Summary
For å studere ovarial tumor progresjon i et fysiologisk relevant modell, flercellede sfæroider ble dyrket i et microdevice henhold simulert fluidstrømmen. Denne dynamiske 3D-modell emulerer intraperitoneal miljø med de cellulære og mekaniske komponenter der eggstokkreft metastasering oppstår.
Abstract
Eggstokkreft er preget av omfattende peritoneal metastaser, med kreftkuler som vanligvis finnes i de ondartede ascites. Dette er forbundet med dårlige kliniske resultater, og for tiden mangler effektiv behandling. Både den tre-dimensjonale (3D) miljø, og de dynamiske mekaniske krefter er meget viktige faktorer i denne metastatic cascade. Men tradisjonelle cellekulturer klarer å rekapitulere denne naturlige svulstens mikromiljø. Dermed in vivo-lignende modeller som kan emulere intraperitoneal miljø er av åpenbar betydning. I denne studien ble en ny mikrofluid plattform av bukhinnen satt opp for å etterligne den situasjon av ovarialcancer sfæroider i bukhulen under metastase. Eggstokkreft kuler oppnådd under et ikke-klebende tilstand ble dyrket i microfluidic kanaler belagt med peritoneal mesothelial celler utsatt for fysiologisk relevant skjærspenning. Oppsummert, dette dynamiske 3D eggstokkreft-mesothelium microfluidic plattformen kan gi ny kunnskap om grunnleggende kreft biologi og tjene som en plattform for potensielle narkotika screening og utvikling.
Introduction
Eggstokkreft er den mest dødelige gynekologisk kreft og er preget av utbredt peritoneal formidling og dannelsen av ondartet ascites en. Denne omfattende peritoneal metastase representerer en stor klinisk utfordring og er assosiert med dårlig kliniske resultater. I motsetning til de fleste faste karsinomer som metastasize via blodet, eggstokk-kreft sprer primært innenfor bukhulen. Tumorceller eksistere som flercellede aggregater / kuler under prosessen med metastase to. Det faktum at suspensjonskultur kan berike eggstokkreft stilk / tumorceller initiere antyder videre at disse kuler kan være forbundet med både tumor aggressivitet og forbedret chemoresistance 3, 4. Det er forskjeller i legemiddelrespons mellom 2D- og 3D-kulturer, som antakelig har forskjellige molekylære mekanismer 5.
_content "> Den viktige samspillet med mesothelium konstruerer den primære mikromiljøet for eggstokkreft tumor progresjon. Disse mesothelial celler ligge på et ekstracellulært matriks (ECM), hvor fibronektin er en allestedsnærværende bestanddel. En kobling mellom økt uttrykk av mesothelial celle-avledet fibronektin og tumorprogresjon har blitt vist. fibronektin er rikelig tilstede i ondartet ascites 6, 7. eggstokk-kreft-celler er også i stand til å indusere sekresjonen av fibronektin fra mesothelial celler for å fremme tidlig ovarian cancer metastase 8.Emerging bevis viser at mekaniske stimuli, inkludert skjærspenningen, kan modulere cellemorfologi, genekspresjon, og således fenotypene av tumorceller 9, 10, 11. Som ondartet ascites utvikle og samle under tumor progresjon, blir ovarietumorceller utsatt for fluidstrømning, og den resulterende skjærspenning. Et antall grupper, våre inkludert, har vist virkningen av skjærspenning på progresjon av kreft i eggstokkene, inkludert cytoskjelett modifikasjoner, epitel-til-mesenchymale overganger og kreft stemness 12, 13, 14, 15. Dermed er en fysiologisk relevant mikromiljøet viktig for etterforskningen av tumor peritoneal metastaser. Imidlertid, nåværende in vitro hydrodynamiske kultursystemer har begrensninger på å etterligne og styring av en konstant, lav, fysiologisk relevant skjærspenning 16, 17, 18, 19. Konvensjonelle in vitro nærmer seg fokus på enten den cellulære eller mekanisk miljø er fortsatt begrenset iligne kompleksiteten av intraperitoneal mikromiljøet med passende fysiologisk relevans.
Her, for å konstruere en ny modell av peritoneum for å overvinne begrensninger av konvensjonelle strategier og for å fremme studiet av intraperitoneal rommet i kreftmetastaser, ble en 3D mikrofluid-basert plattform med kontrollert fluidstrømning utformet. I denne modellen eggstokkreft kuler samtidig var dyrket med primære humane peritoneal mesothelial celler i microfluidic chips under kontinuerlig fluidic flow (figur 1A). Mesothelial cellene ble sådd ut på fibronektin. Non-tilhenger eggstokkreft kuler ble sådd på microfluidic kanaler med kontinuerlig flyt medium dynket av en sprøytepumpe. Både 3D-miljøet og de dynamiske mekaniske krefter er svært viktige faktorer i den metastatisk kaskade. Denne plattformen kan benyttes for undersøkelse av intraperitoneal mikromiljøet i form av komplekse cellular og co-kultur interaksjoner, samt med hensyn til dynamiske mekaniske signaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. microfluidic enhet design og fabrikasjon
- Microfluidic mester utforming
- Design og trekke microfluidic kanal mønster med en hvilken som helst dataassistert konstruksjon (DAK) programvare.
MERK: Normalt DAK-tegning kan sendes til en fotomaske selskap til å produsere fotomasken. Den microfluidic design består av tre identiske parallelle kanaler, hver med følgende dimensjoner: 4 mm x 25 mm x 250 mikrometer (bredde x lengde x høyde) og sette 2 mm fra hverandre. Begge kanalender ble utformet med 127 ° vinkel for å lette flytende inngang og utgang (figur 1B). Kanalen brukes i denne protokollen ble rapportert i en tidligere publikasjon 13. - Vask silikonplaten med ultralydbehandling (500 W / 42 kHz) i aceton, isopropanol, og avionisert vann i 15 minutter hver. Tørk wafer med trykksatt nitrogengass. Varm opp silikonplaten på en varm plate ved 250 ° C i 15 min til helt tørtden.
- Spin-belegge et lag av SU-8 2075 fotoresist (125 um tykke) på silikonplaten, med en spinnehastighet på 1800 rpm. Bake fotoresist-belagt skive direkte på en varm plate ved 65 ° C og deretter ved 95 ° C, for å fjerne overskudd av løsningsmiddel, i 5 og 25 min, henholdsvis (i henhold til SU-8 produkt manuell).
- Gjenta trinn 3 og spin-coat et annet lag av SU-8 2075 fotoresist for å oppnå en endelig tykkelse på 250 pm. Bake den fotoresist-belagt skive direkte på en varm plate ved 65 ° C i 7 minutter og deretter ved 95 ° C i 30 min. Langsomt avkjøle skiven til romtemperatur. Ikke kult med trykkluft.
- Rett og sette fotomasken direkte på toppen av wafer. Utsettes for UV-lys i 20 s å tverr mønsteret.
- Bake skiven med fotoresist ved 65 ° C og 95 ° C på en varmeplate for 5 og 12 min, henholdsvis, for å fjerne løsningsmidlet for polymeriseringen (i henhold til SU-8 produkt manuell). Etterpå kan du avkjøle skiven tilromtemperatur.
- Fjerne ikke-tverrbundet fotoresist ved å dyppe den platen i SU-8 utvikler i 25 min. Skyll wafer med isopropanol og tørk den med trykkluft.
MERK: Hvis ble observert en melkeaktig løsning når skylle med isopropanol, som indikerer mangelfull utvikling, fordype wafer tilbake til SU-8 utvikler for en lengre utviklingstid. - Plasser wafer på en varm plate ved 180 ° C i 10 min for å helbrede mønsteret fra potensielle sprekker. Slå av varmeplaten og langsomt avkjøles skiven til romtemperatur ved å la den på den varme platen.
- Tilsett noen dråper av triklor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroktyl) silan i en ampulle cap. Sett korken i eksikkator. Plasser skiven ved siden av korken til silanize skiven i 10 min.
- Design og trekke microfluidic kanal mønster med en hvilken som helst dataassistert konstruksjon (DAK) programvare.
- PDMS chip fabrikasjon
- Pakk wafer med aluminiumsfolie for å skape en holder.
- Bland polydimetylsiloksan (PDMS) base og herder ved en 10: 1 masseforholdmed en sentrifugal-blander under blanding og avgasse funksjon. Hell PDMS blandingen langsomt på platen til en høyde på rundt 5 mm. Avgasse PDMS under vakuum i 40 min. Kurere de PDMS i en ovn ved 65 ° C i 2 timer.
- skrelle forsiktig PDMS skive av master og trimme PDMS langs kanalene til den er på størrelse med et glass lysbilde. Punch de PDMS med en 1 mm biopsi slag for å lage de innløp og utløp av enheten.
- Rengjør PDMS overflaten med trykkluft og teip for å fjerne støv og PDMS rusk.
- Plasser PDMS skive, med kanalen siden vendt oppover, inn i en plasma renere. Plasser et rent glass lysbilde i plasma renere langs PDMS skive.
- Behandle PDMS og glass skyve under luft plasma ved høy RF nivå i 1 min. Bind PDMS til glass-slide for å opprette en irreversibel kovalent binding.
- Plasser PDMS chip på en varmeplate ved 150 ° C i 1 time for å forbedre bindingsstyrken og for å returnere den hydrophobicity av PDMS før bruk.
2. Seeding microfluidic Chip med primær peritoneal mesothelial celler (HPMCs)
- Fibronektin belegg av microfluidic kanaler
- Sterilisere microfluidic kanal med 30 mL av 75% etanol. Fjerne etanolen og skylles to ganger med 30 ul av sterilisert fosfat-bufret saltvann (PBS) ved hjelp av en pipettespiss. Grundig aspirer PBS i kanalene.
MERK: For å minimalisere forurensning, bør mikrofluidcellekulturen være omhyggelig utført under fullstendig aseptiske betingelser ved bruk av en laminær strømningshette. - Forbered en 10 mikrogram / ml fibronektin løsning i serumfritt M199: MCDB105 (1: 1) medium. Pipetter løsningen opp og ned, med spesiell omsorg for å unngå bobledannelse. Ikke vortex.
- Langsomt fylle opp hver kanal med 30 ul av fibronektin oppløsning. Forsegle kanaler med tape og inkuberes chip over natten ved 4 ° C.
- Sterilisere microfluidic kanal med 30 mL av 75% etanol. Fjerne etanolen og skylles to ganger med 30 ul av sterilisert fosfat-bufret saltvann (PBS) ved hjelp av en pipettespiss. Grundig aspirer PBS i kanalene.
- Kultur HPMCs i 10% føtalt bovint serum (FBS) kulturmedium (M199: MCDB105 supplert med 10% FBS og 100 U / ml penicillin / streptomycin) under 5% CO2 ved 37 ° C inntil 80% konfluens.
- Skyll HPMCs med 3 ml PBS og trypsineres med 2 ml av 0,05% trypsin / 0,01% EDTA (TE) løsning i 30 sek. Nøytraliser med 4 ml 10% FBS kulturmedium og spinne ned cellene ved 1000 xg i 5 min.
- Resuspender HPMCs i 2 ml 10% FBS kulturmediet. Telle celle nummer med en hemocytometer og justere cellekonsentrasjonen til 3,5 x 10 6 / ml.
- Varm fibronektin-belagte mikrofluid chip i en 37 ° C inkubator i 5 minutter før bruk. Aspirer all fibronektin løsning.
- Sakte pipette 30 ul av HPMC suspensjon inn i hver kanal. Forsegle kanaler med tape og plassere enhetene i CO 2 inkubator over natten.
- Eggstokkreft spheroid formasjon
- Opprettholde den menneskelige ovarialcancer cellelinje SKOV-3 i 5% FBS kulturmedium (M199: MCDB105 med 5% FBS og 100 U / ml penicillin / streptomycin) under 5% CO2 ved 37 ° C før forsøkene.
- Løs opp 0,5% agarose i sterilisert vann ved koking. Fordeles 50 mL av agarose oppløsningen i hver brønn i 96-brønners plater. La platene i hetten i 20 min for å tillate agarose for å størkne; størknede agarose belegging av brønnene kan forebygge celleadhesjon og angir at platene er klar til bruk.
- Skyll Skov-3 celler med 3 ml PBS. Trypsineres med 2 ml TE løsning for 3 min. Nøytraliser med 4 ml 5% FBS kulturmedium og spinne ned cellene ved 1000 xg i 5 min.
- Telle SKOV-3-celle nummer med et hemocytometer og resuspender cellene i 5% FBS kulturmedium ved en tetthet på 5000 celler / ml. transfer 200 ul av cellesuspensjonen i hver enkelt agarose-belagt brønn og kulturen under 5% CO2 ved 37 ° C i 48 timer.
- Kreft spheroid lasting
- Overfør kreft kuler til en 50-mL sentrifugerør pre-fuktet med 1 ml serumfritt medium og spinne ned ved 750 xg i 5 minutter.
MERK: Pre-fuktet pipettespisser og sentrifugerør kan hindre uønsket spheroid vedlegg på sentrifugerørene. - Fremstille 2,5 ug / ml 5-chloromethylfluorescein diacetat (CMFDA) oppløsning i serumfritt M199: MCDB105-medium. Resuspender kreft kuler i 1 ml CMFDA oppløsning og inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter. Sentrifuger ved 750 xg i 5 minutter.
- Skyll kreft sfæroidene med 2 ml serumfritt medium og sentrifuger ved 750 xg i 5 minutter. Gjenta dette trinn to ganger for å fjerne gjenværende fluorescerende fargestoff fra mediet.
MERK: fluorescerende signal kan beholdes i kuler for mer enn 96 timer. - Resuspender kreftkuler i serumfritt M199: MCDB105 medium og telle spheroid tall med en hemocytometer. Juster konsentrasjon til 2.000 kuler / ml med serumfritt medium.
- Før spheroid lasting, sakte injisere 100 ul serumfritt M199: MCDB105 medium for å vaske bort de ikke-levd mesothelial celler inne i kanalene.
MERK: En rask injeksjon, aspirasjon, eller bobledannelse vil føre til avløsning av mesothelial monolaget. - Belastning 30 ul av fluorescens-merkede sfæroide suspensjon inn i hver kanal. Plasser microfluidic chip inn i CO 2 inkubator.
- Overfør kreft kuler til en 50-mL sentrifugerør pre-fuktet med 1 ml serumfritt medium og spinne ned ved 750 xg i 5 minutter.
- Perfusjons plattform montering og co-kultur
- Fest en sprøyte fylt med fersk, serum-free M199: MCDB105 medium til en 1 m lang slange.
- Plasser sprøyten på sprøytepumpe og feste stempelet og hoveddelen av sprøyten. Installer sprøytepumpe i en horisontal stilling i samme høyde som det mikrofluid brikken inne i inkubatoren.
NERK: Antallet og størrelsen av sprøyter avhenge av antallet av kanaler som brukes og varigheten av forsøket. - Raskt sette hele røret med medium ved å trykke og holde fast forward-knappen til medium renner over slangen.
- Kjør injeksjon ved den ønskede strømningshastighet. Estimer veggskjærspenning ved hjelp av følgende ligning:
hvor τ representerer veggen skjærspenning inne i kammeret, ǫ = strømningshastighet, μ = viskositet (0,01 g cm-1); h = strømningskammeret høyde, og w = strømningskammeret bredde. - Koble slangen til innløpet av kanalen. Plasser det overskytende innløpsslangen i inkubatoren for å sikre at mediet blir varmet før injiseres inn i kanalene. For å lette forbindelsen mellom røret og kanalen, kan passende kontakter velges. MERK: Pass deg for ikke å innføre noen boble til syringe, rør og koblinger.
- Koble utløpet av kanalen til en 50 ml konisk rør for å samle opp utstrømningen medium med en kort produksjonsrøret.
MERK: Den komplette dynamisk co-kultur system er vist i figur 1D.
4. Observasjon av HPMCs og kreft Spheroids etter Perfusjons
- Observer HPMCs og kreft kuler med en lys-felt eller fluorescens mikroskop og ta bilder etter 1 time av perfusjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av denne protokollen, ble en microfluidic plattform satt opp til å modellere eggstokkreft kuler med mesothelial celler under hydrodynamiske forhold. Primære humane peritoneale mesothelial celler ble dyrket i microdevice i 16 timer og observert under et sterkt mikroskop-felt. Som vist i figur 2A, ble kanalbunnen med hell belagt med et monolag av HPMCs. Det er viktig å merke seg at blæredannelse i løpet av fibronektin eller HPMC mønster vil føre til kanal beleggsvikt. Gjennom ikke-klebende suspensjon kultur, flercellede kuler med diameter på omtrent 100 mikrometer, som er omtrent samme størrelse som de som finnes i pasientenes ascites ble generert og merket med grønt fluorescerende fargestoff, CMFDA. Sfæroidene ble så overført til HPMC-belagte microfluidic kanaler og forble i suspensjon. Cell morfologi ble observert under mikroskopet og bildene ble tatt (figur 2B). De fluorescensmerkede kreft kuler lett kan skilles fra mesothelial cellene under et fluorescens mikroskop (figur 2C).
Figur 1. En dynamisk 3D Peritoneal Microdevice for Modeling eggstokkreft Multicellulære spheroid atferd. (A) Skjematisk diagram av en mikrofluid brikke brukt til å ko-kultur med ovarialcancer sfæroider med HPMCs henhold gjennomstrømning. (B) Skjematisk diagram som viser utformingen av microfluidic kanaler. (C) Fotografi av en mikrofluid brikke anvendt i protokollen, med sine kanaler infusert med fargeløsning for klar visualisering. Bar = 1 cm. (D) Foto viser eksperimentelle oppsettet. Klikk her for å se en større versjon of denne figuren.
Figur 2. Bilder av eggstokkreft spheroid-mesothelial Cell Dynamic Co-kultur modell. (A) Bilde av HPMC-monolag dyrket i mikrofluidkanalen. (B) Bilder av eggstokkreft kuler i mikrofluidkanalen belagt med peritoneal mesothelial cellene under fasekontrastmikroskop (venstre panel) eller (C) fluorescens mikroskopi (Green, CMFDA; panel til høyre). Bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne analysen gir en fleksibel og fysiologisk relevant modell som kan bli inkorporert med forskjellige biokjemiske og cellebaserte analyser, inkludert, men ikke begrenset til, klebeanalyser, mesothelial klareringsanalyser, og medikament-screening. Den kan brukes til å evaluere effekten av intraperitoneal mikromiljøet på progresjon av kreft. Men kanskje flere eksperimentelle betingelser må være optimalisert, avhengig av målene for prosjektet (f.eks antall HPMCs og kreft kuler seeded per kanal, co-kulturen tid, osv). Andre celletyper i det intraperitoneale mikromiljøet, slik som fibroblaster, endotelceller eller immunceller, kan også være inkludert i systemet for å undersøke de grunnleggende interaksjonene mellom eggstokkreft sfæroidene og nærliggende celler. Andre ECM komponenter, slik som laminin, vitronektin, eller kollagen, kan også anvendes. En svakhet ved denne protokollen som kanskje må tas i betraktning er at menskobling av næringsstoff påfyll og skjærspenning minner om at sett i vivo, er det ingen egen kontroll av nærings påfyll og skjærspenninger i vårt nåværende system. Videre vil teknikker som on-chip trypsinering kombinert med fluorescens-aktivert cellesortering være nødvendig for separat å samle eggstokkreft celler og HPMCs for videre molekylære studier av forskjellige typer celler.
Denne teknikk oppviser flere fordeler sammenlignet med tradisjonelle metoder. Først 3D co-kulturen bedre etterligner in vivo inter kommunikasjon mellom eggstokkreft celler og mesothelial celler. For det andre, dyrkes cellene i henhold til fluidstrømningen, men ikke er i statisk tilstand, genererer en cellulær respons som er potensielt representativ for in vivo-situasjon 12, 13. Videre kan fluidstrømmen styres nøyaktig, etterligne hydrodynamic forholdene på ulike stadier av tumorprogresjon.
I sammendraget, den dynamiske 3D eggstokkreft-mesothelium co-kultur modell presenteres her gir et fleksibelt rammeverk for modellering svulst oppførsel i bukhulen. Med denne modellen, kan interaksjonen mellom kreftceller og mesothelial cellene under et dynamisk hydrodynamisk tilstand bli grundig analysert. Det kan i stor grad fremme vår forståelse av de underliggende mekanismene for metastatisk progresjon og kanskje også legge til rette for terapeutisk utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Hong Kong stipend Council (tilskudd 17122014, C1013-15G, 719813E, og 17304514). AST Wong er en mottaker av Croucher Seniorforsker Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafer | University wafer | #1196 | 100 mm |
| SU-8 2075 photoresist | Microchem | ||
| SU-8 developer | Microchem | 108-65-6 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 1673921 | Polydimethylsiloxane (PDMS) + curing agent kit |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31AA | 1 mm diameter |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Polyethylene tubing | SCI | BB31695-PE/5 | 0.86 mm (inner diameter) |
| Syringe | Terumo | ||
| Syringe pump | Longer precision pump | LSP01-2A | |
| Medium 199 | Invitrogen | 31100-035 | Add 2.2 g/L sodium bicarbonate |
| MCDB 105 Medium | Sigma | M6395 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30068.02 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Trypsin EDTA solution | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin - 0.01% EDTA, phenol red |
| Fibronectin human | BD | 354008 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| 5-chloromethylfluorescein diacetate | Life technologies | C7025 | Green CMFDA |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-18AIC | |
| Centrifuge | Hitachi | CT15RE | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Model: 80i or ECLIPSE Ti; software: SPOT | |
| SKOV-3 | Gift from Dr. N Auersperg (University of British Columbia) |
References
- Jemal, A., et al. Global cancer statistics. CA: Cancer J. Clin. 61, 69-90 (2011).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Chau, W. K., Ip, C. K., Mak, A. S., Lai, H. C., Wong, A. S. c-Kit mediates chemoresistance and tumor-initiating capacity of ovarian cancer cells through activation of Wnt/beta-catenin-ATP-binding cassette G2 signaling. Oncogene. 32, 2767-2781 (2013).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).
- Tang, M. K. S., Zhou, H. Y., Yam, J. W. P., Wong, A. S. T. c-Met overexpression contributes to the acquired apoptotic resistance of nonadherent ovarian cancer cells through a cross talk mediated by phosphatidylinositol 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase 1/2. Neoplasia. 12, 128-144 (2010).
- Ksiazek, K., et al. Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin. Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).
- Hafter, R., Klaubert, W., Gollwitzer, R., Vonhugo, R., Graeff, H. Crosslinked Fibrin Derivatives and Fibronectin in Ascitic Fluid from Patients with Ovarian-Cancer Compared to Ascitic Fluid in Liver-Cirrhosis. Thromb Res. 35, 53-64 (1984).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307, 58-62 (2005).
- Chang, S. F., et al. Tumor cell cycle arrest induced by shear stress: Roles of integrins and Smad. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 3927-3932 (2008).
- Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator. Trends Cell Biol. 17, 44-50 (2007).
- Rizvi, I., et al. Flow induces epithelial-mesenchymal transition, cellular heterogeneity and biomarker modulation in 3D ovarian cancer nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, E1974-E1983 (2013).
- Ip, C. K., et al. Stemness and chemoresistance in epithelial ovarian carcinoma cells under shear stress. Sci. Rep. 6, 26788 (2016).
- Avraham-Chakim, L., et al. Fluid-flow induced wall shear stress and epithelial ovarian cancer peritoneal spreading. PloS one. 8, e60965 (2013).
- Burkhalter, R. J., et al. Peritoneal mechanobiology and metastatic success in epithelial ovarian cancer. Faseb Journal. 26, (2012).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Botta, G. P., Manley, P., Miller, S., Lelkes, P. I. Real-time assessment of three-dimensional cell aggregation in rotating wall vessel bioreactors in vitro. Nat. Protoc. 1, 2116-2127 (2006).
- Ismadi, M. Z., et al. Flow characterization of a spinner flask for induced pluripotent stem cell culture application. PloS one. 9, e106493 (2014).
- Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PloS one. 9. 9, e89966 (2014).
