Summary
Per studiare la progressione del tumore ovarico in un modello fisiologicamente rilevanti, sferoidi multicellulari sono state coltivate in un Microdevice sotto flusso del fluido simulato. Questo modello 3D dinamica emula l'ambiente intraperitoneale con i componenti cellulari e meccanici in cui si verifica metastasi del cancro ovarico.
Abstract
Il cancro ovarico è caratterizzata da ampie metastasi peritoneale, con sfere tumorali che si trovano comunemente nei ascite maligna. Questo è associata a esiti clinici povere e attualmente manca un trattamento efficace. Sia il tridimensionale (3D) ambiente e le forze meccaniche dinamiche sono fattori molto importanti in questa cascata metastatica. Tuttavia, colture cellulari tradizionali non riescono a ricapitolare questo microambiente tumorale naturale. Così, in vivo -come modelli in grado di emulare l'ambiente intraperitoneale sono di evidente importanza. In questo studio, una nuova piattaforma microfluidica del peritoneo è stato istituito per simulare la situazione di sferoidi cancro ovarico nella cavità peritoneale durante metastasi. sferoidi cancro ovarico generati in una condizione non-aderenti sono state coltivate in canali microfluidica rivestite con cellule mesoteliali peritoneali sottoposte a fisiologicamente rilevanti sforzo di taglio. In sintesi, questa dinamica 3D ovarico mic cancro-mesoteliopiattaforma rofluidic in grado di fornire nuove conoscenze sulla biologia del cancro di base e fungere da piattaforma per lo screening di droga potenziale e lo sviluppo.
Introduction
Il cancro ovarico è il cancro ginecologico più letale ed è caratterizzata da un'ampia diffusione peritoneale e la formazione di ascite maligna 1. Questo ampio metastasi peritoneale rappresenta una grande sfida clinica ed è associata a esiti clinici povere. Diversamente dalla maggior parte dei carcinomi solidi che metastatizzano attraverso il sangue, il cancro ovarico diffonde in primo luogo all'interno della cavità peritoneale. Le cellule tumorali esistono come multicellulari aggregati / sferoidi durante il processo di metastasi 2. Il fatto che la cultura sospensione può arricchire / cellule tumorali ovariche avvio staminali tumorali suggerisce inoltre che questi sferoidi possono essere associati sia con aggressività del tumore e migliorato chemoresistance 3, 4. Ci sono differenze nella risposta ai farmaci tra le culture 2D e 3D, che hanno presumibilmente diversi meccanismi molecolari 5.
_content "> L'interazione essenziale con mesotelio costruisce il microambiente primario per la progressione del tumore ovarico. Queste cellule mesoteliali trovano su una matrice extracellulare (ECM), dove fibronectina è un costituente ubiquitario. Un collegamento tra l'aumentata espressione di mesothelial fibronectina derivato dalle cellule e è stato dimostrato progressione tumorale. fibronectina è abbondantemente presente in ascite maligna 6, 7. cellule tumorali ovariche sono anche in grado di indurre la secrezione di fibronectina dalle cellule mesoteliali per promuovere precoce ovarico metastasi del cancro 8.Prove emergenti mostra che stimoli meccanici, compresi sollecitazione di taglio, possono modulare la morfologia cellulare, l'espressione genica, e, pertanto, i fenotipi di cellule tumorali 9, 10, 11. Come ascite maligna sviluppare e accumulare durante tumor progressione, cellule tumorali ovariche sono esposti al flusso del fluido e la conseguente sollecitazione di taglio. Un certo numero di gruppi, la nostra compresa, hanno dimostrato l'impatto dello stress di taglio sulla progressione del cancro ovarico, comprese le modifiche del citoscheletro, epiteliali-to-mesenchimali transizioni ed stemness cancro 12, 13, 14, 15. Così, un microambiente fisiologicamente rilevanti è importante per la ricerca di tumore metastasi peritoneale. Tuttavia, gli attuali sistemi di coltura in vitro idrodinamici hanno limitazioni mimando e controllo di una costante, basso, fisiologicamente rilevante sforzo di taglio 16, 17, 18, 19. Convenzionale in vitro si avvicina a concentrarsi su entrambi l'ambiente cellulare o meccanico sono ancora limitati insimulando la complessità del microambiente intraperitoneale con adeguata rilevanza fisiologica.
Qui, al fine di progettare un nuovo modello del peritoneo di superare i limiti di strategie convenzionali e per avanzare lo studio del vano intraperitoneale in metastasi del cancro, una piattaforma microfluidica basata 3D con flusso del fluido controllato creata. In questo modello, sferoidi cancro ovarico sono stati co-coltura con cellule umane mesoteliali peritoneali primari in chip microfluidici sotto flusso fluido continuo (Figura 1A). Le cellule mesoteliali sono state seminate su fibronectina. Non aderenti sferoidi carcinoma ovarico sono state seminate in canali microfluidica con medie flusso continuo perfuso da una pompa a siringa. Sia l'ambiente 3D e le forze meccaniche dinamiche sono fattori molto importanti della cascata metastatica. Questa piattaforma può essere utilizzata per studiare la microambiente intraperitoneale in termini di cel complessolular e co-coltura interazioni, nonché in relazione agli stimoli meccanici dinamici.
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Protocol
1. Microfluidic design del dispositivo e Fabrication
- Design Master Microfluidic
- Disegno e disegnare il modello di canale microfluidica con qualsiasi software per computer-aided design (CAD).
NOTA: Normalmente, il disegno CAD può essere inviato ad una società fotomaschera per produrre fotomaschera. La progettazione microfluidica consiste di tre canali paralleli identici, ciascuno con le seguenti dimensioni: 4 mm × 25 mm × 250 micron (larghezza × lunghezza × altezza) e impostare 2 mm. Entrambe le estremità del canale sono stati progettati con 127 ° angoli per facilitare l'ingresso e l'uscita di liquido (Figura 1B). Il canale utilizzato in questo protocollo è stato segnalato in una precedente pubblicazione 13. - Lavare il wafer di silicio con ultrasuoni (500 W / 42 kHz) in acetone, isopropanolo, e acqua deionizzata per 15 minuti ciascuno. Essiccare il wafer con azoto pressurizzato. Riscaldare il wafer di silicio su una piastra calda a 250 ° C per 15 min a completamente asciuttaesso.
- Spin-coat uno strato di SU-8 2075 photoresist (125 micron di spessore) sul wafer di silicio con una velocità di rotazione di 1800 giri al minuto. Cuocere il wafer photoresist rivestite direttamente su una piastra calda a 65 ° C e poi a 95 ° C, per rimuovere il solvente in eccesso, per 5 e 25 minuti, rispettivamente (secondo il manuale del prodotto SU-8).
- Ripetere il passaggio 3 e spin-coat un altro strato di SU-8 2075 photoresist per ottenere uno spessore finale di 250 micron. Cuocere il photoresist rivestite wafer direttamente su una piastra calda a 65 ° C per 7 minuti e poi a 95 ° C per 30 min. Lentamente raffreddare il wafer a temperatura ambiente. Non raffreddare con aria compressa.
- Allineare e mettere fotomaschera direttamente sulla parte superiore del wafer. Esporla alla luce UV per 20 s per reticolare il modello.
- Cuocere il wafer con fotoresist a 65 ° C e 95 ° C su una piastra per 5 e 12 minuti, rispettivamente, per rimuovere il solvente per la polimerizzazione (secondo il manuale del prodotto SU-8). In seguito, raffreddare la cialda ditemperatura ambiente.
- Rimuovere il photoresist non reticolato immergendo il wafer in SU-8 sviluppatore per 25 min. Lavare il wafer con isopropanolo e asciugare con aria compressa.
NOTA: Se una soluzione lattea è stata osservata quando il risciacquo con isopropanolo, indicando sviluppo incompleto, immergere il wafer di nuovo in SU-8 sviluppatore per un tempo di sviluppo più lungo. - Posizionare la cialda su un piatto caldo a 180 ° C per 10 minuti per guarire il modello da potenziali fessure. Spegnere la piastra calda e lentamente raffreddare la cialda a temperatura ambiente, lasciando sul piatto caldo.
- Aggiungere poche gocce di tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottil) silano in un tappo del flacone. Mettere il tappo del flacone in un essiccatore a vuoto. Posizionare il wafer accanto al cappuccio della fiala per silanizzare fetta per 10 min.
- Disegno e disegnare il modello di canale microfluidica con qualsiasi software per computer-aided design (CAD).
- PDMS fabbricazione di chip
- Avvolgere il wafer con un foglio di alluminio per creare un supporto.
- Mescolare il polidimetilsilossano (PDMS) base e catalizzatore in un rapporto di 10: 1 di massacon un miscelatore centrifuga sotto la funzione di miscelazione e degassamento. Versare il composto PDMS lentamente sul wafer ad una altezza di circa 5 mm. Degassare la PDMS sotto vuoto per 40 min. Curare il PDMS in un forno a 65 ° C per 2 h.
- sbucciare accuratamente la lastra PDMS off master e tagliare le PDMS lungo i canali finché è la dimensione di un vetrino. Punch il PDMS con un 1 mm pugno biopsia per creare gli ingressi e le uscite del dispositivo.
- Pulire la superficie PDMS con aria compressa e nastro adesivo per rimuovere la polvere e detriti PDMS.
- Posizionare la lastra PDMS, con il lato rivolto verso l'alto del canale, in un pulitore plasma. Posizionare un vetrino pulito nel più pulito al plasma accanto alla lastra PDMS.
- Trattare il PDMS e vetrino sotto plasma ad aria ad alto livello RF per 1 min. Associare il PDMS al vetrino per creare un legame covalente irreversibile.
- Posizionare il chip PDMS su una piastra calda a 150 ° C per 1 h per aumentare la resistenza di legame e di restituire il Hydrophobicity dei PDMS prima dell'uso.
2. Semina il Microfluidic Chip con cellule mesoteliali peritoneale primario (HPMCs)
- Rivestimento fibronectina dei canali microfluidica
- Sterilizzare il canale microfluidica con 30 ml di etanolo al 75%. Rimuovere l'etanolo e lavare due volte con 30 ml di PBS sterile (PBS) utilizzando un puntale. Accuratamente aspirare PBS nei canali.
NOTA: per minimizzare la contaminazione, la coltura cellulare microfluidica deve essere attentamente condotta in condizioni asettiche completamente attraverso l'uso di una cappa a flusso laminare. - Preparare una soluzione 10 mg / ml fibronectina nel M199 privo di siero: MCDB105 (1: 1) di media. Pipetta la soluzione su e giù, con particolare attenzione per evitare la formazione di bolle. Non farlo vortice.
- Lentamente riempire ogni canale con 30 ml di soluzione di fibronectina. Sigillare i canali con nastro adesivo e incubare il chip notte a 4 ° C.
- Sterilizzare il canale microfluidica con 30 ml di etanolo al 75%. Rimuovere l'etanolo e lavare due volte con 30 ml di PBS sterile (PBS) utilizzando un puntale. Accuratamente aspirare PBS nei canali.
- HPMCs cultura in 10% di siero fetale bovino (FBS) terreno di coltura (M199: MCDB105 supplementato con 10% FBS e 100 U / mL di penicillina / streptomicina) sotto il 5% di CO 2 a 37 ° C fino a 80% di confluenza.
- Risciacquare le HPMCs con 3 ml di PBS e trypsinize con 2 mL di 0,05% tripsina / soluzione (TE) 0,01% EDTA per 30 s. Neutralizzare con 4 ml di 10% mezzo di coltura FBS e centrifugare le cellule a 1000 xg per 5 min.
- Risospendere le HPMCs in 2 mL di 10% FBS mezzo di coltura. Contare il numero di cellule con un emocitometro e regolare la concentrazione cellulare a 3,5 × 10 6 / ml.
- Riscaldare il chip microfluidica fibronectina rivestite in un incubatore a 37 ° per 5 minuti prima dell'uso. Completamente aspirare la soluzione di fibronectina.
- Lentamente pipettare 30 ml di sospensione HPMC in ogni canale. Sigillare i canali con nastro e posizionare i dispositivi nell'incubatrice CO 2 durante la notte.
- formazione sferoide cancro ovarico
- Mantenere la linea epiteliale umano ovarico cellule di cancro SKOV-3 in 5% FBS mezzo di coltura (M199: MCDB105 con 5% FBS e 100 U / mL di penicillina / streptomicina) e 5% di CO 2 a 37 ° C prima degli esperimenti.
- Sciogliere 0,5% agarosio in acqua bollita. Pipettare 50 ml di soluzione di agarosio in ciascun pozzetto di piastre da 96 pozzetti. Lasciare le piastre nella cappa per 20 minuti per consentire l'agarosio solidificare; agarosio solidificato rivestire i pozzetti possono impedire l'adesione cellulare e indica che le piastre sono pronte per l'uso.
- Lavare le cellule Skov-3 con 3 ml di PBS. Trypsinize con 2 ml di soluzione di TE per 3 min. Neutralizzare con 4 ml di 5% terreno di coltura FBS e centrifugare le cellule a 1000 xg per 5 min.
- Contare il numero di cellule SKOV-3 con un emocitometro e risospendere le cellule in 5% FBS mezzo di coltura ad una densità di 5.000 cellule / ml. Transfer 200 ml di sospensione cellulare in ciascun agarosio rivestita bene e cultura sotto 5% di CO 2 a 37 ° C per 48 h.
- Cancro sferoide carico
- Trasferimento sferoidi tumorali di un tubo da centrifuga da 50 ml di pre-bagnato con 1 ml di mezzo privo di siero e spin down a 750 xg per 5 min.
NOTA: Pre-bagnato puntali e provette da centrifuga può impedire l'attaccamento sferoide indesiderato sulle provette da centrifuga. - Preparare 2,5 mg / mL di soluzione diacetato 5-chloromethylfluorescein (CMFDA) in privo di siero M199: media MCDB105. Risospendere sferoidi tumorali in 1 mL di soluzione di CMFDA e incubare a 37 ° C per 30 min. Centrifugare a 750 xg per 5 min.
- Risciacquare sferoidi tumorali con 2 ml di mezzo privo di siero e centrifugare a 750 xg per 5 min. Ripetere questo passaggio due volte per rimuovere il colorante fluorescente restante dal mezzo.
NOTA: Il segnale fluorescente può essere mantenuto in sferoidi per più di 96 h. - Risospendere il cancrosferoidi in privo di siero M199: medio MCDB105 e contare il numero sferoide con un emocitometro. Regolare la concentrazione a 2.000 sferoidi / mL con terreno privo di siero.
- Prima di sferoide carico, iniettare lentamente 100 ml di privo di siero M199: media MCDB105 per lavare via le cellule non-aderito mesoteliali all'interno dei canali.
NOTA: una iniezione veloce, aspirazione, o la formazione di bolle porterà al distacco del monostrato mesoteliali. - Carico 30 ml di sospensione sferoide con marcatore fluorescente in ogni canale. Posizionare il chip microfluidica nell'incubatore di CO 2.
- Trasferimento sferoidi tumorali di un tubo da centrifuga da 50 ml di pre-bagnato con 1 ml di mezzo privo di siero e spin down a 750 xg per 5 min.
- assemblaggio piattaforma di perfusione e co-coltura
- Attaccare una siringa carica di fresco, M199 privo di siero: medio MCDB105 ad un tubo di 1 m di lunghezza.
- Posizionare la siringa sulla pompa a siringa e fissare il pistone ed il corpo della siringa. Installare la pompa a siringa in posizione orizzontale alla stessa altezza del chip microfluidico all'interno dell'incubatrice.
NOTA: Il numero e la dimensione delle siringhe dipende dal numero di canali utilizzati e la durata dell'esperimento. - infondere rapidamente l'intero tubo con media premendo e tenendo premuto il tasto di avanzamento veloce fino a quando il mezzo di overflow del tubo.
- Eseguire l'iniezione alla portata desiderata. Stimare il sforzi di taglio utilizzando la seguente equazione:
dove τ rappresenta il sforzi di taglio all'interno della camera, Ǫ = portata, μ = viscosità (0,01 g cm -1); Altezza della camera h = flusso, e la larghezza della camera w = flusso. - Collegare il tubo per l'ingresso del canale. Posizionare il tubo di ingresso eccesso in incubatrice per garantire che il substrato viene riscaldato prima iniettato nei canali. Per facilitare il collegamento tra il tubo e il canale, connettori appropriati possono essere scelti. NOTA: Attenzione a non introdurre alcuna bolla al Syringe, tubi e connessioni.
- Collegare l'uscita del canale ad un tubo conico da 50 mL per raccogliere il mezzo efflusso con un tubo di uscita breve.
NOTA: Il sistema completo co-coltura dinamica è mostrato nella Figura 1D.
4. Osservazione di HPMCs e cancro Spheroids dopo perfusione
- Osservare le HPMCs e sferoidi tumorali con un campo chiaro o microscopio a fluorescenza e scattare foto dopo 1 h di perfusione.
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Representative Results
Usando questo protocollo, una piattaforma microfluidica è stato istituito per modellare sferoidi cancro ovarico con cellule mesoteliali in condizioni idrodinamiche. cellule mesoteliali peritoneali umani primari sono stati coltivati in microdispositivi per 16 h e osservati al microscopio in campo chiaro. Come mostrato in Figura 2A, il fondo del canale è stato coperto con successo con un monostrato di HPMCs. E 'importante notare che la formazione di bolle durante la fibronectina o HPMC patterning porterà a difetti del rivestimento canale. Attraverso coltura in sospensione non aderente, sferoidi multicellulari con un diametro di circa 100 micron, che sono di dimensioni simili a quelle che si trovano in ascite dei pazienti, sono stati generati ed etichettati con colorante fluorescente verde, CMFDA. Gli sferoidi sono stati poi trasferiti a canali microfluidica HPMC-rivestiti e sono rimaste in sospensione. Morfologie cellulari sono stati osservati al microscopio e le immagini sono state catturate (Figura 2B). Gli sferoidi tumorali fluorescenti marcati possono essere facilmente distinguibili dalle cellule mesoteliali sotto un microscopio a fluorescenza (Figura 2C).
Figura 1. Una dinamica 3D peritoneale Microdevice per la modellazione cancro ovarico multicellulari sferoide Comportamenti. (A) Schema di un chip microfluidico utilizzato per co-coltura sferoidi carcinoma ovarico con HPMCs in condizioni di flusso. (B) Schema che mostra il design dei canali microfluidica. (C) la fotografia di un chip microfluidica utilizzato nel protocollo, con i suoi canali infuso con soluzione colorante per la visualizzazione chiara. Bar = 1 centimetro. (D) Fotografia che mostra l'apparato sperimentale. Clicca qui per vedere una versione più grande of questa figura.
Figura 2. Le immagini del cellulare Ovarian Cancer Spheroid-mesothelial dinamica co-coltura modello. (A) Immagine del monostrato HPMC coltivato nel canale microfluidico. (B) Immagini di sferoidi cancro ovarico nel canale microfluidica rivestito con cellule mesoteliali peritoneali al microscopio a contrasto di fase (pannello di sinistra) o (C) microscopia a fluorescenza (Verde, CMFDA; pannello di destra). Bar = 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo saggio offre un modello flessibile e fisiologicamente rilevanti che possono essere incorporati con vari saggi biochimici e basati su celle, tra cui, ma non limitato a, saggi di adesione, saggi di liquidazione mesoteliali, e lo screening di stupefacenti. Esso può essere applicato alla valutazione dell'effetto del microambiente intraperitoneale sulla progressione del cancro. Tuttavia, potrebbe essere necessario ottimizzare diverse condizioni sperimentali, a seconda degli obiettivi del progetto (ad esempio, il numero di HPMCs e sferoidi tumorali seminate per canale, il tempo di co-coltura, ecc). Altri tipi di cellule del microambiente intraperitoneale, quali fibroblasti, cellule endoteliali, o cellule immunitarie, possono anche essere inclusi nel sistema per studiare le interazioni essenziali tra sferoidi tumorali ovariche e cellule vicine. Altri componenti ECM, come laminina, vitronectina, o collagene, possono anche essere utilizzati. Un punto debole di questo protocollo che può essere necessario considerare è che, mentre ilaccoppiamento del rifornimento dei nutrienti e shear stress ricorda quello osservato in vivo, non vi è alcun controllo separato di rifornimento dei nutrienti e shear stress nel nostro sistema attuale. Inoltre, saranno necessarie tecniche come tripsinizzazione on-chip combinato con fluorescenza-attivato cell sorting raccogliere separatamente le cellule tumorali ovariche e HPMCs per ulteriori studi molecolari sui diversi tipi di cellule.
Questa tecnica presenta diversi vantaggi rispetto agli approcci tradizionali. In primo luogo, 3D imita co-coltura meglio la comunicazione intercellulare in vivo tra le cellule di cancro ovarico e cellule mesoteliali. Secondo, le cellule sono coltivate in condizioni di flusso fluidico ma non sono in condizione statica, generando una risposta cellulare che è potenzialmente rappresentativo della situazione in vivo 12, 13. Inoltre, il flusso di fluido può essere controllata con precisione, imitando il hydrodynamicondizioni c nelle diverse fasi della progressione del tumore.
In sintesi, il ovarico modello di co-coltura dinamica 3D cancro-mesotelio qui presentata fornisce un quadro flessibile per il comportamento di modellazione del tumore nella cavità peritoneale. Con questo modello, l'interazione tra cellule tumorali e cellule mesoteliali in una condizione idrodinamica dinamico può essere ampiamente analizzato. Si può avanzare notevolmente la nostra comprensione dei meccanismi alla base della progressione metastatica e potrebbe anche facilitare lo sviluppo terapeutico.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da Hong Kong Research Council Grant (borse di 17.122.014, C1013-15G, 719813E, e 17.304.514). AST Wong è un destinatario del Croucher Senior Research Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafer | University wafer | #1196 | 100 mm |
| SU-8 2075 photoresist | Microchem | ||
| SU-8 developer | Microchem | 108-65-6 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 1673921 | Polydimethylsiloxane (PDMS) + curing agent kit |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31AA | 1 mm diameter |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Polyethylene tubing | SCI | BB31695-PE/5 | 0.86 mm (inner diameter) |
| Syringe | Terumo | ||
| Syringe pump | Longer precision pump | LSP01-2A | |
| Medium 199 | Invitrogen | 31100-035 | Add 2.2 g/L sodium bicarbonate |
| MCDB 105 Medium | Sigma | M6395 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30068.02 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Trypsin EDTA solution | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin - 0.01% EDTA, phenol red |
| Fibronectin human | BD | 354008 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| 5-chloromethylfluorescein diacetate | Life technologies | C7025 | Green CMFDA |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-18AIC | |
| Centrifuge | Hitachi | CT15RE | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Model: 80i or ECLIPSE Ti; software: SPOT | |
| SKOV-3 | Gift from Dr. N Auersperg (University of British Columbia) |
References
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