar, her kuyuya agaroz çözeltisi 50 uL koyun. Agaroz katılaşmaya izin 20 dakika kaputu plakaları bırakın; kuyu hücre yapışmasını önlemek ve yapabilirsiniz kaplama katılaşmış agaroz plakalar kullanıma hazır olduğunu gösterir.
- 3 mL PBS ile SKOV-3 hücreleri durulayın. 3 dakika için TE çözeltisi 2 mL ile tripsinize edin. % 5 FBS kültür ortamının 4 ml ile nötralize edildi ve 5 dakika 1000 xg'de hücreleri aşağı doğru döndürün.
- hemositometre ile SKOV-3 hücre sayısını ve 5000 hücre / ml bir yoğunlukta% 5 FBS kültür ortamında tekrar süspansiyon hücreleri. TrHer bir hücre süspansiyonu ansfer 200 uL 48 saat boyunca 37 ° C'de,% 5 CO2 de altında kültür agaroz kaplanabilir.
- Kanser sfero yükleme
- 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne serumsuz ortam 1 ml ile ön ıslatmaya tabi kanser parçacıklarının aktarın ve 5 dakika boyunca 750 x g'de aşağı doğru döndürün.
NOT: pipet uçları Önceden ıslatılmış ve santrifüj tüpleri santrifüj tüplerine üzerine istenmeyen sfero eki önleyebilir. - serumsuz M199 5-chloromethylfluorescein diasetat (CMFDA) çözeltisi 2.5 ug / mL hazırlayın: MCDB105 ortam. CMFDA çözeltisi 1 mL içinde süspanse kanseri sferoidler ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. 5 dakika boyunca 750 x g'de santrifüjleyin.
- 5 dakika boyunca 750 x g'de serumsuz ortam ve santrifüj 2 mL kanser sferoidler durulayın. ortamdan kalan floresan boya kaldırmak için iki kez bu adımı yineleyin.
Not: flüoresan sinyal fazla 96 saat parçacıklarının muhafaza edilebilir. - kanser yeniden süspanseSerum serbest M199 içinde sferoidler: MCDB105 orta ve hemasitometre ile sfero sayısını. serumsuz ortam ile 2.000 sferoidler / ml konsantrasyon ayarlayın.
- kanallar içinde olmayan yapışık mezotel hücreleri yıkayacak MCDB105 orta: yavaş yavaş, yükleme Sfero serum serbest M199 100 mcL enjekte önce.
NOT: Hızlı bir enjeksiyon, aspirasyon veya kabarcık oluşumu mezotel tek tabaka dekolmanı yol açacaktır. - Her kanal içine floresan etiketli sfero süspansiyonu yük 30 uL. CO 2 kuvöz içine mikroakışkan çipi yerleştirin.
- 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne serumsuz ortam 1 ml ile ön ıslatmaya tabi kanser parçacıklarının aktarın ve 5 dakika boyunca 750 x g'de aşağı doğru döndürün.
- Perfüzyon platformu montaj ve ko-kültür
- 1 m uzunluğunda tüp MCDB105 ortam taze, serumsuz M199 ile yüklenen bir şırınga takın.
- şırınga pompası şırınga yerleştirin ve pistonu ve şırınga gövdesini sabitleyin. inkübatör içinde mikroakışkan çip ile aynı yükseklikte yatay konumda şırınga pompasını takın.
NOT: numarası ve şırınga büyüklüğü kullanılan kanal sayısı ve deney süresine bağlıdır. - Hızla basarak ve orta boru taşmaları kadar hızlı ileri düğmesini basılı tutarak orta ile tüm tüp demlenmeye.
- İstenen akış hızında enjekte çalıştırın. aşağıdaki denklem kullanılarak duvar kayma gerilmesi tahmin:
τ duvar kayma odasının,, ∈ = akış hızı içinde stres, μ = viskozitesi (0.01 gr cm -1) temsil eder; h = akış odasının yüksekliği ve w = akış odası genişliği. - kanal girişine boru bağlayın. Orta önce kanal içine enjekte edilen ılıtılır sağlamak için inkübatör fazla giriş boru yerleştirin. boru ve kanal arasındaki bağlantı sağlamak için, uygun bağlayıcılar seçilebilir. NOT: enjektörler herhangi kabarcık tanıtmak için dikkatge, boru ve bağlantıları.
- Kısa bir çıkış borusu ile çıkış ortamı toplamak için bir 50-ml konik tüp kanalın çıkışını bağlayın.
NOT: Tüm dinamik ko-kültür sistemi Şekil 1D gösterilmiştir.
Perfüzyondan sonra HPMCs ve Kanser küremsi 4. Gözlem
- parlak-alan veya floresan mikroskop ile HPMCs ve kanser parçacıklarının gözlemlemek ve perfüzyon 1 saat sonra fotoğraf çekmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolü kullanarak, bir mikroakışkan platformu hidrodinamik koşullar altında mezotel hücreleri ile yumurtalık kanseri sferoidler modellemek için kurulmuştur. Primer insan periton mezotel hücreleri 16 saat microdevice kültürlendi ve parlak alan mikroskop altında gözlemlenmiştir. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, kanal alt başarılı HPMCs bir tek tabaka ile kaplandı. Kanal kaplama yetmezliğine yol açacaktır fibronektin veya HPMC desen sırasında kabarcık oluşumunu dikkat etmek önemlidir. yapışmayan süspansiyon kültürü ile, hasta asit bulunanlara benzer boyutta olan yaklaşık 100 um çapında olan çok hücreli küreler oluşturulur ve yeşil floresan boya, CMFDA ile etiketlenmiş. sferoidler sonra HPMC kaplı mikroakışkan kanallara transfer ve süspansiyon kalmıştır. Hücre morfolojisi Şekil 2 (mikroskop altında gözlendi ve görüntüleri ele geçirildiB). Floresan etiketli kanser sferoidler kolayca floresan mikroskop (Şekil 2C) altında mezotel hücrelerinden ayırt edilebilir.
Şekil 1. Modelleme Yumurtalık Kanseri Multisellüler Sfero Davranışları için Dinamik 3D Periton mikrocihazda. (A) akım koşullarında HPMCs ile yumurtalık kanseri sferoidler kültür işbirliği için kullanılan bir mikroakışkan çip şeması. (B) mikroakışkan kanalların tasarımı gösteren şematik diyagramı. Net bir görünüm için boya çözeltisi ile aşılanmış olan kanalları protokolünde kullanılan bir mikro-akışkan çip (C) Fotoğraf. Çubuk = 1 cm. Deney düzeneği gösteren (D) Fotoğraf. Daha büyük bir sürüm o görmek için lütfen buraya tıklayınızBu rakam f.
Yumurtalık Kanseri Sfero-mezotel hücre Dinamik Co-kültür Modelinin 2. Görüntüleri Şekil. Mikroakışkan kanal yetiştirilen HPMC tek tabaka (A) Görüntü. (B) faz kontrast mikroskobu (sol panel) veya (C) floresan mikroskobu (Yeşil, CMFDA; sağ panel) altında periton mezotel hücreleri ile kaplı mikroakışkan kanal yumurtalık kanseri sferoidler görüntüleri. Çubuk = 100 um. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu deney, yapışma tahlilleri, mezotel klirensi deneyleri, ve bunların ilaç tarama, bunlarla sınırlı olmamak üzere, çeşitli biyokimyasal ve hücre bazlı deneyler, ile dahil, ancak esnek bir ve fizyolojik açıdan ilgili bir model sunmaktadır. Bu kanser oluşumunu intraperitonal mikro etkisinin değerlendirilmesi için uygulanabilir. Ancak, birkaç deneysel koşullar projenin amaçları bağlı optimize edilmesi gerekebilir (örneğin, kanal, ko-kültür zaman, vb başına ekildi HPMCs ve kanser sferoidler sayısı). fibroblastlar, endotel hücreleri veya bağışıklık hücreleri gibi intraperitonal mikro diğer hücre tipleri, aynı zamanda yumurtalık kanseri parçacıklarının ve komşu hücreler arasındaki temel etkileşimler üzerinde çalışmak için sisteme dahil edilebilir. Bu laminin, vitronektin veya kollajen gibi diğer ECM bileşenleri, aynı zamanda kullanılabilir. dikkate alınması gerekebilir, bu protokolün biri zayıflık, o isebesin Yenileyici ve kayma gerilmesi bağlantı vivo görülen anımsatır, mevcut sistemde besin Yenileyici ve kayma gerilmesi ayrı kontrolü yoktur. Ayrıca, bu tür floresans ile aktive edilmiş hücre sıralama ile birlikte çip üzerinde tripsinizasyon gibi teknikler ayrıca farklı hücre tipleri ile ilgili daha fazla moleküler çalışmalar için yumurtalık kanseri hücreleri ve HPMCs toplamak için gerekli olacaktır.
geleneksel yaklaşımlara kıyasla Bu teknik birçok avantaj sergiler. İlk olarak, 3D ko-kültür daha iyi taklit yumurtalık kanseri hücreleri ve mezotel hücreleri arasındaki in vivo arası iletişim. İkinci olarak, hücreler akışkan akışı altında kültürlenir ama potansiyel olarak, in vivo bir durumda, 12, 13 için temsili bir hücresel yanıtı üreten statik durumda değildir. Bundan başka, akışkan akışı tam olarak hydrodynami taklit kontrol edilebilirTümör ilerlemesi farklı aşamalarında Cı koşulları.
Özetle, burada sunulan dinamik 3D yumurtalık kanseri-Mesothelium ko-kültür modeli periton boşluğuna modelleme tümör davranışı için esnek bir çerçeve sunmaktadır. Bu model ile, dinamik koşullar altında hidrodinamik kanser hücreleri ve mezotel hücreleri arasındaki etkileşim kapsamlı analiz edilebilir. Büyük ölçüde metastatik ilerlemesi altında yatan mekanizmaların anlayışımızı ilerletmek ve aynı zamanda tedavi gelişimi kolaylaştırmak olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Hong Kong Araştırma Bursu Konseyi tarafından desteklenmiştir (hibe 17.122.014, C1013-15G, 719813E, ve 17304514). AST Wong Croucher Kıdemli Araştırma Bursu bir alıcı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafer | University wafer | #1196 | 100 mm |
| SU-8 2075 photoresist | Microchem | ||
| SU-8 developer | Microchem | 108-65-6 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 1673921 | Polydimethylsiloxane (PDMS) + curing agent kit |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31AA | 1 mm diameter |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Polyethylene tubing | SCI | BB31695-PE/5 | 0.86 mm (inner diameter) |
| Syringe | Terumo | ||
| Syringe pump | Longer precision pump | LSP01-2A | |
| Medium 199 | Invitrogen | 31100-035 | Add 2.2 g/L sodium bicarbonate |
| MCDB 105 Medium | Sigma | M6395 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30068.02 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Trypsin EDTA solution | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin - 0.01% EDTA, phenol red |
| Fibronectin human | BD | 354008 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| 5-chloromethylfluorescein diacetate | Life technologies | C7025 | Green CMFDA |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-18AIC | |
| Centrifuge | Hitachi | CT15RE | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Model: 80i or ECLIPSE Ti; software: SPOT | |
| SKOV-3 | Gift from Dr. N Auersperg (University of British Columbia) |
References
- Jemal, A., et al. Global cancer statistics. CA: Cancer J. Clin. 61, 69-90 (2011).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Chau, W. K., Ip, C. K., Mak, A. S., Lai, H. C., Wong, A. S. c-Kit mediates chemoresistance and tumor-initiating capacity of ovarian cancer cells through activation of Wnt/beta-catenin-ATP-binding cassette G2 signaling. Oncogene. 32, 2767-2781 (2013).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).
- Tang, M. K. S., Zhou, H. Y., Yam, J. W. P., Wong, A. S. T. c-Met overexpression contributes to the acquired apoptotic resistance of nonadherent ovarian cancer cells through a cross talk mediated by phosphatidylinositol 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase 1/2. Neoplasia. 12, 128-144 (2010).
- Ksiazek, K., et al. Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin. Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).
- Hafter, R., Klaubert, W., Gollwitzer, R., Vonhugo, R., Graeff, H. Crosslinked Fibrin Derivatives and Fibronectin in Ascitic Fluid from Patients with Ovarian-Cancer Compared to Ascitic Fluid in Liver-Cirrhosis. Thromb Res. 35, 53-64 (1984).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307, 58-62 (2005).
- Chang, S. F., et al. Tumor cell cycle arrest induced by shear stress: Roles of integrins and Smad. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 3927-3932 (2008).
- Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator. Trends Cell Biol. 17, 44-50 (2007).
- Rizvi, I., et al. Flow induces epithelial-mesenchymal transition, cellular heterogeneity and biomarker modulation in 3D ovarian cancer nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, E1974-E1983 (2013).
- Ip, C. K., et al. Stemness and chemoresistance in epithelial ovarian carcinoma cells under shear stress. Sci. Rep. 6, 26788 (2016).
- Avraham-Chakim, L., et al. Fluid-flow induced wall shear stress and epithelial ovarian cancer peritoneal spreading. PloS one. 8, e60965 (2013).
- Burkhalter, R. J., et al. Peritoneal mechanobiology and metastatic success in epithelial ovarian cancer. Faseb Journal. 26, (2012).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Botta, G. P., Manley, P., Miller, S., Lelkes, P. I. Real-time assessment of three-dimensional cell aggregation in rotating wall vessel bioreactors in vitro. Nat. Protoc. 1, 2116-2127 (2006).
- Ismadi, M. Z., et al. Flow characterization of a spinner flask for induced pluripotent stem cell culture application. PloS one. 9, e106493 (2014).
- Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PloS one. 9. 9, e89966 (2014).
