Summary
وقد أثبتت الدراسات مورين في نماذج التهاب colonic أن نسبة مئوية صغيرة (1-5 ٪) من الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) حقن الوريد أو إينترابيريتونيلي الرئيسية لالتهاب القولون1،2. وتبين هذه الدراسة أن حقن إينتراكاردياك الموجهة بالموجات فوق الصوتية من MSCs يؤدي إلى زيادة الترجمة إلى الأمعاء.
Abstract
داء كرون (CD) هو مرض التهاب مزمن شائع الصغيرة والأمعاء الغليظ. الخلايا الجذعية الوسيطة مورين والبشرية (MSCs) تتمتع بإمكانية كآبته، وقد ثبت أن قمع التهاب في نماذج الماوس من التهاب الأمعاء، على الرغم من أن مسار الإدارة يمكن أن يحد من صاروخ موجه وفعالية 1 , 3 , 4 , 5-التطبيق المحلي من MSCs لنماذج الإصابة colonic أثبتت فعالية أكبر في التخفيف من التهاب في القولون. ومع ذلك، هناك ندرة في البيانات المتعلقة بتقنيات لتعزيز إضفاء الطابع المحلي على MSCs المشتقة من نخاع العظام البشرية (همسكس) للامعاء الدقيقة، موقع التهاب في نموذج عصيدة-1/ييتفك (عصيدة) من داء كرون التجريبية. ويصف هذا العمل تقنية رواية لحقن إينتراكاردياك الموجهة بالموجات فوق الصوتية همسكس في الفئران عصيدة، نموذج عفوية تتسم جيدا لالتهاب الأمعاء المزمن. الجنس والعمر-المطابقة، خالية من التهاب الفئران عكر/J (عكر) استخدمت كعناصر تحكم. لتحليل بيوديستريبوشن والتعريب، كانت ترانسدوسيد همسكس مع لينتيفيروس التي تحتوي على مراسل ثلاثية. مراسل ثلاثية تتألف من اليراع لوسيفراس (فلوريدا)، لتصوير طرحه؛ البروتين أحادي الفلورسنت الأحمر (مرفب)، لفرز الخلايا؛ ويقطع الحلأ البسيط فيروس thymidine كيناز (ttk)، لتصوير التصوير المقطعي بالبوزيترون (PET). تظهر نتائج هذه الدراسة أن ح 24 بعد الإدارة إينتراكاردياك، همسكس المعربة في الفئران عصيدة بدلاً من الفئران عكر خالية من التهاب الأمعاء. هذه الرواية، والاسترشاد بالموجات فوق الصوتية بالحقن همسكس في البطين الأيسر للفئران عصيدة يضمن نسبة نجاح عالية إيصالها الخلية، مما يتيح للانتعاش السريع للفئران مع أدنى معدلات الاعتلال والوفيات. هذا الأسلوب يمكن أن يكون وسيلة مفيدة لتعزيز توطين MSCs في نماذج أخرى من التهاب الأمعاء الصغيرة، مثل TNFΔRE6. وستحدد الدراسات المستقبلية إذا كان إضفاء الطابع المحلي على زيادة همسكس بايصالها داخل الشرايين يمكن أن يؤدي إلى زيادة الفعالية العلاجية.
Introduction
داء كرون (CD) هو مرض التهاب مزمن شائع الصغيرة والأمعاء الغليظ وهو يعتقد أن ينتج عن رد فعل غير مناسب من المضيف الجهاز المناعي للميكروبات المعوية7،8. وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن الخلايا الجذعية الوسيطة مورين والبشرية على حد سواء (MSCs) يمكن منع التهاب في نماذج الماوس من التهاب الأمعاء1،3،،من45. وهناك عدة التجارب السريرية الجارية التي تستخدم MSCs البشرية المستمدة من نخاع العظام أو الأنسجة الدهنية لعلاج المرضى الذين يعانون من مرض التهاب الأمعاء (بنك التنمية بين الأمريكتين)، الذي يتضمن القرص المضغوط9. طريقان للعلاج ماجستير وقد استخدمت في هذه التجارب السريرية: واحد ينطوي على ضخ الجهازية (أي عن طريق الوريد) من MSCs لبنك التنمية بين الأمريكتين لومينال (بما في ذلك مؤتمر نزع السلاح)، والآخر ينطوي على التطبيق المترجمة/حقن الخلايا الجذعية في ناسور الولادة المسالك للمرضى الذين يعانون من العجان مؤتمر نزع السلاح. في الأخيرة تحليل تلوي ماجستير العلاج لبنك التنمية بين الأمريكتين، الجهازية (أي، عن طريق الحقن الوريدي) ماجستير العلاج لبنك التنمية بين الأمريكتين لومينال (بما في ذلك مؤتمر نزع السلاح) كان ناجع بنسبة تصل إلى 40% (CI 95%: 7-79%) من المرضى، بينما الكفاءة أعلى بكثير، في 61% (CI 95%: 36-85%)، عندما MSCs تم حقن محلياً في الناسور CD المريضة9. معشاة متعددة الثالث مرحلة الأخيرة محاكمة وهمي تسيطر متمكنة من الخلايا الجذعية الدهنية حقنها مباشرة في الناسور العجان المرضى مؤتمر نزع السلاح قد أظهرت الأدلة السريرية والإشعاعية يعتد به إحصائيا من ناسور العجان الشفاء، تثبت نتائج التحليل التلوي10. أسباب تدني كفاءة ماجستير العلاج يعطي عن طريق الوريد لمؤتمر نزع السلاح لومينال تم التحقيق غير كافية، لكن قد يكون أحد الأسباب استضافة غير كافية أكثر من MSCs إلى موقع الالتهاب. وقد أثبتت الدراسات مورين في نماذج التهاب colonic أن فقط نسبة مئوية صغيرة من MSCs (1-5 ٪) حقن الوريد تصل إلى التهاب القولون؛ MSCs المتبقية يتم تصفيتها ب الرئتين (الأولى-تمرير الأثر)1،2 5، ،،من1112. ولذلك استخدمت عدة دراسات بحثية موريني الطريق داخل (القائمة) لإدارة لجنة السلامة البحرية في نماذج حيوانية لالتهاب القولون4. ومع ذلك، أظهرت أيضا أن فقط الوصول إلى جزء صغير من الخلايا وانجرافت القولون وأن الفعالية المتصلة بإفراز عوامل paracrine القابلة للذوبان، مثل البروتين الجينات عامل نخر الورم إيندوسيبلي 6 (TSG-6)2. إليه لجنة السلامة البحرية الكبت المناعي وشفاء ينطوي على نهج متعدد الجوانب يشمل paracrine؛ العوامل خلية مستقلة عن قرب، مثل TSG-6؛ والخلية تعتمد على القرب من العوامل، مثل المبرمجة الموت-يجند 1 (PD-L1)؛ أو 1 خشنة. ولذلك، ماجستير الترجمة إلى الموقع من التهاب قد يؤدي إلى زيادة كفاءة9،13. في الواقع، أظهرت دراسة حديثة أن MSCs مباشرة مزروع في موقع الإصابة colonic أدت إلى الشفاء من إفراز تشجيع الأوعية والأوعية الدموية غشائي عامل النمو (VEGF). من ناحية أخرى، لوحظ تأثير شفاء الحد أدنى بعد الحقن الوريدي5. زيادة على الترجمة إلى الموقع الالتهاب (أي الأمعاء في الفئران عصيدة)، وضعت هذه تقنية حقن intracardiac الموجهة بالموجات فوق الصوتية لإدارة لجنة السلامة البحرية في البطين الأيسر. حقن الموجهة بصورة تكفل حقن دقيقة، مما يؤدي إلى ارتفاع معدل النجاح، وإلى انخفاض معدلات الاعتلال والوفيات. وعلاوة على ذلك، توفر لهم حقن MSCs إلى البطين الأيسر للدورة الدموية الشريانية، حيث يمكن أن تصل إلى الأمعاء الملتهبة قبل أن تصبح المحاصرين في الرئتين.
واستخدمت في هذه الدراسة، MSCs المشتقة من نخاع العظام البشرية (همسكس) للحقن في نموذج مضغوط14موريني عصيدة-1/ييتفك (عصيدة). عصيدة هو نموذج موريني عفوية تتسم جيدا من التهاب مزمن يتطور التهاب الأمعاء الصغيرة مع ما يقارب 100% بينيترانسي14. الالتهاب يتطور استجابة لتبدل في غياب أي معالجة كيميائية أو مناعية أو الوراثية، ويشبه الإنسان CD11. الجنس والعمر مطابقة خالية من التهاب عكر/J (عكر) الفئران، الفئران السيطرة الأبوية لعصيدة، استخدمت في هذه الدراسة.
همسكس كانت معزولة وتوسعت في المختبر من عينات نخاع العظم (بي أم) التي تم الحصول عليها من المانحين العادية، ولم تحدد هويته بعد الموافقة المستنيرة باستخدام التحقق من صحة وسبق نشر البروتوكولات15،16. بعد عزلة والتوسع، فإن قدرة لجنة السلامة البحرية في أوستيوجينيك، أديبوجينيك، وتم تقييم التمايز تشوندروجينيك في المختبر فحوصات متعددة15. وكان يؤديها المقايسة الوظيفية osteogenic غرس مكعبات السيراميك هيدروكسيباتيت/tricalcium الفوسفات مصفوفة تحتوي على همسكس تحت الجلد في الفئران "إخضاعها" CB17-بركدك المناعة17. والرزن المكعب يوضح تكون العظم وتشوندروجينيسيس المحتملة، ويعتبر الاختبار النهائي لتقييم الاستعدادات MSC الفردية17. تصور همسكس في فيفو بعد الحقن، استخدمت لينتيفيروس في ترانسدوسي همسكس مع بناء الجينات مراسل الثلاثي الذي يتكون من اليراع لوسيفراس (فلوريدا) والبروتين أحادي الفلورسنت الأحمر (مرفب) كيناز thymidine الفيروسية الحلأ البسيط (ttk )، مدفوعا مروج فيروس (وزارة الدفاع الوطني) ساركومه myeloproliferative معدلة18. لوسيفراس اليراع في المراسل ثلاثية إنزيم أن أطماع لوسيفرين حقن إلى أوكسيلوسيفيرين في همسكس وتنتج ضوء أبيض والفوتونات. وهذا الكشف عن بواسطة الكاميرا الحساسة جهاز اقتران (CCD) (الإضاءة الحيوية) في في فيفو بصري تصوير نظام، يمكن تصور همسكس يعيش في الفئران. الإضاءة الحيوية التصوير (BLI) هو تقنية حساسة التي يمكن استخدامها متسلسل لتتبع الخلايا والتحليل السابقين فيفو . استخدام أحد المروجين القوى القوات المتعددة الجنسيات محركات التعبير المستمر عن بناء الجينات مراسل الانصهار الثلاثي ويسمح للتصوير من حقن همسكس لأكثر من 16 أسبوعا19. همسكس التي يصعب ترانسدوسي ولديها من كفاءة توصيل منخفضة. استخدام بروتوكول أمثل، تم تحسين كفاءة توصيل همسكس وكان التعبير التحوير المحسن18. باستخدام التعبير مرفب (أحد الجينات مراسل الثلاثي) على التدفق الخلوي، تجلى القدرة على ترانسدوسي همسكس مع كفاءة عالية ليصل إلى 83 في المائة. فحوصات التمايز و في فيفو فحوصات المكعب برهن على قدرة همسكس ترانسدوسيد تفرق في chondrocytes و adipocytes وأوستيوسيتيس17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافق جميع فئران التجارب والإجراءات في الدراسة الحالة الغربية احتياطي جامعة ' s "رعاية الحيوان المؤسسية" و "استخدام اللجنة". وأجريت الإجراءات في الرابطة لتقييم واعتماد مختبر رعاية الحيوان (آآلاك) المعتمدة مرفق. كان يستنشق BM تحت بروتوكول وافق "مجلس المراجعة المؤسسية مستشفيات جامعة" في مرفق الأساسية الخلايا الجذعية في جامعة الاحتياطي الغربية حالة بعد الموافقة المستنيرة.
1-الثقافة والخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من "توصيل نخاع العظام البشرية" (همسكس)
ملاحظة: عزل همسكس يرد بالتفصيل في المنشورات السابقة 15 ، 20-
عزل- ثقافة همسكس في دولبيكو ' s منخفضة ومتوسطة "النسر تعديل" الجلوكوز (دميم-جي) المتوسطة وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS). ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية ورطوبة 95% ونسبة 5% CO 2 في قوارير T175 مع 25 مل متوسط النمو. استبدال في المتوسط كل 3-4 أيام. في يوم 14، أداء مرور همسكس الأولية.
- عندما الخلايا التوصل إلى التقاء 80% وإزالة المتوسطة القديمة وتغسل بلطف الخلايا مع 5 مل من عقيمة المالحة مخزنة الفوسفات (برنامج تلفزيوني؛ لقوارير زراعة الأنسجة 75 سم)- إزالة برنامج تلفزيوني من قارورة
- وإضافة 4 مل حمض التربسين-الإيثيلين 0.25% (يدتا). مكان مرة أخرى قارورة في الحضانة عند 37 درجة مئوية للحد الأدنى 5-10 الحفاظ على وقت التعرض موجزة بقدر الإمكان.
- عندما أصبحت جيدا مقربة معظم الخلايا أو فصل من طبق الثقافة، وقف رد الفعل بإضافة كمية من مصل العجل البقري يساوي نصف حجم التربسين.
- نقل تعليق خلية إلى أنبوب الحجم المناسب للطرد مركزي. الطرد المركزي الخلايا في 400 غرام x لمدة 5 دقائق ثم قم بإزالة المادة طافية بعناية.
- ريسوسبيند الخلايا في 5 مل متوسطة (دميم-جي + 10% FBS) والاعتماد الخلايا التي تحتوي هيموسيتوميتير-
ملاحظة: عند هذه النقطة، الخلايا يمكن أن تكون سوبكولتوريد أو ترانسدوسيد مع مراسل ثلاثية-
- القيام توصيل همسكس مع مراسل ثلاثية.
قارورة
- البذور 1.5 × 10 6 خلايا في T175 واحد. ثقافة الخلايا في 25 مل متوسط النمو في شركة 37 درجة مئوية، 95%، والرطوبة و 5% 2. انتظر 24 ساعة للخلايا لإرفاق.
- جعل فيروس كوكتيل في أنابيب 15 مل، كما هو موضح في مرجع 18.
حمام
- lentivirus ذوبان الجليد في 37 درجة مئوية في مياه. إضافة 160 ميليلتر من حل كبريتات بروتيميني 5 ملغ/مل في دولبيكو ' s التعديل النسر المتوسطة (دميم) إلى 8 مل من الثقافة المتوسطة (دميم-جي + 10% FBS) لتركيز نهائي من 100 ميكروغرام/مل. دوامة لإضافة 3 س. تعدد فيروس العدوى (وزارة الداخلية) 5 (1st الوقت مذاب) .
- إزالة المتوسطة من قارورة ثقافة الخليوي (الخطوة 1.2.1) وإضافة كوكتيل الفيروس إلى الخلايا. احتضانها ح 10 في 37 درجة مئوية ورطوبة 95% ونسبة 5% CO 2-
- إضافة 4 مل كبريتات بروتيميني ميكروغرام/مل 100 مل 4 جي دميم + 10% FBS واحتضانها حاء 14 إضافية
- وقف توصيل بعد 24 ساعة باستبدال مع 25 مل متوسطة (دميم-جي + 10% FBS)-
- تأكيد توصيل الكفاءة عن طريق تقييم التعبير مرفب بالتدفق الخلوي 18-
ملاحظة: هنا، همسكس التي كانت ترانسدوسيد مع أكثر من 65% واستخدمت الكفاءة. - توسيع نطاق الخلايا باستبدال مع 25 مل متوسطة جديدة (دميم-جي + 10% FBS) مرتين في أسبوع. ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية، 95%، والرطوبة و 5% CO 2. مرور الخلايا بعد وصولها إلى التقاء 80%-
- حالما يتم التوصل إلى العدد المطلوب من الخلايا، أداء تريبسينيزيشن كل الخطوات 1.1.2-1.1.4. عد الخلايا
- وتعليق لهم في برنامج تلفزيوني العقيمة (س 1) في النهائي تركيز 1 × 10 6 خلايا/75 ميليلتر. إبقاء الخلايا على الجليد للنقل إلى جهاز الموجات فوق الصوتية. للتجارب، واستخدام همسكس من أرقام مرور 2-5-
2. الموجات فوق الصوتية-تسترشد "حقن إينتراكاردياك" من همسكس في "البطين الأيسر"
ملاحظة: استخدام SAMP1/ييتفك مع المنشأة الصغيرة والأمعاء التهاب والعمر ونوع الجنس مطابقة AKR/ي الفئران للتجارب. الحفاظ على الفئران عصيدة و AKR تحت شروط معينة خالية من مسببات الأمراض وإطعامهم تشاو المختبر القياسية، والاحتفاظ بها في دورات الضوء/الظلام 12-ح. وهنا، أجريت الحقن القلب موجهة بالموجات فوق الصوتية في غرفة مخصصة خالية من مسببات الأمراض القلب بالموجات فوق الصوتية الموجودة في منشأة الأبحاث الحيوانية كورو مطهرة بمطهر وشطفها بالكحول 70%. مختبر بحوث الأفراد يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية، بما في ذلك العباءات، أقنعة للوجه مع دروع العين، وقفازات معقمة أثناء الحقن إينتراكاردياك. يجب المحافظة على حرارة الجسم من الماوس لمدة الإجراء.
إعداد- الموجات فوق الصوتية نظام التصوير قبل أنيسثيتيزينج الماوس. لهذا البروتوكول، استخدام آلة الموجات فوق الصوتية المصممة للماوس صدى القلب.
- بدوره على القوة وتهيئة محول (30 ميغاهرتز) لإعداد دراسة جديدة-
- تخدير الماوس في دائرة التعريفي لاستخدام إيسوفلوراني 3-4 ٪ في الأكسجين 100% بمعدل 0.2-0.5 لتر/دقيقة الحفاظ على الحيوان للإجراء بأكمله مع إيسوفلوراني 2% في الأكسجين 100% عن طريق مخروط الآنف. تأكيد أنيسثيتيزيشن المناسبة قبل إجراء التصوير معسر أخمص القدمين، المتداول الماوس، ومراعاة عدم وجود حركة.
ملاحظة: ينبغي تطبيق مرهم العيون إلى العيون بعد الاستقراء التخدير لمنع تجفيف القرنية. نقل الفئران أنيسثيتيزيد لآلات التصوير (أي نظام التصوير الإضاءة الحيوية والموجات فوق الصوتية)، حيث سيتلقون جرعة صيانة isoflurane مخدر. تحديد بدء التخدير وقت وعمق التخدير بملاحظة عدم وجود رد فعل القرصات في الذيل ولوح سيرا على الأقدام كل 10 دقيقة لكامل مدة التخدير. - تعيين درجة حرارة جل الجدول والموجات فوق الصوتية التصوير إلى 37 درجة مئوية.
- تماما إزالة الفراء فوق منطقة الصدر كريم لإزالة الشعر باستخدام الماوس أنيسثيتيزيد. ضع الماوس على طاولة التصوير في موقف ضعيف
- وتأمين كلا من أطرافه العليا والسفلي مع شريط لاصق لتجنب حركة الجسم أثناء الإجراء. استخدام جهاز رسم قلب أثناء الإجراء لجميع الفئران.
- تنظيف جلد منطقة الصدر باستخدام مسحه البوفيدون/اليود 10% تليها مسحه إيثانول 70%. تطبيق طبقة سميكة من هلام لمنطقة الصدر للماوس-
- جبل محول في الحامل وتعديل موقفها حتى البطين الأيسر واضحة للعيان في مجال الرؤية. إبرة
- حمولة 150 ميليلتر من تعليق خلية همسك ترانسدوسيد (2 × 10 6 همسكس في 150 ميليلتر من PBS العقيمة) في محقن 1 مل مع 28-جي وتأمين المحاقن لصاحب المناسبة. تصور الدم النابض، تبقى عمود هواء صغيرة في المحاقن. لتجنب التثاقل، تعليق الخلايا قبل الحقن.
- النهوض المحاقن صوب الصدر الماوس، وضبط مسار الإبرة باستخدام التوجيه بالموجات فوق الصوتية، وأدخل البطين الأيسر.
- عقب توجيه التصوير بالموجات فوق الصوتية، اختراق إبرة المحقن من خلال الفضاء ربية وفي البطين الأيسر للماوس-
ملاحظة: ينبغي نصيحة إبرة حقنه مرئية بوضوح في البطين الأيسر على الصورة أولتراسونوجرافيك. ينبغي تأكيد التنسيب السليم المزيد من تدفق الدم الشرياني الطازجة في المحاقن. هذه علامات الإدراج الناجح- - حقن تعليق خلية همسك ببطء شديد أكثر من 2 دقيقة، تطبيق قبل لطيفسوري-
- بعد حقن الخلايا مع وقف التنفيذ، بلطف سحب الإبرة، نظيفة قبالة هلام الموجات فوق الصوتية، وحرر الماوس من قيود الشريط.
- وضع الحيوان في قفص جديدة ونظيفة مع لوحة مسخن.
ملاحظة: بعد انتهاء الإجراء، بيئة دافئة ينبغي توفير للفئران حتى الشفاء. وينبغي تجنب التدفئة الزائدة، نظراً لتوسع الأوعية الطرفية يهدد الانتعاش. ينبغي أن ترصد عن كثب الفئران وتبقى معزولة من الفئران الأخرى حتى شفائهم الكامل، يتبين من قدرتهم على الحفاظ على ريكومبينسي القصية. - رصد الحيوان حتى تحقق الانتعاش الكامل من التخدير ويوميا حتى نهاية التجربة.
3. التصوير الإضاءة الحيوية (BLI) من همسكس
- صورة الفئران 24 ساعة بعد الحقن إينتراكاردياك في الإضاءة الحيوية نظام التصوير. ابدأ في فيفو برامج التصوير. تهيئة نظام التصوير وفتح دراسة جديدة.
- في لوحة التحكم، تعيين المعلمات التصوير بواسطة النقر فوق " تسلسل الإعداد. " في وضع التصوير، وحدد " التﻷلؤ " و " الصورة. " تعيين أوقات التعرض من 0.5 s إلى الحد الأدنى 10 تعيين binning إلى " المتوسطة " و F /وقف إلى " 1. " تعيين عامل التصفية الإثارة إلى " كتلة " وتصفية الانبعاثات إلى " مفتوحة. " تعيين مجال الرؤية " ج " لاثنين من الفئران. إضافة إعداد تسلسل لمعالج الصورة عن طريق النقر على لوحة تحكم حيازة.
- التبديل على ضخ الأكسجين ومجموعة إيسوفلوراني إلى 2.5 في المائة في الدائرة التعريفي ومخروط الآنف داخل الجهاز-
- حقن القائمة الماوس مع 300 ميليلتر من د-لوسيفرين (12.5 مغ/مل)-
- ضع الماوس في قاعة تحريض التخدير.
- بعد 2-3 دقيقة، نقل الماوس إلى في فيفو التصوير الدائرة، مع رئيسها في مخروط الآنف على المشعب التخدير. تطبيق مرهم الضوئية لحماية العينين أثناء التصوير. لصورة الفئران متعددة، استخدم يربك الضوء الأسود لمنع انعكاس الضوء على الفئران المتاخمة.
- انقر " الحصول على " الزر لبدء اكتساب الصورة 10 دقيقة بعد حقن لوسيفرين د.
- كرر الخطوتين 3.3-3.5 صورة أكثر الفئران.
- بعد اقتناء الصورة في فيفو، euthanize الفئران باستنشاق 2 CO متبوعاً بخلع عنق الرحم، للتأكد من الوفاة. إجراء التحليل السابقين فيفو.
- إذا كان يتم إجراء التحليل السابقين فيفو بعد 20 دقيقة، كرر حقن لوسيفرين (الخطوة 3، 3) قبل التضحية الفئران؛ إشارة BLI قد إنقاص 20 دقيقة بعد حقن لوسيفرين.
- تشريح الفئران إزالة القناة الهضمية كاملة (أي، من المعدة للمستقيم)، المساريقي العلوي العقدة الليمفاوية (مليون)، والرئتين، والطحال، والكبد. مكان لهم في أطباق بتري باستخدام ملقط ومقص 2 ، 4-
- وضع طبق بتري يحتوي على أجهزة اكسبلانتيد في قاعة التصوير واقتناء الصور BLI كل الخطوات 3.1 3.6.
- بعد الحصول على الصورة، نقل أجهزة اكسبلانتيد لعينات قوالب التي تحتوي على قطع الأمثل درجة الحرارة (OCT) مجمع. كريوفريزي العفن في-80 درجة مئوية باستخدام الثلج الجاف. أداء إيمونوهيستوتشيميستري باستخدام الأجسام المضادة لوسيفراس على الأجزاء المجمدة للتأكد من وجود همسكس 16-
- للتحديد الكمي لشدة الضوء، استخدم منطقة أداة الفائدة (ROI) في 16 ، لوح ألوان أداة 19. حدد الإطار العائد على الاستثمار، ونقله إلى منطقة فائدة على الصورة. انقر فوق " دوروا القياس " وحفظ البيانات في تنسيق ملف SEQ. تصدير البيانات كملف.txt واستخدام البرمجيات الإحصائية لإجراء الاختبارات الإحصائية الأساسية للقياس الكمي 16-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 أن همسكس يمكن أن تكون ترانسدوسيد مع المراسل ثلاثية في كفاءة عالية، والحفاظ على خصائص الخلايا الجذعية الخاصة بهم. يمكن تصور همسكس ترانسدوسيد في الوقت الحقيقي من BLI (الشكل 1، الشكل 3). هذه الرواية، والاسترشاد بالموجات فوق الصوتية ضخ همسكس في البطين الأيسر للفئران عصيدة يضمن نسبة نجاح عالية جداً للحقن، مما يسمح للانتعاش السريع للفئران مع أدنى معدلات الاعتلال والوفيات (الشكل 2). متوسط الوقت للحقن ماوس واحدة مع همسكس حوالي 10 دقيقة، وأقل من 8-9% معدلات الاعتلال والوفيات لوحظت مع هذا الأسلوب. هو السبب الرئيسي لوفيات السكتة الدماغية وسد القلب من انصباب التامور النزفية. السابقين فيفو إجراء تحليل له 24 ساعة بعد الإدارة (داخل الشرياني) intracardiac همسك ويؤكد أن هذا الطريق من نتائج الإدارة في استضافة أكثر همسكس للامعاء الملتهبة من الفئران عصيدة، مقابل خالية من التهاب التحكم في الفئران (الشكل 3 و دال). وعلاوة على ذلك، همسكس لا تميل إلى البقاء في الفئران AKR خالية من التهاب الأمعاء وتبدأ تتراكم أو الوقوع في فخ الرئتين (الشكل 3B).
الشكل 1 -همسكس يمكن أن ترانسدوسيد مع "الكفاءة العالية" للتصور في فيفو ومع الاحتفاظ بخصائص الخلايا الجذعية. (أ) صورة مجهرية من همسكس ترانسدوسيد. تقييم نجاح توصيل من MSCs البشرية، حسبما تقرره التعبير مرفب مع التدفق الخلوي (ب) (ج)من BLI. همسكس ترانسدوسيد الاحتفاظ بخصائص الخلايا الجذعية، كما تؤكدها فحوصات التمايز التي تثبت قدرة همسكس ترانسدوسيد تفرق في chondrocytes و adipocytes وخلايا الاوستيوبلاستس. مقايسة وظيفية، كانت مزروع مكعبات السيراميك هيدروكسيباتيت/tricalcium الفوسفات مصفوفة تحت الجلد في الفئران "إخضاعها" CB17-بركدك المناعة لإثبات قدرة همسكس على تشكيل العظام المانحة حمل خارج الرحم (د). تغيير حجم أشرطة في A = 500 ميكرومتر. أشرطة مقياس في ج تشير إلى وحدات BLI (/steradian الفوتونات/s/سم23 10). تغيير حجم أشرطة في د = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : أدوات لحقن الموجهة بالموجات فوق الصوتية- (أ) طريقة عرض بانورامية الصكوك: نظام (الساحة الحمراء)، محول الطاقة المركبة في محلها حامل وحامل حقنه والجدول الجراحية مع نوسيكوني لالة التخدير التخدير (الساحة الخضراء)، واستنشاق تصوير القلب بالموجات فوق الصوتية مع الدائرة التعريفي (المربع الأصفر). (ب) صورة أولتراسونوجرافيك من إبرة المحقن: تلميح إبرة (السهم الأحمر) واضحة للعيان داخل البطين الأيسر (الأسهم الصفراء). (ج) تدفق الدم الشرياني الطازجة في المحاقن يؤكد نجاح إدخال إبرة المحقن في البطين الأيسر قبل الإدارة همسك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . همسكس Localize إلى الأمعاء الدقيقة بعد Intracardiac-arterial داخل الإدارة في الفئران عصيدة. صور الممثل للفئران/المجموعة 3-4، تظهر euthanized 24 ساعة بعد الحقن ومن ثلاث تجارب مستقلة. في فيفو تصوير الإضاءة الحيوية يوضح وجود همسكس في الفئران عصيدة و AKR 24 ساعة بعد الحقن (A). تحليل السابقين فيفو في الفئران عصيدة يوضح أن همسكس تعريب تفضيلي للامعاء الدقيقة (أي موقع التهاب) (د)، في حين أنها تميل إلى عدم البقاء في الأمعاء الدقيقة للتحكم خالية من التهاب AKR الفئران (ج). في الواقع، يبدأ همسكس بعد مرور أول الشرياني، تتراكم أكثر في رئات الفئران عكر، بدلاً من الفئران عصيدة (ب). يمكن أيضا الكشف عن جزء صغير من همسكس في الطحال والكبد والرئتين من الفئران عصيدة وعكر (ب، ج، د). أشرطة مقياس يشير إلى وحدات BLI (/steradian الفوتونات/s/سم23 10). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تصف هذه الدراسة تقنية جديدة لحقن همسكس في نموذج الفأرة صغيرة والأمعاء من القرص المضغوط التجريبي intracardiac الموجهة بالموجات فوق الصوتية. هذه التقنية بمعدل مرتفع جداً للبقاء على قيد الحياة والنجاح، كما يمكن تعديل مسار الإبرة استناداً إلى صور عالية الجودة وفي الوقت الحقيقي البطين الأيسر الماوس، قدمتها الموجات فوق الصوتية. ميزة التسليم إلى البطين الأيسر هو أن همسكس ثم توزع داخل أرتيريالي وتجاوز الدورة الدموية الوريدية، وبالتالي تجنب تجميع الخلايا الموجودة في الرئتين. سابقا، كان استخدام قسطرة الشريان السباتي للتسليم داخل الشرايين لحقن MSCs16،21. يتضمن الأسلوب قسطرة السباتي الجراحة لفضح الشريان السباتي من أجل وضع قسطرة داخل الشريان. القسطرة متقدمة نحو قوس الاورطي لنقل الدم للخلايا. وبعد ذلك يتم إزالة القسطرة ومتصلة الشريان السباتي. هذه التقنية الجديدة لحقن MSCs في البطين الأيسر، بالمقارنة مع قسطرة الشريان السباتي، الموجهة بالموجات فوق الصوتية أقل الغازية، كثير أسرع (حوالي 10 دقيقة/الماوس مقابل 60 دقيقة/الماوس)، ولديه أقل من معدلات الاعتلال والوفيات (< 10% مقابل 30%). ترجمة السريرية من حقن الفأر intracardiac الموجهة بالموجات فوق الصوتية من همسكس للتجارب السريرية البشرية سيكون عن طريق القسطرة للشريان المساريقي العلوي (يقوم حاليا لعلاج الاسكيمية المساريقي العلوي المزمنة و نزيف الجهاز الهضمي مستعصية) لتسليم همسكس إلى الأمعاء المريضة.
وهناك عدة اعتبارات تتعلق بالتعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لحقن إينتراكاردياك الموجهة بالموجات فوق الصوتية همسكس في البطين الأيسر للماوس. جانبا مهما من هذا الإجراء هو إتقان استخدام الموجات فوق الصوتية لإرشاد إبرة حقن في البطين الأيسر. مثل أي الداخلي والتدريب السليم والممارسة وردود فعل الخبراء عنصران مهمان لنجاح تنفيذ هذا الإجراء. يمكن أن يؤدي الأسلوب الفقراء لسد القلب من انصباب التامور النزفية والموت. للتقليل إلى أدنى حد الخلية التثاقل وخطر الانصمام للدماغ (أي، السكتة الدماغية)، من الضروري أن ريسوسبيند همسكس قبل كل حقنه. قبل تنفيذ هذا الإجراء، من المهم استشارة الطبيب البيطري المسؤول عن منشأة أبحاث الحيوانات المحلية للحصول على مشورة الخبراء. ضمان التقيد بالمبادئ التوجيهية لاستخدام الحيوانات في آمنة وفعالة للتقليل من الإصابات غير المقصودة للفئران.
لدراسة بيوديستريبوشن همسكس بعد حقن الفئران، كانت ترانسدوسيد همسكس بنجاح مع مراسل ثلاثية، بكفاءة عالية. فحوصات التفريق يقوم برهن على قدرة همسكس ترانسدوسيد تفرق في chondrocytes و adipocytes و osteocytes18. للمقايسة الوظيفية أوستيوجينيك، مكعبات السيراميك هيدروكسيباتيت/tricalcium الفوسفات مصفوفة تم زرعها تحت الجلد في الفئران نظام المناعة، وبرهن على قدرة همسكس على تشكيل الجهات المانحة خارج الرحم العظام17،18 . هذه المفاضلة والاختبارات الفنية تثبت أن همسكس ترانسدوسيد تحتفظ خصائص الخلايا الجذعية. وتظهر نتائج هذه الدراسة أن همسكس ترانسدوسيد التي تستخدم لحقن إينتراكاردياك في الفئران عصيدة تعريب للامعاء الدقيقة، وهو موقع لالتهاب في الفئران عصيدة. في الفئران AKR خالية من الالتهابات المعوية، سوى أقلية همسكس مترجمة للامعاء 24 ساعة بعد الحقن، مما يعني أنه في حالة عدم وجود التهاب، لا تبقى همسكس في الأمعاء. هذه البيانات يتم بالتوافق مع عدة دراسات أخرى أظهرت قدرة MSCs ترحيل وانجرافت في موقع الإصابة، مثل القلب في احتشاء عضلة القلب الحاد22 و BM أصيب في ساقه إصابة الإشعاع16. مثل الأمراض الأخرى، أظهرت المحلية تطبيق MSCs على نماذج الإصابة colonic فعالية في تخفيف التهاب23. في نموذج حمض السلفونيك (تنبس) 2,4,6-ترينيتروبونزيني من التهاب القولون في الفئران، تسارع هاياشي et al. MSCs المستمدة من BM حقن سوبموكوسا القولون الفئران، المحيطة بالمنطقة تتعرض تنبس، وأظهر شفاء من التهاب القولون23 .
تستخدم تقنية رواية من حقن المنظار-بمساعدة من colonic MSCs في القولون البعيدة، موقع الإصابة colonic، في الفئران البروستاغلاندين التي تفتقر إلى دراسة حديثة أجرتها مانيري et al. وأظهرت فعاليتها في منع تشكيل اختراق قرحة5. عصيدة نموذج لالتهاب الأمعاء الصغيرة، ولا تتطور هذه الفئران عفوية التهاب القولون بهم. وضع المختبر والتحقق من صحة أسلوب التنظير للتقدير والقياس الكمي لالتهاب colonic والتنمية الورم في الفئران. ومع ذلك، أجهزة المنظار ليست قادرة على الوصول إلى الأمعاء الدقيقة في ماوس يعيش24. يمكن فقط استخدام سجل النظام كأسلوب المحطة الطرفية لتقييم التهاب في الفئران عصيدة بعد القتل الرحيم. ولذلك، الأسلوب بالمنظار ليست مناسبة للتطبيق المحلي من MSCs في نموذج عصيدة. باستخدام هذه التقنية الجديدة للحقن، يمكن أن يتحقق تعزيز توطين MSCs للامعاء. سواء التعريب زيادة للامعاء الملتهبة سيترجم إلى زيادة فعالية غير معروف وسوف يكون تركيز الدراسات المستقبلية. بالإضافة إلى نموذج عصيدة، حقن الموجهة بالموجات فوق الصوتية MSCs سيكون وسيلة مفيدة لتعزيز إضفاء الطابع المحلي على همسكس في نماذج أخرى من التهاب الأمعاء الصغيرة، مثل نموذج موريني6 TNFΔRE من القرص المضغوط التجريبي.
BLI حساسة وتقنية ملائمة يمكن استخدامها متسلسل لتعقب همسكس في فيفو، لكنه لا يسمح للتحديد الكمي الدقيق لصاروخ موجه همسك. استفادة من استخدام همسكس ترانسدوسيد مراسل ثلاثية في الفئران أن ttk الإنزيم في المراسل الثلاثي يسمح لأكبر كمية بوزيترون التصوير المقطعي (الحيوانات الأليفة) التصوير19. الجمع بين كمية عالية الحيوانات الأليفة التصوير (مع تحقيق radiotracer) مع مسح التصوير المقطعي (CT) (توفير التعريب) يسمح لتقدير كمي لعدد همسكس انجرافتيد في موقع المريضة، كما يتناسب مع التهم غاما عدد من همسكس قابلة للتطبيق المسمى مع الجين ttk. يمكن أن تساعد في تحديد النسبة المئوية لصاروخ موجه همسكس والفعالية العلاجية الكمي الدقيق للتعريب همسك وسوف يكون تركيز الدراسات المستقبلية.
هذا الأسلوب، على الرغم من مزاياها العديدة، لديه بعض القيود: ط) الشرط لنظام الفئران، والثاني) للوفيات والإصابة بالأمراض المرتبطة بحقن إينتراكاردياك، وثالثاً) عدم القدرة على استخدامها لتصوير الموجات فوق الصوتية قلبية مكلفة التسريب البطيء (أي،م > على مدى ساعات) من الخلايا والجزيئات الأخرى. وعلى الرغم من هذه القيود، فله العديد من المزايا التقنية الحالية قسطرة الشريان السباتي لحقن الشرايين داخل همسكس، كما تم التأكيد عليه أعلاه.
وفي الختام، تظهر نتائج هذه الدراسة فعالية وراحة لأسلوب الحقن الموجهة بالموجات فوق الصوتية لتحسين توطين همسكس على موقع التهاب في نموذج عصيدة من القرص المضغوط التجريبي. وستحدد الدراسات المستقبلية إذا كان صاروخ موجه زيادة من همسكس عن طريق التسليم داخل الشرايين يمكن أن يؤدي إلى زيادة الفعالية العلاجية في نماذج التهاب الأمعاء الصغيرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ديف مانيش معتمد من قبل وزارة الدفاع منحة PR141774 وكرون ومؤسسة التهاب القولون لجائزة التنمية المهنية الأمريكية. مختبر كومينيلي فابيو معتمد من قبل المعهد الوطني للصحة ويمنح DK042191 (نادي)، DK055812 (نادي)، DK091222 (نادي) و DK07948 (نادي). مختبر "أرنولد كابلان" تدعمه في الجزء هاء فيرجينيا بالدوين مؤسسة وديفيد ل.. وكالات التمويل لا دور في تحليل الدراسة أو كتابة المخطوطة. محتوياته هي المسؤولة الوحيدة عن مقدمي البلاغ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-LG | Gibco | 31600-091 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25-200-072 | |
| Proteamine Sulfate | Sigma Aldrich | P4020-1G | |
| D-Luciferin | Goldbio | luck-500 | |
| Fetal Bobine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| 175 cm tissue cutlure flasks | Corning | 431080 | |
| 75 cm tissue cutlure flasks | Corning | 430720 | |
| Centrifuge tubes | Crysalgen | 23-2265 | |
| Tissue-Plus O.C.T. compound | Fisher HealthCare | 4585 | |
| Cryomold Standard | Tissue-Tek | 4557 | |
| Lenti-Pac HIV Expression Packaging System | GeneCopoeia | HPK-LvTR-20 | |
| Povidone Ionidine swabs | Medline | MDS093901 | |
| Hair removal cream | Nair | N/A | |
| Isoflurane | Piramal Helathcare | NDC 66794 013 25 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Aquasonic 100 ultrasound transmission gel | Parker laboratories | 01 08 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SAMP mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| AKR mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| Vevo 770 imaging system | Visual Sonics, Toronto, Canada | ||
| IVIS spectrum series system | PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Living image software | CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Triple reporter | Kindly provided by Dr. Zheng- Hong Lee, CWRU, (citation 19) |
References
- Duijvestein, M., et al. Pretreatment with interferon-gamma enhances the therapeutic activity of mesenchymal stromal cells in animal models of colitis. Stem Cells. 29 (10), 1549-1558 (2011).
- Sala, E., et al. Mesenchymal Stem Cells Reduce Colitis in Mice via Release of TSG6, Independently of Their Localization to the Intestine. Gastroenterology. 149 (1), 163-176 (2015).
- Gonzalez, M. A., Gonzalez-Rey, E., Rico, L., Buscher, D., Delgado, M. Adipose-derived mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis by inhibiting inflammatory and autoimmune responses. Gastroenterology. 136 (3), 978-989 (2009).
- Dave, M., et al. Stem cells for murine interstitial cells of cajal suppress cellular immunity and colitis via prostaglandin e2 secretion. Gastroenterology. 148 (5), 978-990 (2015).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. J. Clin. Invest. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Kontoyiannis, D., Pasparakis, M., Pizarro, T. T., Cominelli, F., Kollias, G. Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies. Immunity. 10 (3), 387-398 (1999).
- Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. N. Engl. J. Med. 361 (21), 2066-2078 (2009).
- Dave, M., Papadakis, K. A., Faubion, W. A. Immunology of inflammatory bowel disease and molecular targets for biologics. Gastroenterol. Clin. North Am. 43 (3), 405-424 (2014).
- Dave, M., et al. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Inflammatory Bowel Disease: A Systematic Review and Meta-analysis. Inflamm. Bowel Dis. 21 (11), 2696-2707 (2015).
- Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), (2016).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Gao, J., Dennis, J. E., Muzic, R. F., Lundberg, M., Caplan, A. I. The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion. Cells Tissues Organs. 169 (1), 12-20 (2001).
- English, K. Mechanisms of mesenchymal stromal cell immunomodulation. Immunol Cell Biol. 91 (1), 19-26 (2013).
- Pizarro, T. T., et al. SAMP1/YitFc mouse strain: a spontaneous model of Crohn's disease-like ileitis. Inflamm. Bowel Dis. 17 (12), 2566-2584 (2011).
- Lennon, D. P., Caplan, A. I. Isolation of human marrow-derived mesenchymal stem cells. Exp. Hematol. 34 (11), 1604-1605 (2006).
- Lin, P., et al. Serial transplantation and long-term engraftment of intra-arterially delivered clonally derived mesenchymal stem cells to injured bone marrow. Mol. Ther. 22 (1), 160-168 (2014).
- Dennis, J. E., Caplan, A. I. Porous ceramic vehicles for rat-marrow-derived (Rattus norvegicus) osteogenic cell delivery: effects of pre-treatment with fibronectin or laminin. J. Oral Implantol. 19 (2), 106-115 (1993).
- Lin, P., et al. Efficient lentiviral transduction of human mesenchymal stem cells that preserves proliferation and differentiation capabilities. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 886-897 (2012).
- Love, Z., et al. Imaging of mesenchymal stem cell transplant by bioluminescence and PET. PET. J. Nucl. Med. 48 (12), 2011-2020 (2007).
- Haynesworth, S. E., Goshima, J., Goldberg, V. M., Caplan, A. I. Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow. Bone. 13 (1), 81-88 (1992).
- Ishizaka, S., et al. Intra-arterial cell transplantation provides timing-dependent cell distribution and functional recovery after stroke. Stroke. 44 (3), 720-726 (2013).
- Schenk, S., et al. Monocyte chemotactic protein-3 is a myocardial mesenchymal stem cell homing factor. Stem Cells. 25 (1), 245-251 (2007).
- Hayashi, Y., et al. Topical implantation of mesenchymal stem cells has beneficial effects on healing of experimental colitis in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326 (2), 523-531 (2008).
- Kodani, T., et al. Flexible colonoscopy in mice to evaluate the severity of colitis and colorectal tumors using a validated endoscopic scoring system. J. Vis. Exp. (80), e50843 (2013).
