Summary
Murino estudos em modelos de inflamação do cólon têm demonstrado que uma pequena porcentagem (1-5%) de células-tronco mesenquimais (MSC) injetada por via intravenosa ou intraperitonealmente home ao cólon inflamado1,2. Este estudo mostra que guiada por ultra-som intracardíacos injeções de MSCs resultam em aumentada localização até o intestino.
Abstract
A doença de Crohn (CD) é uma doença inflamatória crônica comum do pequeno e o intestino. Murino e humanas tronco células mesenquimais (MSCs) têm potencial imunossupressor e foram mostradas para suprimir a inflamação em modelos do rato de inflamação intestinal, mesmo que a via de administração pode limitar sua homing e eficácia 1 , 3 , 4 , 5. aplicação local de MSCs para modelos de lesão do cólon tem demonstrado maior eficácia em atenuar a inflamação no cólon. No entanto, há escassez de dados sobre técnicas para melhorar a localização do MSCs de derivados da medula óssea humanas (hMSCs) para o intestino delgado, o local da inflamação no modelo da doença de Crohn experimental SAMP-1/YitFc (SAMP). Este trabalho descreve uma técnica nova para a injeção intracardíaca guiada por ultra-som de hMSCs em camundongos SAMP, um modelo bem caracterizado espontâneo de inflamação intestinal crônica. Sexo e idade-correspondência, livre de inflamação AKR/J (AKR) os ratos foram usados como controles. Para analisar a biodistribuição e a localização, hMSCs foram transfectadas com um lentivirus contendo um repórter triplo. O repórter triplo consistia de luciferase de vaga-lume (fl), para a imagem latente bioluminescente; proteína monomérica vermelha fluorescente (mrfp), para a classificação de célula; e truncado herpes simplex vírus timidina quinase (ttk), para tratamento de imagens de tomografia por emissão de pósitrons (PET). Os resultados deste estudo mostram que 24 h após a administração intracardíaca, hMSCs localizar-se no intestino delgado de ratos SAMP ao invés de ratos AKR livre de inflamação. Neste romance, guiada por ultra-som de injeção de hMSCs no ventrículo esquerdo de ratos SAMP garante uma elevada taxa de sucesso de entrega de celular, permitindo a recuperação rápida de ratos com mínima morbidade e mortalidade. Esta técnica pode ser um método útil para a localização avançada do MSCs em outros modelos de inflamação intestinal-pequeno, como TNFΔRE6. Estudos futuros determinará se a localização de aumentada do hMSCs pela entrega intra-arterial pode levar à maior eficácia terapêutica.
Introduction
A doença de Crohn (CD) é uma doença inflamatória crônica comum do pequeno e intestino e é pensada para resultar de uma resposta inadequada do sistema imunológico do host para micróbios intestinais7,8. Estudos recentes têm mostrado que murino e humanas tronco células mesenquimais (MSCs) podem suprimir a inflamação em modelos do rato de inflamação intestinal1,3,4,5. Existem vários ensaios clínicos em curso que usam MSCs humanas derivadas da medula óssea ou tecido adiposo para tratar pacientes com doença inflamatória intestinal (IBD), que inclui CD9. Duas rotas para a terapia MSC têm sido utilizadas nestes ensaios clínicos: uma envolve a infusão sistêmica (ou seja, por via intravenosa) de MSCs para IBD luminal (incluindo CD) e o outro envolve a aplicação/injeção localizada de células-tronco na fístula trato de pacientes com CD perianal. Em uma recente meta-análise da terapia MSC para IBD, sistêmica (ou seja, por via venosa) terapia MSC para IBD luminal (incluindo CD) foi eficaz em até 40% (95% CI: 7-79%) dos pacientes, Considerando que a eficácia era muito maior, em 61% (95% CI: 36-85%), quando os MSCs foram injetados localmente os doentes de fístula CD9. Um multicêntrico III fase recente randomizado placebo controlado de células-tronco adiposas alogênico injetado diretamente a fístula perianal de CD pacientes mostrou estatisticamente significativa evidência clínica e radiológica de fístula perianal, cura, corroborando os achados da meta-análise10. As razões para a baixa eficácia da terapia MSC administrada por via intravenosa para CD luminal foi investigado inadequadamente, mas uma razão pode ser a orientação inadequada do MSCs para o local da inflamação. Murino estudos em modelos de inflamação do cólon têm demonstrado que apenas uma pequena percentagem de MSCs (1-5%) injetada por via intravenosa alcançar o cólon inflamado; os MSCs restantes são filtrados pelos pulmões (efeito de primeira passagem)1,2 ,5,11,12. Vários estudos murino, portanto, tem usado a via intraperitoneal (i.p.) para administração de MSC em modelos animais de colite4. No entanto, eles também têm demonstrado que somente uma pequena fração das células alcançar e engraft do cólon e que a eficácia é relacionado com a secreção de fatores solúveis parácrina, como a proteína do gene fator de necrose tumoral-inducible 6 (TSG-6)2. O mecanismo MSC de imunossupressão e cura envolve uma abordagem de várias frentes que envolve parácrina; fatores de proximidade-independente de célula, como TSG-6; e celular fatores dependentes de proximidade, como programado morte-ligante 1 (PD-L1); ou 1 irregulares. Portanto, localização de MSC para o site da inflamação pode resultar em maior eficácia9,13. De fato, um estudo recente mostrou que MSCs implantados diretamente no local da lesão do cólon resultaram na cura através da secreção de promover a angiogênese vascular fator de crescimento endotelial (VEGF). Por outro lado, observou-se um efeito de cura mínimo após injeção intravenosa5. Para aumentar a sua localização para o site da inflamação (ou seja, o intestino delgado em ratos SAMP), foi desenvolvida esta técnica de Injeção intracardíaca guiada por ultra-som para administração de MSC no ventrículo esquerdo. Guiada por imagem injeção garante uma injeção exata, o que leva a uma maior taxa de sucesso e a diminuição da morbidade e mortalidade. Além disso, a injeção de MSCs no ventrículo esquerdo distribui-las para circulação arterial, onde eles podem alcançar o intestino inflamado antes de tornar-se preso nos pulmões.
Neste estudo, MSCs derivadas da medula óssea humanas (hMSCs) foram usados para injeção no modelo murino de CD14SAMP-1/YitFc (SAMP). Totem é um modelo murino espontâneo bem caracterizado de inflamação crônica que se desenvolve a inflamação intestinal-pequeno com cerca de 100% de penetrância14. A inflamação se desenvolve em resposta a microflora na ausência de qualquer manipulação genética, química ou imunológica e muito semelhante à humana CD11. Sexo e idade-correspondente livre de inflamação AKR/J (AKR) ratos, os ratos de controlo parental da SAMP, foram utilizados neste estudo.
Os hMSCs foram isoladas e expandidas em laboratório de amostras de medula óssea (BM) obtidos de doadores normais, não identificados, após consentimento informado usando validado e publicado anteriormente protocolos15,16. Após isolamento e expansão, a capacidade MSC em osteogênica, adipogenic, e chondrogenic diferenciação foi avaliada em laboratório por vários ensaios15. Realizou-se o ensaio funcional osteogênico implantando cubos de cerâmicos da matriz de fosfato tricálcico/hidroxiapatita contendo hMSCs por via subcutânea em imunocomprometidos de ratos SCID CB17-Prkdc17. O ensaio de cubo demonstra a osteogênese e condrogênese potencial e é considerado o último teste de avaliação individual de preparações de MSC17. Para visualizar hMSCs na vivo após a injeção, lentivirus foi usado para transduce hMSCs com construção de gene repórter triplo que consiste de luciferase de vaga-lume (fl), proteína monomérica fluorescente vermelha (mRFP) e herpes simplex vírus timidina quinase (ttk ), impulsionado por um vírus (mnd) de sarcoma mieloproliferativa modificados promotor18. A luciferase de vaga-lume no repórter triplo é uma enzima que luciferina injetado coverts para oxyluciferin em hMSCs e produz fótons/luz branca. Isso é detectado pela câmera sensível dispositivo de carga acoplada (CCD) (bioluminescência) em um na vivo óptico de imagem de sistema, que permite a visualização de hMSCs ao vivo em ratos. Bioluminescência imaging (BLI) é uma técnica sensível que pode ser usada em série para controlar as células e para análise ex vivo . O uso de um promotor forte mnd conduz a expressão contínua da construção de gene de fusão tripla repórter e permite a imagem latente de hMSCs injetado por mais de 16 semanas19. Os hMSCs são difíceis de transduce e ter um rendimento baixo transdução. Usando um protocolo otimizado, a eficiência de transdução de hMSCs foi melhorada e a expressão do transgene foi reforçada18. Usando a expressão de mRFP (um dos genes repórter triplo) na citometria de fluxo, demonstrou-se a capacidade de transduce hMSCs com uma alta eficiência de até 83%. Ensaios de diferenciação e na vivo o cubo ensaios demonstraram a capacidade do transduzidas hMSCs de se diferenciar em adipócitos, condrócitos e osteócitos17.
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Protocol
todos os procedimentos no estudo e experimentos de ratos foram aprovados pela Case Western Reserve University ' s institucionais Cuidado Animal e Comissão de utilização. Os procedimentos foram realizados em associação para avaliação e acreditação dos cuidados com animais de laboratório (AAALAC) credenciado facilidade. O BM foi aspirado sob um protocolo aprovado Conselho de revisão institucional hospitais Universidade na instalação de núcleo de células-tronco na Case Western Reserve University, após consentimento informado.
1. cultura e derivado de transdução da medula óssea humana células-tronco mesenquimais (hMSCs)
Nota: O isolamento de hMSCs é descrito detalhadamente em anteriores Publicações 15 , 20.
- Cultura isolada hMSCs em Dulbecco ' suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) glicose (DMEM-LG) s Eagle modificado médio-baixo. Cultura de células em 37 ° C, umidade de 95% e 5% de CO 2 em T175 frascos com 25 mL de meio de crescimento. Substitua o médio a cada 3-4 dias. No dia 14, execute a passagem principal do hMSCs.
- Quando as células alcançar 80% de confluência, remover completamente o meio velho e lave delicadamente as células com 5 mL de tampão fosfato salina (PBS; para frascos de cultura de tecidos de 75 cm).
- Remover a PBS do recipiente e adicionar 4 mL de ácido de 0,25% do trypsin-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Lugar o frasco de volta na incubadora a 37 ° C durante 5-10 min. manter o tempo de exposição mais breve possível.
- Quando a maioria das células se tornaram bem-arredondado ou ter retirado o prato de cultura, pare a reação adicionando um volume de soro bovino bezerro igual a metade do volume de tripsina.
- Transferir a suspensão de células para um tubo de centrífuga de tamanho adequado. Centrifugar as células a 400 x g por 5 min e em seguida, Retire cuidadosamente o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 5 mL de meio (DMEM-LG + 10% FBS) e contar as células com um hemocytometer.
Nota: Neste momento, as células podem ser repicagem ou transfectadas com triplo repórter.
- Executar a transdução de hMSCs com repórter triplo.
- Células semente 1.5 x 10 6 um T175 balão. Cultura de células em 25 mL de meio de crescimento em 37 ° C, 95%, umidade e 5% de CO 2. Esperar 24 h para as células anexar.
- Fazer um vírus cocktail em tubos de 15 mL, conforme descrito na referência 18.
- Lentivirus de degelo a 37 ° C em uma água de banho. Adicione 160 µ l de uma solução de sulfato de proteamine 5 mg/mL em Dulbecco ' s Modified Eagle Medium (DMEM) a 8 mL de meio de cultura (DMEM-LG + 10% FBS) para uma concentração final de 100 µ g/mL. Vórtice de 3 s. Adicione uma multiplicidade de vírus de infecção (MOI) de 5 (1º vez descongelado) .
- Remover o meio do frasco de cultura celular (passo 1.2.1) e adicionar o coquetel de vírus para as células. Incubar durante 10 h a 37 ° C, umidade de 95% e 5% de CO 2.
- Adicionar 4 mL de sulfato de proteamine 100 µ g/mL em 4 mL de DMEM-LG + 10% FBS e incube por um adicional h. 14
- Parar a transdução após 24 h, substituindo com 25 mL de meio (DMEM-LG + 10% FBS).
- Eficiência de transdução confirmar através da avaliação da expressão de mRFP por citometria de fluxo 18.
Nota: Aqui, hMSCs que foram transfectadas com mais de 65%, utilizaram-se eficiência. - Expandir as células, substituindo com 25 mL de meio fresco (DMEM-LG + 10% FBS) duas vezes por semana. Cultura de células em 37 ° C, 95%, umidade e 5% de CO 2. Passagem de células após atingirem 80% confluência.
- Uma vez que o número de células desejado for atingido, executar tripsinização por etapas 1.1.2 - 1.1.4.
- Contar as células e suspendê-las em PBS estéril (1x) na concentração final de 1 x 10 6 células/75 µ l. manter as células no gelo para o transporte para a máquina de ultra-som. Para experiências, usar hMSCs de passagem os números 2-5.
2. Guiada por ultra-som intracardíaco injeção de hMSCs para o ventrículo esquerdo
Nota: uso SAMP1/YitFc com estabelecido pequeno-intestinal inflamação e idade e gênero-correspondência AKR/J ratos para as experiências. Manter os ratos SAMP e AKR condições específicas isentos de organismos patogénicos, alimentá-los chow padrão de laboratório e mantê-los em ciclos de 12 h claro/escuro. Aqui, as injeções cardíacas guiada por ultra-som foram realizadas em uma sala de ultrassom isentos de organismos patogénicos cardíaco dedicado localizada na unidade de pesquisa animal da CWRU que foi desinfectada com um desinfectante e lavada com álcool a 70%. Laboratório pesquisa pessoal deve usar equipamento de protecção pessoal, incluindo vestidos, máscaras com escudos de olho e luvas estéreis durante as injeções intracardíacos. O calor do corpo do mouse deve ser mantido para a duração do processo.
- Configurar o ultra-som sistema de imagem antes de anestesiar o mouse. Para este protocolo, use a máquina de ultra-som projetada para ecocardiograma de rato.
- Girar sobre o poder e inicializar o transdutor (30 MHz) para configurar o novo estudo.
- Anestesiar o mouse em uma câmara de indução usando 3-4% de isoflurano em oxigênio a 100% a uma taxa de 0,2 - 0,5 L/min manter o animal para todo o processo com 2% de isoflurano em 100% de oxigênio através de um cone de nariz. Confirmar anesthetization apropriado antes de executar a imagem latente por beliscar o dedo do pé, rolando o mouse e observar a ausência de movimento.
Nota: Pomada oftálmica deve ser aplicada aos olhos após a indução da anestesia para evitar a secura da córnea. Transferi os ratos anestesiados para as máquinas de imagem (ou seja, o sistema de imageamento bioluminescência e ultra-som), onde receberão uma dose de manutenção de isoflurano anestésico. Determinar a anestesia começar a altura e a profundidade da anestesia, observando a falta de reação à pitadas na cauda e pé almofada a cada 10 min para toda a duração da anestesia. - Definir a temperatura do gel tabela e ultra-som de imagem a 37 ° C.
- Remover completamente a pele sobre a área do tórax do mouse anestesiado usando o creme depilatório.
- Coloque o mouse em cima da mesa da imagem latente em posição supina e fixar ambos os membros superiores e inferiores com fita adesiva para evitar o movimento do corpo durante o procedimento. Usar um monitor de eletrocardiograma durante o procedimento para todos os mouses.
- Limpar a pele da área do tórax, usando um cotonete de iodopovidona/10% seguido de um cotonete de etanol 70%. Aplicar uma camada espessa de gel para a área do tórax do mouse.
- Montar o transdutor no suporte e ajustar sua posição até o ventrículo esquerdo é claramente visível no campo de visão.
- Carga 150 µ l de suspensão de células hMSC transduzidas (2 x 10 6 hMSCs em 150 µ l de PBS estéril) em uma seringa de 1 mL com uma 28-G agulha e fixar a seringa no suporte apropriado. Para visualizar o sangue pulsante, manter uma coluna de ar pequena na seringa. Para evitar a aglutinação, suspender as células antes da injeção.
- Avançar a seringa no sentido do tórax do mouse, ajustar a trajetória da agulha usando a orientação de ultra-som e introduza o ventrículo esquerdo.
- Seguindo a orientação da imagem do ultra-som, penetrar a agulha da seringa através do espaço intercostal e no ventrículo esquerdo do mouse.
Nota: Ponta de agulha da seringa deve ser claramente visível no ventrículo esquerdo na imagem ultra-sonográficos. O posicionamento adequado deve ser confirmado ainda mais pela saída de sangue arterial fresco para a seringa. Estes são sinais de uma bem sucedida inserção. - Injetar a suspensão de células de hMSC muito lentamente mais de 2 min, aplicando suave pressure.
- Após a injeção de células suspensas, delicadamente, retirar a agulha, limpe o gel de ultra-som e solte o mouse das restrições fita.
- Colocar o animal em uma gaiola nova e limpa com uma almofada pré-aquecido.
Nota: Após a conclusão do procedimento, um ambiente quente deve ser fornecido aos ratos até se recuperar. Aquecimento excessivo deve ser evitado, desde que a vasodilatação periférica compromete a recuperação. Os ratos devem ser acompanhados de perto e isolados de outros ratos até sua recuperação total, indicada pela sua capacidade de manter a prostração esternal. - Monitorar o animal até que eles alcancem a completa recuperação da anestesia e diariamente até o final do experimento.
3. Imagens de bioluminescência (BLI) de hMSCs
- imagem os ratos 24 h após a injeção intracardíaca no sistema de imagem a bioluminescência. Inicie o na vivo software de imagem. Inicializar o sistema de imagem e abrir um novo estudo.
- No painel de controle, defina os parâmetros de imagem clicando " sequência instalação. " no modo de imagem, selecione " luminescência " e " fotografia. " definir os tempos de exposição de 0,5 s a 10 min. definir o binning para " médio " e a F / Para de " 1. " definir o filtro de excitação " bloco " e o filtro de emissão para " aberto. " definir o campo de visão " C " para dois ratos. Adicionar a configuração de sequência para o assistente de imagem clicando no painel de controle de aquisição.
- Ligue a bomba de oxigênio e o conjunto do isoflurano para 2,5% em câmara de indução e o cone de nariz dentro da máquina.
- Injetar o i.p. de rato com 300 µ l de D-luciferina (12,5 mg/mL).
- Colocar o mouse na câmara de indução de anestesia.
- Após 2-3 min, transferir o mouse para o na vivo de imagens de câmara, com a cabeça do cone de nariz no colector de anestesia. Aplica a pomada óptica para proteger os olhos durante a imagem latente. Para vários mouses de imagem, use o defletor de luz negra para evitar a reflexão da luz em ratos adjacentes.
- Clique o " adquirir " o botão para iniciar a aquisição de imagem 10 min após a injeção de luciferina-D.
- Repita os passos 3.3-3.5 para imagem mais ratos.
- Após a aquisição imagem na vivo, eutanásia os ratos por inalação de CO 2 seguida por deslocamento cervical, para confirmar a morte. Efectuar a análise ex vivo.
- Se a análise ex vivo é executada Depois de 20 min, repetir a injeção de luciferina (passo 3.3) antes de sacrificar os ratos; o sinal BLI pode diminuir 20 min após a injeção de luciferina.
- Dissecar os ratos para remover o aparelho todo gastrointestinal (i.e., do estômago para o reto), linfonodos mesentéricos (MLN), pulmões, baço e fígado. Colocá-los em placas de Petri usando pinças e tesouras de 2 , 4.
- Coloque a placa de Petri contendo os órgãos explantados na câmara de imagens e adquirir imagens BLI por etapas 3.1-3.6.
- Após a aquisição da imagem, transferir os órgãos explantados para moldes de amostra contendo ideal da temperatura de corte (OCT) composto. Cryofreeze os moldes a-80 ° C, usando gelo seco. Executar a imuno-histoquímica utilizando anticorpo anti-luciferase seções congeladas para confirmar a presença de hMSCs 16.
- Para a quantificação da intensidade de luz, use a região da ferramenta de interesse (ROI) na ferramenta paleta 16 , 19. Selecione o quadro ROI e movê-lo para a região de interesse na imagem. Clique " medição de ROI " e salvar os dados no formato de arquivo SEQ. Exportar os dados como um arquivo. txt e usar software estatístico para realizar testes estatísticos básicos para quantificação 16.
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Representative Results
A Figura 1 mostra que a hMSCs pode ser transfectadas com o repórter triplo com uma alta eficiência, preservando suas propriedades de célula-tronco. Transduzidas hMSCs podem ser visualizadas em tempo real por BLI (Figura 1, Figura 3). Neste romance, guiada por ultra-som injeção de hMSCs para o ventrículo esquerdo de ratos SAMP garante uma taxa de sucesso muito alta de injeção, permitindo a recuperação rápida dos ratos com mínima morbidade e mortalidade (Figura 2). O tempo médio para injetar um rato com hMSCs é aproximadamente 10 min, e menos de 8-9% de morbidade e mortalidade foram observados com esta técnica. A principal razão para a mortalidade é derrame e tamponamento de efusão pericárdica hemorrágica. A análise ex vivo realizado 24 h após a administração intracardíaca (intra-arterial) do hMSC confirma que esta rota dos resultados da administração na orientação de hMSCs para o intestino inflamado de ratos SAMP, em oposição à livre de inflamação controle de ratos (Figura 3 e D). Além disso, hMSCs tendem a não permanecer no intestino delgado de ratos AKR livre de inflamação e começar a acumular-se ou ficar preso nos pulmões (Figura 3B).
Figura 1 . hMSCs pode ser Transduced com uma eficiência elevada para visualização In Vivo e com retenção de células-tronco Propriedades. (A) imagem microscópica de transduzidas hMSCs. Bem sucedida transdução de MSCs humanas, conforme determinado pela expressão mRFP avaliados com citometria de fluxo (B) e BLI (C). HMSCs transduzidas reter Propriedades de célula-tronco, como confirmado por ensaios de diferenciação que demonstram a capacidade de hMSCs transduzidas de se diferenciar em adipócitos, condrócitos e osteoblastos. Para um ensaio funcional, os cubos de cerâmicos da matriz de fosfato tricálcico/hidroxiapatita foram implantados por via subcutânea em imunocomprometidos ratos SCID CB17-Prkdc para demonstrar a capacidade de hMSCs para formar o osso ectópico doador (D). Escala de bares na = 500 µm. barras de escala em C indicam as unidades de BLI (10 /steradian de fótons/s/cm2de3 ). Dimensionamento de barras em D = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Instrumentos para a injeção guiada por ultra-som. (A) vista panorâmica dos instrumentos: ultrassom cardíaco sistema (Praça vermelha), transdutor montado em seu suporte apropriado, titular da seringa e mesa cirúrgica com cone do nariz para a máquina de anestesia anestesia (quadrado verde) e inalação de imagem com câmara de indução (quadrado amarelo). (B) imagem ultra-sonográficos da agulha da seringa: a ponta da agulha (seta vermelha) é claramente visível no interior do ventrículo esquerdo (setas amarelas). (C) saída de sangue arterial fresco para a seringa confirma a inserção bem sucedida da agulha da seringa no ventrículo esquerdo, antes da administração do hMSC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . hMSCs Localize para o intestino delgado após a administração de Intracardiac/Intra-arterial em ratos SAMP. Imagens representativas de ratos/grupo de 3-4, sacrificadas 24 horas após a injeção e de três experimentos independentes são mostrados. Imagens de bioluminescência em vivo demonstra a presença de hMSCs em camundongos SAMP e AKR 24h após a injeção (A). Análise ex vivo em camundongos SAMP demonstra que hMSCs localizar preferencialmente para o intestino delgado (ou seja, o local da inflamação) (D), Considerando que eles tendem a não permanecer no intestino delgado de controle livre de inflamação AKR (C)de ratos. Na verdade, após a primeira passagem arterial, hMSCs começar a acumular-se mais nos pulmões de ratos AKR, ao contrário de ratos SAMP (B). Uma fração de hMSCs também pode ser detectada no baço, fígado e pulmões de ratos SAMP e AKR (B, C, D). As barras de escala indicam as unidades de BLI (10 /steradian de fótons/s/cm2de3 ). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este estudo descreve uma técnica nova para a injeção intracardíaca guiada por ultra-som de hMSCs em um modelo do CD experimental rato pequeno-intestinal. Esta técnica tem muito alta taxa de sobrevivência e de sucesso, como a trajetória da agulha pode ser ajustada com base em imagens de alta resolução, em tempo real do ventrículo esquerdo do mouse, fornecida pelo ultra-som. A vantagem da entrega para o ventrículo esquerdo é que hMSCs são então distribuídos intra arterially e ignorar a circulação venosa, evitando assim a agregação de células nos pulmões. Anteriormente, a cateterização da artéria carótida para entrega intra-arterial foi usada para injetar MSCs16,21. O método de cateterismo da carótida envolve cirurgia para expor a artéria carótida para colocar um cateter dentro da artéria. O cateter é avançado para o arco aórtico para a transfusão de células. O cateter é posteriormente removido e ligados a artéria carótida. Esta nova técnica para a injeção guiada por ultra-som de MSCs no ventrículo esquerdo, em comparação com cateterização da artéria carótida, é menos invasiva, é muito mais rápido (aproximadamente 10 min/mouse contra 60 min/rato) e tem menos morbidade e mortalidade (< 10% contra 30%). A tradução clínica da rato guiada por ultra-som intracardíaco injeção de hMSCs para testes clínicos em humanos seria através da cateterização da artéria mesentérica superior (atualmente executadas para o tratamento da Isquemia mesentérica crônica e hemorragia digestiva intratável) para entregar o intestino doente-hMSCs.
Há várias considerações a respeito de modificações e solução de problemas da injeção intracardíaca guiada por ultra-som de hMSCs no ventrículo esquerdo de ratos. Um aspecto crítico do procedimento é dominar o uso do ultra-som para guiar a agulha de injeção para o ventrículo esquerdo. Como qualquer procedimento, treinamento, prática e gabarito perito são componentes importantes para executar com êxito este procedimento. Técnica pobre pode levar a tamponamento cardíaco de efusão pericárdica hemorrágica e até a morte. Para minimizar a aglutinação de células e o risco de embolização para o cérebro (ou seja, acidente vascular cerebral), é essencial para Ressuspender o hMSCs antes de cada injeção. Antes de implementar este procedimento, é importante consultar o veterinário encarregado nas instalações de pesquisa animal local para receber conselhos de especialistas. Certifique-se de que as orientações para a utilização segura e eficaz de animais são seguidas para minimizar a lesão inadvertida para os ratos.
Para examinar a biodistribuição de hMSCs após a injeção em ratos, hMSCs com êxito foram transfectadas com repórter triplo, com alta eficiência. Ensaios de diferenciação realizados demonstraram a capacidade de hMSCs transduzidas de se diferenciar em adipócitos, condrócitos e osteócitos18. Para o ensaio funcional osteogênico, os cubos de cerâmicos da matriz de fosfato tricálcico/hidroxiapatita foram implantados por via subcutânea em ratos de SCID imunocomprometidos e demonstraram a capacidade de hMSCs para formar o doador ectópica osso17,18 . Estes diferenciação e ensaios funcionais demonstram que hMSCs transduzidas reter suas propriedades de célula-tronco. Os resultados deste estudo mostram que transduzidas hMSCs usados para Injeção intracardíaca em camundongos SAMP localizar para o intestino delgado, que é o local de inflamação em ratos o SAMP. Nos intestinal livre de inflamação AKR ratos, apenas uma minoria de hMSCs localizado para os intestinos 24h após a injeção, o que implica que, na ausência de inflamação, hMSCs não permanecem no intestino. Esses dados estão em concordância com vários outros estudos que têm demonstrado a capacidade de MSCs para migrar e engraft no local da lesão, tais como o coração no infarto agudo do miocárdio22 e o BM ferido em uma perna ferida de radiação16. Como em outras doenças, a aplicação local de MSCs para modelos de lesão do cólon tem demonstrado eficácia em atenuar a inflamação23. Em um modelo de ácido sulfônico (neutrófilos) 2.4.6-trinitrobonzene de colite em ratos, Hayashi et al injetado MSCs BM-derivado da submucosa do cólon rato, cercam a área exposta a neutrófilos e demonstrou acelerou a cicatrização da colite23 .
Um estudo recente por Manieri et al usou uma nova técnica de injeção assistida por endoscópio de Colônica MSCs no cólon distal, o local da lesão do cólon, em camundongos deficientes em prostaglandina e mostrou sua eficácia na prevenção da formação de de úlceras penetrantes5. Totem é um modelo de inflamação intestinal-pequeno, e estes ratos não desenvolvem inflamação espontânea em seu cólon. Nosso laboratório tem desenvolvido e validado um método endoscópico para a avaliação e quantificação da inflamação do cólon e desenvolvimento do tumor em ratos. No entanto, dispositivos endoscópicos não são capazes de atingir o intestino delgado em um rato vivo24. O sistema de Pontuação só pode ser usado como terminal método para a avaliação da inflamação em ratos o SAMP após eutanásia. Portanto, o método endoscópico não é adequado para a aplicação local de MSCs no modelo de SAMP. Usando esta nova técnica de injeção, localização avançada do MSCs para o intestino delgado pode ser alcançada. Se a localização de aumentada para o intestino inflamado se traduzem em maior eficácia não é conhecido e será o foco de estudos futuros. Além do modelo SAMP, a injeção guiada por ultra-som de MSCs seria um método útil para a localização avançada do hMSCs em outros modelos de pequena inflamação intestinal, tais como o modelo murino de6 TNFΔRE de CD experimental.
BLI é um sensível e técnica conveniente que pode ser usada em série para rastrear hMSCs na vivo, mas não permite a quantificação precisa do hMSC homing. Uma vantagem de usar o hMSCs triplo de repórter-transfectadas em ratos é que a enzima ttk no repórter triplo permite mais quantitativa de emissão de positrões (PET) imagem19. Combinar imagens altamente quantitativa de PET (com uma sonda radiotracer) com uma tomografia computadorizada (TC) (fornecendo a localização) permite uma avaliação quantitativa do número de engrafted hMSCs no local da doença, como as contagens de gama são proporcionais a número do hMSCs viável rotulado com o gene ttk. Quantificação exata do hMSC localização pode ajudar a determinar a porcentagem de hMSCs de orientação e de efeito terapêutico e será o foco de estudos futuros.
Esta técnica, apesar de suas muitas vantagens, tem algumas limitações: i) a exigência de um ultrassom cardíaco caro de imagem de sistema para ratos, ii) a mortalidade e morbilidade associadas com Injeção intracardíaca e iii) a incapacidade de ser usado para o infusão lenta (i.e.,m > horas) de células e outras moléculas. Apesar dessas limitações, tem muitas vantagens sobre a atual técnica de cateterização da artéria carótida para a injeção intra-arterial de hMSCs, como destacado acima.
Em conclusão, os resultados deste estudo demonstram a eficácia e a conveniência da técnica para melhorar a localização do hMSCs para o local da inflamação no modelo de CD experimental SAMP injeção guiada por ultra-som. Estudos futuros determinará se o homing aumento da hMSCs pela entrega intra-arterial pode levar à maior eficácia terapêutica em modelos de inflamação intestinal-pequeno.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Maneesh Dave é suportado pelo departamento de defesa grant PR141774 e o Crohn e a colite Foundation of America carreira desenvolvimento Award. O laboratório de Fabio Cominelli é suportado pelo NIH concede DK042191 (FC), DK055812 (FC), DK091222 (F.C.) e DK07948 (FC). O laboratório de Arnold Caplan é suportado em parte pela David L. e E. Virginia Baldwin Foundation. Agências de fomento não tinham qualquer papel no estudo de análise ou escrita do manuscrito. Seu conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-LG | Gibco | 31600-091 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25-200-072 | |
| Proteamine Sulfate | Sigma Aldrich | P4020-1G | |
| D-Luciferin | Goldbio | luck-500 | |
| Fetal Bobine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| 175 cm tissue cutlure flasks | Corning | 431080 | |
| 75 cm tissue cutlure flasks | Corning | 430720 | |
| Centrifuge tubes | Crysalgen | 23-2265 | |
| Tissue-Plus O.C.T. compound | Fisher HealthCare | 4585 | |
| Cryomold Standard | Tissue-Tek | 4557 | |
| Lenti-Pac HIV Expression Packaging System | GeneCopoeia | HPK-LvTR-20 | |
| Povidone Ionidine swabs | Medline | MDS093901 | |
| Hair removal cream | Nair | N/A | |
| Isoflurane | Piramal Helathcare | NDC 66794 013 25 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Aquasonic 100 ultrasound transmission gel | Parker laboratories | 01 08 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SAMP mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| AKR mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| Vevo 770 imaging system | Visual Sonics, Toronto, Canada | ||
| IVIS spectrum series system | PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Living image software | CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Triple reporter | Kindly provided by Dr. Zheng- Hong Lee, CWRU, (citation 19) |
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