Summary
Fare modelleri kolon iltihabı çalışmalarda Mezenkimal Kök hücre (MSC) küçük bir yüzdesi (% 1-5) intravenöz enjekte veya intraperitoneally iltihaplı kolon1,2için ev gösterdi. Bu çalışmada ultrason destekli MSCs İntrakardiyak enjeksiyonlari bağırsak için artan yerelleştirme neden gösterir.
Abstract
Crohn hastalığı (CD) ortak bir kronik inflamatuar hastalık küçük ve büyük bağırsak var. Fare ve insan Mezenkimal Kök hücre (MSCs) immünsupresif potansiyele sahip ve yönetim rotanın kendi posta ve etkinliği 1 sınırlayabilirsiniz olsa bile iltihap bağırsak iltihabı, fare modelleri bastırmak için gösterilmiş olan , 3 , 4 , 5. yerel MSCs uygulamaya kolon yaralanma modelleri kolon iltihabı ameliorating, daha fazla etkinlik göstermiştir. Ancak, veri üstünde insan kemik iliği türevi MSCs (hMSCs) ince bağırsak iltihabı deneysel Crohn hastalığı, SAMP-1/YitFc (SAMP) modeli sitesi için yerelleştirme geliştirmek için teknik yetersizliği vardır. Bu eser hMSCs kronik bağırsak iltihabı iyi karakterize spontan modeli SAMP farelerde ultrason destekli İntrakardiyak enjeksiyon için yeni bir teknik anlatılmaktadır. Cinsiyet ve yaş-eşlemeli, inflamasyon-Alerjik AKR/J (AKR) fare denetimleri kullanılmıştır. Biodistribution ve yerelleştirme çözümlemek için hMSCs üç kişilik bir muhabir içeren bir lentivirus ile transduced. Üçlü muhabir ateş böceği luciferase (fl), kollarındaki görüntüleme için oluşuyordu; hücre sıralama için monomeric kırmızı floresan protein (mrfp); ve kesilmiş herpes simpleks virüs timidin kinaz (ttk), Pozitron emisyon tomografisi (PET) görüntüleme. Bu çalışmanın sonuçları bu 24 h İntrakardiyak yönetim sonra ince bağırsak iltihabı-Alerjik AKR fareler aksine SAMP farelerin hMSCs yerelleştirmek göster. Bu roman, ultrason destekli enjeksiyon SAMP fare sol ventrikül hMSCs yüksek başarı oranı hücre teslimat, minimal morbidite ve mortalite ile fare hızlı kurtarma için izin sağlar. Bu teknik MSCs gelişmiş yerelleştirme TNFΔRE6gibi küçük bağırsak iltihabı diğer modelleri için yararlı bir yöntem olabilir. Gelecekteki çalışmalar hMSCs içi Arteryel teslim tarafından artan lokalizasyonu için artan tedavi edici etkinliği yol açabilir Eğer belirleyecektir.
Introduction
Crohn hastalığı (CD) ortak bir kronik inflamatuar hastalık küçük ve büyük bağırsak ve ana bilgisayar bağışıklık sisteminin uygunsuz bir yanıt bağırsak mikropları7,8' e neden olarak düşündüm. Son yıllarda yapılan çalışmalarda fare ve insan Mezenkimal Kök hücre (MSCs) iltihabı bağırsak iltihabı1,3,4,5fare modellerinde önleyebilirsiniz göstermiştir. İnsan MSCs kemik iliği veya yağ dokusu türetilmiş CD9içerir (IBD), iltihabi bağırsak hastalığı olan hastalarda tedavi kullanmak birden fazla devam eden klinik çalışmalar vardır. MSC tedavisi için iki güzergah bu klinik çalışmalarda kullanılan: bir sistemik infüzyon içerir (Yani, intravenöz) MSCs luminal IBD (CD dahil) ve diğer, yerelleştirilmiş uygulama/enjeksiyon fistül kök hücrelerin içerir perianal CD hastalarda yolu. Bir son meta-analiz IBD, sistemik için MSC tedavisinin (Yani, intravenöz) luminal IBD (CD dahil) için MSC terapi içinde % 40 kadar etkili (% 95 GA: 7-%79) hastaların, etkinliği % 61 daha yüksek ise (% 95 CI: 36-%85), ne zaman MSCs Yerel olarak hastalıklı CD fistül9içine enjekte edildi. Son aşama III multicenter allojeneik yağ kök hücrelerin doğrudan CD hastalar şifa perianal fistüllere istatistiksel olarak anlamlı klinik ve radyolojik kanıt gösterdi perianal fistül enjekte plasebo kontrollü randomize, meta-analiz10bulguları corroborating. MSC terapi intravenöz luminal CD için verilen düşük etkinliği nedenlerle yeterli ölçüde araştırdık ama MSCs yetersiz posta inflamasyon siteye nedenlerinden biri olabilir. Fare modelleri kolon iltihabı çalışmalarda intravenöz enjekte MSCs (% 1-5) küçük bir yüzdesi ulaşmak sadece iltihaplı kolon; kalan MSCs akciğer (ilk geçiş etkisi)1ile,2 süzülür göstermiştir ,5,11,12. Birden çok fare araştırma çalışmaları bu nedenle MSC İdaresi kulunç4hayvan modellerinde mayi rota (IP) kullanılmaktadır. Ancak, onlar da sadece hücreleri küçük bir kısmını ulaşmak ve iki nokta üst üste engraft ve etkinliği olduğunu tümör nekrozis faktör-indüklenebilir gen 6 protein gibi çözünebilir parakrin faktörler salgılanmasını (TSG-6)2ile ilgili olduğunu gösterdi. MSC mekanizması immünosupresyon ve iyileşme parakrin içerir bir multipronged yaklaşım içerir; TSG-6 gibi hücre yakınlık bağımsız faktörler; ve gibi yakın bağlı faktörler, hücre ölüm-ligand 1 (PD-L1); programlanmış ya da pürüzlü 1. Bu nedenle, siteye MSC yerelleştirilmesini iltihap artan etkinliği9,13' te neden olabilir. Aslında, yeni yapılan bir çalışmada kolon yaralanma sitesinde doğrudan implante MSCs angiogenez teşvik vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) salgılayan tarafından iyileşmesinde sonuçlandı gösterdi. Öte yandan, en az bir iyileştirici etkisi sonra intravenöz enjeksiyon5belirtilmişti. Siteye kendi yerelleştirme inflamasyon (Yani, bağırsakta SAMP fareler) artırmak için sol ventrikül yönetiminde yüksek lisans için bu İntrakardiyak enjeksiyon ultrason destekli teknik geliştirilmiştir. Görüntü güdümlü enjeksiyon daha yüksek oranda başarı için yol açar ve morbidite ve mortalite oranları azalmıştır doğru bir enjeksiyon sağlar. Ayrıca, sol ventrikül içine MSCs enjeksiyon onları arteriyel dolaşımı, onlar iltihaplı bağırsak küçük ciğerlerine olma önce ulaşabilecekleri teslim eder.
Bu çalışmada, insan kemik iliği türevi MSCs (hMSCs) enjeksiyon CD14, SAMP-1/YitFc (SAMP) fare modeli için kullanılmıştır. SAMP bir iyi karakterize spontan fare ile neredeyse % 100 alellerle14küçük bağırsak iltihabı geliştirir kronik inflamasyon modeldir. İltihap yanıt mikrofloranın yokluğunda, herhangi bir kimyasal, immünolojik ve genetik manipülasyon olarak geliştirir ve çok benzeyen insan CD11. AKR/J (AKR) fareler, inflamasyon-Alerjik, SAMP, ebeveyn kontrolü fareler cinsiyet ve yaş bahisler bu çalışmada kullanılmıştır.
HMSCs izole ve aydınlatılmış onam kullanılarak doğrulanır ve önceden protokolleri15,16yayınlanan normal, kimliği belirsiz bağış elde edilen kemik iliği (BM) örneklerinden laboratuvarda genişletilmiş. Yalıtım ve genişleme, MSC yetenek sonra içinde Osteojenik, Adipojenik ve chondrogenic farklılaşma birden çok deneyleri15tarafından laboratuvar olarak değerlendirilmesi. Osteojenik fonksiyonel tahlil hidroksiapatit/TRİKALSİYUM fosfat matris hMSCs subkutan olarak immün CB17-Prkdc SCID fareler17içeren seramik küpler Reproduction tarafından gerçekleştirildi. Küp tahlil osteogenesis ve chondrogenesis potansiyel gösterir ve bireysel MSC ürünleri17değerlendirmek için nihai test olarak kabul edilir. HMSCs in vivo enjeksiyon sonra görselleştirmek için lentivirus hMSCs ateş böceği luciferase (fl), monomeric kırmızı floresan protein (mRFP) ve herpes simpleks viral timidin kinaz (ttk oluşan üç kişilik muhabir gen yapısı ile transduce için kullanılan ), bir değiştirilmiş miyoproliferatif sarkomu virüs (Tümen) organizatörü18tarafından tahrik. Ateş böceği luciferase üçlü muhabir olarak o örtü enjekte biyoluminesans hMSCs oxyluciferin için bir enzimdir ve fotonlar/beyaz ışık üretir. Bu bir vivo içinde görüntüleme sistemi, canlı hMSCs farelerde görselleştirme etkinleştirme optik hassas şarj kuplajlı cihaz (CCD) kamera (bioluminescence) tarafından algılanır. (BLI) görüntüleme bioluminescence seri olarak hücreleri izleme ve ex vivo analiz için kullanılabilecek hassas bir tekniktir. Güçlü tümen organizatörü kullanımı üçlü füzyon muhabir gen yapısı sürekli ifade ediyor ve enjekte hMSCs görüntüleme için daha--dan 16 hafta19sağlar. HMSCs transduce ve düşük iletim verimliliği var zordur. En iyi duruma getirilmiş bir iletişim kuralını kullanarak, hMSCs iletim verimliliği geliştirildi ve gelişmiş18transgene ifade edildi. MRFP ifade (bir üçlü reporter genler) Akış Sitometresi üzerinde kullanarak, hMSCs % 83'e varan yüksek bir verimlilik ile transduce yeteneği gösterilmiştir. Farklılaşma deneyleri ve in vivo küp deneyleri kondrosit, adipositler ve osteocytes17ayırt etmek için transduced hMSCs yeteneğini gösterdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
tüm fareler deneyler ve yordamlar çalışma Case Western Reserve Üniversitesi tarafından onaylanmıştır ' s kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi. Yordamlar Derneği değerlendirmesi için yapılmıştır ve laboratuvar hayvan bakımı (AAALAC) akreditasyonu tesis akredite. Aydınlatılmış onam sonra üniversite hastaneleri kurumsal inceleme Kurulu tarafından onaylanan Protokolü Case Western Reserve Üniversitesi, kök hücre çekirdeği tesisinde altında BM Aspire.
1. Kültür ve iletim insan kemik iliği elde edilen Mezenkimal Kök hücre (hMSCs)
Not: hMSCs yalıtım'da önceki yayınları 15 ayrıntılarıyla anlatılan , 20.
- Kültür izole hMSCs Dulbecco içinde ' s modifiye kartal orta-düşük glikoz (DMEM-LG) orta % 10 fetal sığır serum ile (FBS) desteklenmiştir. 37 ° C, % 95 nem oranı ve % 5 CO 2 ' T175 şişeler büyüme ortamının 25 mL ile hücre kültür. Orta yerine 3-4 günde. 14 günde hMSCs birincil geçişi gerçekleştirin.
- Ne zaman hücreleri % 80 izdiham ulaşmak, tamamen eski orta kaldırmak ve 5 mL steril fosfat tamponlu tuz içeren hücreleri nazikçe yıkayın (PBS; 75 cm doku kültürü Şişeler için).
- PBS balonun kaldırın ve 4 mL % 0.25 tripsin-ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ekleyin. Şişeye geri 37 ° C'de kuluçka 5-10 dakika süreyle yer pozlama süresi olabildiğince kısa tutmak.
- Hücreleri çoğunluğu çok yönlü olmuştur ya da kültür çanak bağlantısız, reaksiyon sığır buzağı serum tripsin yarım hacmi eşit hacmi ekleyerek durdurur.
- Hücre süspansiyon bir uygun büyüklükteki santrifüj tüpü aktarın. Senaryo Özeti 400 x g 5 min için santrifüj kapasitesi ve dikkatle süpernatant kaldır.
- Resuspend 5 mL orta de hücrelerde (DMEM-LG + % 10 FBS) ve bir hemasitometre içeren hücreleri saymak.
Not: Bu noktada, hücreleri olabilir subcultured veya üçlü gazeteci transduced.
- HMSCs iletim üçlü reporter ile gerçekleştirmek.
- Bir T175 tohum 1.5 x 10 6 hücrelerde şişesi. 37 ° C, %95, nem oranı ve % 5 CO 2 büyüme ortamının 25 mL hücrelerde kültür. Hücreler eklemek için 24 saat bekleyin.
- Başvuru 18 ' açıklandığı gibi bir virüs 15 mL tüpler, kokteyl yapmak.
- Tezcan lentivirus 37 ° c bir su banyosu. Dulbecco içinde bir 5 mg/mL proteamine sülfat çözümün 160 µL eklemek ' s modifiye kartal orta (DMEM) ve kültür ortamının 8 mL (DMEM-LG + % 10 FBS) 100 µg/mL nihai bir konsantrasyon için. Girdap için 3 s. Ekle bir virüs çeşitlilik enfeksiyon (MOI) 5 (1 kez çözdürülen) .
- Orta hücre kültür şişeye (Adım 1.2.1) kaldırın ve virüs kokteyl hücrelere ekleyin. 10 h 37 ° C, % 95 nem oranı ve % 5 CO 2 için kuluçkaya.
- 4 mL DMEM-LG + %10 100 µg/mL proteamine sülfat 4 mL ekleyin FBS ve ek 14 h için kuluçkaya
- 24 saat sonra iletim Orta 25 mL ile değiştirerek durdurmak (DMEM-LG + % 10 FBS).
- Akış Sitometresi 18 tarafından mRFP ifade değerlendirme tarafından Onayla iletim verimliliği.
Not: Burada, transduced hMSCs ile % 65'den fazla verimlilik kullanıldı. - Yanında eski yerine koymak ile 25 mL taze orta hücreleri genişletin (DMEM-LG + % 10 FBS) haftada iki kez. 37 ° C, %95, nem oranı ve % 5 CO 2 hücre kültür. Geçiş hücreleri % 80 izdiham ulaşmak sonra.
- Hücreler için istediğiniz sayıyı ulaşıldığında, trypsinization adımları 1.1.2 - 1.1.4 başına gerçekleştirmek.
- Hücreleri saymak ve onları steril PBS askıya (1 x) son konsantrasyonu 1 x 10 içinde 6 hücreler/75 µL. tutmak taşıma için buz hücrelerdeyse ultrason makineye. Deneyler için hMSCs geçit numaralardan 2-5 kullanın.
2. Ultrason güdümlü hMSCs biri İntrakardiyak enjeksiyon sol ventrikül
Not: kullanım SAMP1/YitFc kurulan küçük bağırsak iltihabı ve yaş ve cinsiyet uyumlu AKR/J fareler ile deneyler için. SAMP ve AKR fareler patojen-Alerjik belirli koşullar altında sürdürmek, standart laboratuvar chow besledin ve 12-h açık/koyu döngüleri kalsınlar. Burada, ultrason destekli kardiyak enjeksiyonları bir dezenfektan ile temizlenmiş ve % 70 alkol ile durulanır CWRU hayvan araştırma tesisi bulunan özel patojen-Alerjik kardiyak ultrason odasında yapıldı. Laboratuar araştırma personeli İntrakardiyak enjeksiyonlar sırasında önlük, göz kalkanları ve steril eldiven ile yüz maskesi dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman takmalıdır. Vücut ısısı fare yordam süresince korunmalı.
- Ultrason görüntüleme sistemi fare anesthetizing önce ayarlayın. Bu iletişim kuralı için fare ekokardiyogram için tasarlanan ultrason makinesi kullanın.
- Güç ve başlatma dönüştürücü (30 MHz) yeni çalışma ayarlamak için açın.
- % 3-4 isoflurane 0,2 oranında % 100 oksijen kullanarak bir indüksiyon odasında fare anestezi - 0,5 L/dk. %2 isoflurane burun konisi üzerinden % 100 oksijen ile tüm prosedürü için hayvan korumak. Görüntüleme gerçekleştirmeden önce uygun anesthetization onaylamak parmak pinching tarafından fare haddeleme ve hareketin yokluğu gözlemleyerek.
Not: Kornea kurutma önlemek için anestezi indüksiyon takip gözlere oftalmik merhem uygulanmalıdır. İmzalat fareler görüntüleme makineleri (Yani, bioluminescence görüntüleme sistemi ve ultrason), nereye onlar-ecek almak bir anestezik isoflurane bakım doz aktarın. Anestezi başlangıç ve anestezi derinliği Pinch kuyruk üzerinde tepki eksikliği gözlemleyerek ve ayak yastık her 10 min anestezi süresi boyunca belirlemek. - Görüntüleme tablo ve ultrason jeli sıcaklık 37 için ayarlayın ° C.
- Kürk saç dökücü krem kullanarak imzalat fare Toraks alan üzerinde tamamen kaldırmak.
- Fare görüntüleme tablo sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve her iki üst ve alt ekstremitelerde vücut hareketleri işlem sırasında önlemek için yapıştırıcı bant ile güvenli. Bir Elektrokardiyogram işlem sırasında tüm fareler için sınırlanmadığını.
- Göğüs alanı % 70 etanol çubukla tarafından takip bir % 10 povidone/iyot bez kullanarak cildin temiz. Fare Toraks bölgesine jel kalın bir tabaka uygulayın.
- Dönüştürücü tutucuya mount ve sol ventrikül üzerinde görüş alanı açıkça görünene kadar konumunu ayarlamak.
- Yük 150 µL transduced hMSC hücre süspansiyon (2 x 10 6 hMSCs steril PBS 150 µL içinde) 28 G 1 mL şırınga içine iğne ve şırınga uygun sahibi için güvenli. Kalp gibi atan kan görselleştirmek için küçük hava sütun şırıngada tutun. Topaklanma önlemek için enjeksiyon önce hücreleri askıya alma.
- Şırınga fare Toraks doğru ilerlemek, ultrason rehberlik kullanarak iğne yörünge ayarlamak ve sol ventrikül girin.
- Ultrason görüntüleme rehberlik takip şırınga iğne interkostal uzayda ve fare sol ventrikül içine nüfuz.
Not: Şırınga iğne ucu sol ventrikül Ultrasonografik görüntü üzerinde açıkça görülebilir olmalıdır. Uygun yerleştirme daha fazla taze arteryel kan çıkış tarafından şırınga onaylanması. Bunlar başarılı bir ekleme işaretler. - HMSC hücre süspansiyon çok yavaş üzerinde 2 dk hafif pre uygulayarak, enjektessure.
- Enjeksiyon askıya alınan hücrelerin yavaşça ultrason jeli kapalı temiz iğne çekilme ve teyp bağlar üzerinden fare düğmesini serbest bırakın.
- Önceden ısıtılmış bir yastık ile yeni, temiz Kafesteki hayvan yer.
Not: yordamı tamamlandıktan sonra sıcak bir ortam kurtarma kadar fareler için sağlanmalıdır. Periferik vazodilatasyon kurtarma ödün vermez beri çok ısınmaya kaçınılmalıdır. Fareler yakından izlenmeli ve diğer farelerin sternal recumbency korumak için yeteneklerini tarafından belirtilen onların tam kurtarma kadar izole tuttu. - Tam kurtarma anestezi ve günlük deneme sonuna kadar elde edene kadar hayvan izlemek.
3. Bioluminescence (BLI) görüntüleme hMSCs
- görüntü fareler 24 saat sonra İntrakardiyak enjeksiyon görüntüleme sistemi bioluminescence. Düşsel bilgisayar yazılımı içinde vivo başlatın. Görüntüleme sistemi başlatmak ve yeni bir çalışma açın.
- Tıklatarak Denetim Masası'ndaki Görüntü parametreleri ayarlayın " sıra Kur. " görüntüleme modunda " ışıma " ve " fotoğraf. " pozlama süreleri 0,5 küme s 10 dk. için ayarlanmış binning " orta " ve F / durdurmak için " 1. " uyarma filtre ayarlamak " blok " ve emisyon filtre " açık. " görüş alanı ayarlamak " C " iki fareler için. Sıra kurulum için görüntü Sihirbazı'nı edinme kontrol panelinden eklenir.
- %2,5 indüksiyon odası ve makine içinde burun konisi oksijen pompası ile küme isoflurane geçiş.
- D-biyoluminesans (12.5 mg/mL) 300 µL ile fare ı.p. enjekte.
- Anestezi indüksiyon odasında fareyi getirin.
- 2-3 dk sonra fare odası, burun konisi anestezi manifold üzerinde başının ile görüntüleme vivo içinde içine transfer. Görüntüleme sırasında gözleri korumak için optik merhem uygulamak. Birden çok fare görüntü için siyah ışık baffle bitişik fareler üzerine ışığın yansıması engellemek için kullanın.
- 'I tıklatın " elde " D-biyoluminesans enjeksiyon sonra resim alma 10 dk başlatmak için düğmeyi.
- Daha fazla fare görüntüye 3.3-3.5 arasındaki adımları yineleyin.
- Ölüm onaylamak için servikal çıkığı tarafından takip CO 2 Solunduğunda fareler vivo içinde resim alma sonra ötenazi. Ex vivo çözümlemesi gerçekleştirin.
- Ex vivo çözümlemenin 20 dk sonra Eğer daha önce fareler; ödün biyoluminesans enjeksiyon (Adım 3.3) tekrar BLI sinyal 20 dk sonra biyoluminesans enjeksiyon düşebilir.
- Bütün gastrointestinal sistem (Yani, mide için rektum), Mezenterik lenf nodu (milyon), akciğer, dalak ve karaciğer kaldırmak için fareler incelemek. Onları petri yemeklerinde 2 , 4 forseps ve makas kullanarak yer.
- Görüntüleme odası explanted organlarda içeren petri kabına yerleştirin ve Saçınıza görüntüleri adımları 3.1-3.6 başına.
- Resim alma sonra explanted organları en uygun kesme sıcaklık (OCT) bileşik içeren numune kalıpları için transfer. Cryofreeze-80 ° c kuru buz kullanarak kalıplar. Anti-luciferase antikor hMSCs 16 varlığını doğrulamak için donmuş bölümlerinde kullanarak immünhistokimya gerçekleştirmek.
- Bölgesi faiz (ROI) Aracı'nın aracı paleti 16 , 19 ışık şiddeti miktar için kullanın. Yatırım Getirisi çerçeve seçin ve resmin üzerine faiz bölgesine taşıyın. ' I tıklatın " yatırım Getirisini ölçme " ve verileri SEQ dosya biçiminde kaydedin. Verileri bir .txt dosyası olarak verin ve miktar 16 için temel istatistik testleri gerçekleştirmek için istatistiksel yazılım kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 hMSCs kök hücre özelliklerini koruyarak üçlü muhabir ile yüksek verimlilikle transduced olduğunu gösterir. Transduced hMSCs (şekil 1 c, şekil 3) BLI tarafından gerçek zamanlı olarak görüntülenmeyecektir. Bu roman, SAMP fare sol ventrikül içine hMSCs ultrason destekli enjeksiyon enjeksiyon, minimal morbidite ve mortalite (Şekil 2) ile fare hızlı kurtarma için izin çok yüksek başarı oranı sağlar. Bir fare hMSCs ile enjekte için ortalama süre yaklaşık 10 dk ve 8-%9 morbidite ve mortalite daha az bu tekniği ile gözlendi. Ölüm için önemli fark kontur ve kardiyak tamponad Hemorajik Perikardiyal efüzyon gelen nedenidir. HMSC İntrakardiyak (damar içi) yönetim onaylar sonra ex vivo 24 h bu rotanın yönetim sonuçları iltihaplı ince bağırsak iltihabı-Alerjik aksine SAMP farelerin için hMSCs posta içinde çözümlemenin fareler (şekil 3 c ve D) kontrol eder. Ayrıca, hMSCs AKR fareler inflamasyon-Alerjik bağırsakta kalmak ve biriken veya (3B rakam) akciğerlerde kapana başlatmak eğilimindedir.
Resim 1 . hMSCs Transduced yüksek verimlilik ile In Vivo görselleştirme ve kök hücre özellikleri saklama ile için. (A) transduced hMSCs mikroskopik görüntüsü. MRFP ifade tarafından belirtildiği gibi insan MSCs başarılı iletim Akış Sitometresi ile (B) ve Saçınıza (C)değerlendirildi. Transduced hMSCs kök hücre özellikleri, soran kişi tarafından kondrosit, adipositler ve dokusunu ayırt etmek için transduced hMSCs yeteneğini göstermek farklılaşma deneyleri gibi korurlar. Fonksiyonel bir tahlil için hidroksiapatit/TRİKALSİYUM fosfat matris seramik küpler subkutan Ektopik donör kemik (D)oluşturmak için hMSCs yeteneklerini göstermek için immün CB17-Prkdc SCID farelerde implante edildi. A ölçek çubukları = 500 µm. ölçek c Çubuklarõn BLI birimlerinin (103 fotonlar/s/cm2/steradian). Ölçek çubukları D 200 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Aletler ultrason destekli enjeksiyon için. (A) panoramik aletleri: kardiyak ultrason görüntüleme sistemi (kırmızı kare), dönüştürücü, münasip tutucu, şırınga tutucu ve cerrahi anestezi (yeşil kare) ve inhalasyon anestezi makine için nosecone tabloyla monte indüksiyon Odası (sarı kare) ile. Şırınga iğne (B) Ultrasonografik görüntüsü: iğne ucu (kırmızı ok) sol ventrikül (sarı ok) içinde açıkça görülmeye başlıyor. (C) taze arteryel kan çıkış içine şırınga hMSC yönetim önce sol ventrikül içine şırınga iğne ekleme başarılı onaylar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . hMSCs Intracardiac/Intra-net-arterial yönetim SAMP farelerde sonra ince bağırsak Localize. 3-4 fareler/grup temsilcisi görüntülerini, ötenazi 24 saat sonra enjeksiyon ve üç bağımsız deneyler üzerinden gösterilir. Vivo bioluminescence görüntüleme enjeksiyon (A)sonra hMSCs farelerde SAMP ve AKR 24 h varlığını gösterir. Ex vivo analiz SAMP farelerde gösterir hMSCs tercihen küçük bağırsak için (Yani, iltihap sitenin) yerelleştirmek (D), Oysa onlar iltihap ücretsiz kontrol AKR bağırsakta değil kalmak eğilimindedir Fareler (C). Aslında, ilk Arteryel geçiş sonra daha AKR fare, SAMP fareler (B)karşı akciğerlerde biriken hMSCs başlayın. HMSCs bir kısmını da dalak, karaciğer ve akciğer farelerin SAMP ve AKR (B, C, D) tespit edilebilir. Ölçek Çubuklarõn BLI birimlerinin (103 fotonlar/s/cm2/steradian). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada ultrason destekli İntrakardiyak enjeksiyon hMSCs deneysel CD, küçük bağırsak fare modeli için yeni bir teknik anlatılmaktadır. İğne yörünge fare sol ventrikül ultrason tarafından sağlanan, gerçek zamanlı, yüksek çözünürlüklü görüntüleri dayalı ayarlanabilir gibi bu teknik başarı, ve hayatta kalma çok yüksek oranına sahiptir. Sol ventrikül teslim hMSCs sonra intra arterially dağıtılır ve böylece hücre akciğerlerde toplama kaçınarak Venöz dolaşım bypass avantajdır. Daha önce Karotid arter Kateterizasyonu intra Arteryel teslimat için MSCs16,21enjekte etmek için kullanıldı. Karotid Kateterizasyon yöntemi Karotid arter arter içinde bir kateter yerleştirebilmeniz için ortaya çıkarmak için ameliyat içerir. Katater aort hücre nakli için doğru ileri düzeydedir. Kateter daha sonra kaldırıldı ve Karotid arter bakmaksızın. Bu roman tekniği için MSCs ile karşılaştırıldığında Karotid arter Kateterizasyonu, sol ventrikül içinde ultrason destekli enjeksiyon daha az invaziv, çok daha hızlı (yaklaşık 10 dk/fare 60 dk/fare karşı) ve daha az morbidite ve mortalite (< % 10 ve % 30). Fare ultrason destekli İntrakardiyak enjeksiyon hMSCs insan klinik deneyler için klinik tercümesi superior Mezenterik arter Kateterizasyonu ile olurdu (şu anda kronik Mezenterik iskemi tedavisi için yapılan ve zorlu gastrointestinal kanama) hMSCs hastalıklı küçük bağırsak için teslim etmek.
Fare sol ventrikül hMSCs ultrason destekli İntrakardiyak enjeksiyon sorun giderme ve değişiklikler ile ilgili çeşitli konuları vardır. Önemli bir özelliği yordamı, sol ventrikül enjeksiyon iğne gösterecek ultrason kullanımı mastering. Herhangi bir yordam, uygun eğitim, uygulama ve uzman geribildirim gibi başarılı bir şekilde bu yordamı gerçekleştirmek için önemli bileşenleridir. Zavallı tekniği Hemorajik Perikardiyal efüzyon gelen kardiyak tamponad ve ölüme yol açabilir. Hücre topaklanma ve beyin (Yani, kontur) için embolizasyon riski en aza indirmek için önce her iğne hMSCs resuspend esastır. Bu yordamı uygulamadan önce uzman tavsiyesi almak için yerel hayvan araştırma tesisi sorumlu veteriner danışın önemlidir. Hayvanlar güvenli ve etkili kullanımı için kurallar yanlışlıkla yaralanma fareler için en aza indirmek için takip sağlamak.
Farelerde enjeksiyon sonra hMSCs biodistribution incelemek için hMSCs başarılı bir şekilde yüksek verimlilik ile üçlü muhabir ile transduced. Gerçekleştirilen farklılaşma deneyleri kondrosit, adipositler ve osteocytes18ayırt etmek için transduced hMSCs yeteneğini gösterdi. Osteojenik fonksiyonel tahlil için hidroksiapatit/TRİKALSİYUM fosfat matris seramik küpler subkutan immün SCID farelerde implante edildi ve Ektopik donör kemik17,18 oluşturmak için hMSCs yeteneğini gösterdi . Bu farklılaşma ve fonksiyonel deneyleri transduced hMSCs kök hücre özelliklerini muhafaza göstermektedir. Bu çalışmanın sonuçları transduced hMSCs SAMP fareler içine İntrakardiyak enjeksiyon için kullanılan iltihap SAMP farelerde sitedir bağırsağın yerelleştirmek göster. Farelerde bağırsak iltihabı-Alerjik AKR, enjeksiyon, iltihap, yokluğunda ima sonra bağırsak 24 h lokalize hMSCs sadece bir azınlık hMSCs bağırsaklarda kalmaz. Bu veri göç ve yaralanma, akut miyokard infarktüsünde22 kalbinde ve radyasyon yaralı bacak16yaralı BM gibi yerinde engraft için MSCs yetenek göstermiştir birden fazla çalışmaları ile uyum mevcuttur. Gibi diğer hastalıklarda MSCs yerel uygulama kolon yaralanma modelleri için iltihap23ameliorating adlı etkinlik göstermiştir. Kolit23 şifa ve ark. BM kaynaklı MSCs sıçan kolon submukoza enjekte Hayashi TNBS için maruz ve gösterdi alanı çevreleyen bir 2,4,6-trinitrobonzene sülfonik asit (TNBS) model kolit Sıçanlarda, hızlandırılmış .
Manieri ve ark. tarafından yeni bir çalışma distal kolon, kolon yaralanma, prostaglandin eksikliği farelerde sitenin endoskop yardımlı enjeksiyon kolon MSCs roman tekniği kullanılan ve onların etkinliğini oluşumunu önlemede gösterdi delici ülser5. SAMP küçük bağırsak iltihabı bir modeldir ve bu fareler onların kolon spontan iltihap geliştirmek mi. Laboratuarımızda geliştirildi ve bir endoskopik yöntem değerlendirme ve miktar kolon iltihabı ve farelerde tümör gelişimi için doğrulanmış. Ancak, endoskopik cihazların bağırsakta canlı fare24ulaşmak mümkün değildir. Skor sistemi iltihabı SAMP farelerde değerlendirme sonra ötenazi için terminal yöntemi olarak yalnızca kullanılabilir. Bu nedenle, endoskopik yöntem MSCs yerel uygulama SAMP modeli için uygun değildir. Enjeksiyon roman bu tekniği kullanarak, Gelişmiş MSCs yerelleştirme ince bağırsak için elde edilebilir. İltihaplı ince bağırsak için artan yerelleştirme artan etkinliği tercüme edecek olup olmadığını bilinmiyor ve gelecekteki çalışmaların odak noktası olacaktır. SAMP modeli yanı sıra MSCs ultrason destekli enjeksiyon hMSCs TNFΔRE6 fare modeli deneysel CD gibi küçük bağırsak iltihabı diğer modellerinde gelişmiş lokalizasyonu için yararlı bir yöntem olacaktır.
Saçınıza bir duyarlı olduğunu ve seri olarak hMSCs vivo içindeama izlemek için kullanılan uygun tekniği hMSC posta kesin miktar için izin vermez. Üçlü gazeteci transduced hMSCs farelerde kullanmanın bir yararı enzim ttk üçlü muhabir olarak daha fazla nicel Pozitron emisyon19görüntüleme tomografi için (PET) izin vermektedir. Son derece nicel evde beslenen hayvan görüntüleme (radiotracer sonda ile) ile bir bilgisayarlı tomografi (CT) tarama (localization koşuluyla) birleştirme sağlar hastalıklı sitesinde engrafted hMSCs sayısının kantitatif bir tahmin için gama sayıları ile orantılı olarak ttk gen ile etiketli uygun hMSCs sayısı. HMSC yerelleştirme tam miktar homing hMSCs ve terapötik etkinlik yüzdesini belirlemek için yardımcı olabilir ve gelecekteki çalışmaların odak noktası olacaktır.
Rağmen birçok avantajları, bu teknik bazı sınırlamalara sahiptir: i) görüntüleme sistemi fareler, II) mortalite ve morbidite İntrakardiyak enjeksiyon ve III) var olmak kullanılmış için yetersizlik ile ilgili için pahalı kardiyak ultrason gereksinimini yavaş infüzyon (Yani,m > saat) hücreleri ve diğer moleküller. Bu sınırlamaları rağmen Karotid arter Kateterizasyonu yukarıdaki hMSCs, vurgulanmış olarak intra Arteryel enjeksiyon için geçerli tekniği üzerinde birçok faydası vardır.
Sonuç olarak, bu çalışmanın sonuçları rahatlığı inflamasyon deneysel CD, SAMP modeli siteye hMSCs lokalizasyonu geliştirmek için ultrason destekli enjeksiyon tekniği ve etkinliğini göstermektedir. Gelecekteki çalışmalar hMSCs içi Arteryel teslim tarafından artan posta küçük bağırsak iltihabı modellerinin artan terapötik etkinlik yol açabilir Eğer belirleyecek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Maneesh Dave savunma grant PR141774 ve Crohn ve kolit Vakfı Amerika kariyer geliştirme Ödülü tarafından desteklenir. Fabio Cominelli laboratuvar NIH tarafından desteklenen DK042191 (FC), DK055812 (FC), DK091222 (FC) ve DK07948 (FC) verir. Arnold Caplan laboratuvar kısmen L. David ve E. Virginia Baldwin Vakfı tarafından desteklenmektedir. Finansmanı kuruluşları çalışma çözümleme veya yazma makalenin herhangi bir rolü yoktu. İçeriği sadece yazarların sorumluluğunda.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-LG | Gibco | 31600-091 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25-200-072 | |
| Proteamine Sulfate | Sigma Aldrich | P4020-1G | |
| D-Luciferin | Goldbio | luck-500 | |
| Fetal Bobine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| 175 cm tissue cutlure flasks | Corning | 431080 | |
| 75 cm tissue cutlure flasks | Corning | 430720 | |
| Centrifuge tubes | Crysalgen | 23-2265 | |
| Tissue-Plus O.C.T. compound | Fisher HealthCare | 4585 | |
| Cryomold Standard | Tissue-Tek | 4557 | |
| Lenti-Pac HIV Expression Packaging System | GeneCopoeia | HPK-LvTR-20 | |
| Povidone Ionidine swabs | Medline | MDS093901 | |
| Hair removal cream | Nair | N/A | |
| Isoflurane | Piramal Helathcare | NDC 66794 013 25 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Aquasonic 100 ultrasound transmission gel | Parker laboratories | 01 08 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SAMP mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| AKR mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| Vevo 770 imaging system | Visual Sonics, Toronto, Canada | ||
| IVIS spectrum series system | PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Living image software | CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Triple reporter | Kindly provided by Dr. Zheng- Hong Lee, CWRU, (citation 19) |
References
- Duijvestein, M., et al. Pretreatment with interferon-gamma enhances the therapeutic activity of mesenchymal stromal cells in animal models of colitis. Stem Cells. 29 (10), 1549-1558 (2011).
- Sala, E., et al. Mesenchymal Stem Cells Reduce Colitis in Mice via Release of TSG6, Independently of Their Localization to the Intestine. Gastroenterology. 149 (1), 163-176 (2015).
- Gonzalez, M. A., Gonzalez-Rey, E., Rico, L., Buscher, D., Delgado, M. Adipose-derived mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis by inhibiting inflammatory and autoimmune responses. Gastroenterology. 136 (3), 978-989 (2009).
- Dave, M., et al. Stem cells for murine interstitial cells of cajal suppress cellular immunity and colitis via prostaglandin e2 secretion. Gastroenterology. 148 (5), 978-990 (2015).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. J. Clin. Invest. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Kontoyiannis, D., Pasparakis, M., Pizarro, T. T., Cominelli, F., Kollias, G. Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies. Immunity. 10 (3), 387-398 (1999).
- Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. N. Engl. J. Med. 361 (21), 2066-2078 (2009).
- Dave, M., Papadakis, K. A., Faubion, W. A. Immunology of inflammatory bowel disease and molecular targets for biologics. Gastroenterol. Clin. North Am. 43 (3), 405-424 (2014).
- Dave, M., et al. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Inflammatory Bowel Disease: A Systematic Review and Meta-analysis. Inflamm. Bowel Dis. 21 (11), 2696-2707 (2015).
- Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), (2016).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Gao, J., Dennis, J. E., Muzic, R. F., Lundberg, M., Caplan, A. I. The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion. Cells Tissues Organs. 169 (1), 12-20 (2001).
- English, K. Mechanisms of mesenchymal stromal cell immunomodulation. Immunol Cell Biol. 91 (1), 19-26 (2013).
- Pizarro, T. T., et al. SAMP1/YitFc mouse strain: a spontaneous model of Crohn's disease-like ileitis. Inflamm. Bowel Dis. 17 (12), 2566-2584 (2011).
- Lennon, D. P., Caplan, A. I. Isolation of human marrow-derived mesenchymal stem cells. Exp. Hematol. 34 (11), 1604-1605 (2006).
- Lin, P., et al. Serial transplantation and long-term engraftment of intra-arterially delivered clonally derived mesenchymal stem cells to injured bone marrow. Mol. Ther. 22 (1), 160-168 (2014).
- Dennis, J. E., Caplan, A. I. Porous ceramic vehicles for rat-marrow-derived (Rattus norvegicus) osteogenic cell delivery: effects of pre-treatment with fibronectin or laminin. J. Oral Implantol. 19 (2), 106-115 (1993).
- Lin, P., et al. Efficient lentiviral transduction of human mesenchymal stem cells that preserves proliferation and differentiation capabilities. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 886-897 (2012).
- Love, Z., et al. Imaging of mesenchymal stem cell transplant by bioluminescence and PET. PET. J. Nucl. Med. 48 (12), 2011-2020 (2007).
- Haynesworth, S. E., Goshima, J., Goldberg, V. M., Caplan, A. I. Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow. Bone. 13 (1), 81-88 (1992).
- Ishizaka, S., et al. Intra-arterial cell transplantation provides timing-dependent cell distribution and functional recovery after stroke. Stroke. 44 (3), 720-726 (2013).
- Schenk, S., et al. Monocyte chemotactic protein-3 is a myocardial mesenchymal stem cell homing factor. Stem Cells. 25 (1), 245-251 (2007).
- Hayashi, Y., et al. Topical implantation of mesenchymal stem cells has beneficial effects on healing of experimental colitis in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326 (2), 523-531 (2008).
- Kodani, T., et al. Flexible colonoscopy in mice to evaluate the severity of colitis and colorectal tumors using a validated endoscopic scoring system. J. Vis. Exp. (80), e50843 (2013).
