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Medicine

अल्ट्रासाउंड निर्देशित Intracardiac इंजेक्शन मानव Mesenchymal स्टेम कोशिकाओं प्रयोगात्मक सूजन आंत्र रोगों के Murine मॉडल में उपयोग के लिए आंत को डाक बढ़ाने के लिए

Published: September 1, 2017 doi: 10.3791/55367
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 5, 4, 2,3, 5, 1
1Division of Gastroenterology and Liver Disease, University Hospitals, Digestive Health Research Institute, Case Western Reserve University, 2Case Cardiovascular Research Institute, School of Medicine, Case Western Reserve University, 3Department of Medicine, Harrington Discovery Institute, Harrington Heart and Vascular Institute, University Hospitals Case Medical Center, 4Department of Radiology, University Hospitals Case Medical Center, 5Department of Biology - Skeletal Research Center, Case Western Reserve University

Summary

बृहदांत्र सूजन के मॉडलों में Murine अध्ययन का प्रदर्शन किया है कि एक छोटा सा प्रतिशत (mesenchymal स्टेम सेल के 1-5%) (एमएससी) नसों में इंजेक्शन या सूजन बृहदांत्र के लिए घरintraperitoneally1, 2 । इस अध्ययन से पता चलता है कि अल्ट्रासाउंड-निर्देशित intracardiac इंजेक्शन MSCs के परिणामस्वरूप आंत को स्थानीयकरण में वृद्धि हुई है ।

Abstract

Crohn की बीमारी (सीडी) छोटी और बड़ी आंत की एक आम पुरानी भड़काऊ बीमारी है । Murine और मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं (MSCs) गुर्दे क्षमता है और आंतों की सूजन के माउस मॉडल में सूजन को दबाने के लिए दिखाया गया है, भले ही प्रशासन के मार्ग उनके डाक और प्रभावशीलता को सीमित कर सकते हैं 1 , 3 , 4 , 5. बृहदांत्र चोट मॉडल के लिए MSCs के स्थानीय अनुप्रयोग बृहदांत्र में सूजन उंनति पर अधिक से अधिक प्रभावकारिता दिखाया गया है । हालांकि, वहां तकनीक पर डेटा की धनाभाव है मानव अस्थि मज्जा-व्युत्पंन MSCs (hMSCs) के स्थानीयकरण को बढ़ाने के लिए छोटी आंत, साैंप में सूजन की साइट-1/YitFc (साैंप) प्रयोगात्मक Crohn रोग के मॉडल । यह काम साैंप चूहों, क्रोनिक आंत्र सूजन की एक अच्छी तरह से विशेषता सहज मॉडल में hMSCs के अल्ट्रासाउंड निर्देशित intracardiac इंजेक्शन के लिए एक उपंयास तकनीक का वर्णन है । लिंग-और आयु-कृतित्व, शोथ-मुक्त AKR/J (AKR) चूहों को नियंत्रणों के रूप में उपयोग किया गया. hMSCs और स्थानीयकरण का विश्लेषण करने के लिए, एक ट्रिपल रिपोर्टर युक्त lentivirus के साथ transduced थे । ट्रिपल रिपोर्टर जुगनू luciferase (fl), bioluminescent इमेजिंग के लिए शामिल; monomeric लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (mrfp), सेल छंटाई के लिए; और कटा हुआ दाद सिंप्लेक्स वायरस thymidine कळेनासे (टीटीके), पोजीट्रान उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) इमेजिंग के लिए । इस अध्ययन के नतीजे बताते हैं कि 24 ज intracardiac प्रशासन के बाद साैंप चूहों की छोटी आंत में hMSCs information के रूप में सूजन मुक्त AKR चूहों के विरोध में । इस उपंयास, साैंप चूहों के बाईं निलय में hMSCs के अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन सेल डिलीवरी की एक उच्च सफलता दर सुनिश्चित करता है, ंयूनतम रुग्णता और मृत्युदर के साथ चूहों की तेजी से वसूली के लिए अनुमति देता है । इस तकनीक को छोटे आंत्र सूजन के अंय मॉडलों में MSCs के बढ़ाया स्थानीयकरण के लिए एक उपयोगी तरीका हो सकता है, जैसे कि TNFΔRE6। भविष्य के अध्ययनों से पता चल जाएगा कि इंट्रा धमनी डिलिवरी द्वारा hMSCs की वृद्धि हुई स्थानीयकरण वृद्धि चिकित्सकीय प्रभावकारिता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

Introduction

Crohn के रोग (सीडी) छोटे और बड़े आंतों की एक आम पुरानी सूजन की बीमारी है और आंत्र रोगाणुओं के लिए मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली की एक अनुपयुक्त प्रतिक्रिया से परिणाम के लिए सोचा है7,8. हाल के अध्ययनों से पता चला है कि दोनों murine और मानव mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) आंत्र सूजन के माउस मॉडल में सूजन को दबा सकते हैं1,3,4,5. वहां कई चल रहे नैदानिक परीक्षण है कि मानव अस्थि मज्जा या वसा ऊतक से व्युत्पंन MSCs भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) के साथ रोगियों के इलाज के लिए उपयोग कर रहे हैं, जो9सीडी भी शामिल है । एमएससी थेरेपी के लिए दो मार्गों इन नैदानिक परीक्षणों में इस्तेमाल किया गया है: एक प्रणालीगत अर्क (यानी, नसों में MSCs के) चमकदार आईबीडी के लिए (सीडी सहित) शामिल है, और अंय स्थानीयकृत आवेदन शामिल है/नालव्रण में स्टेम सेल के इंजेक्शन perianal सीडी के साथ रोगियों का पथ । हाल ही में एक मेटा आईबीडी के लिए एमएससी थेरेपी के विश्लेषण में, प्रणालीगत (यानी, नसों में) के लिए एमएससी चिकित्सा चमकदार आईबीडी (सीडी सहित) अप करने के लिए में प्रभावोत्पादक था ४०% (९५% ci: 7-79%) रोगियों की, जबकि प्रभावकारिता बहुत अधिक था, पर ६१% (९५% ci: ३६-८५%), जब MSCs 9नालव्रण कोढ़ सीडी में स्थानीय स्तर पर इंजेक्शन थे । हाल के एक चरण III multicenter allogeneic वसा स्टेम कोशिकाओं के perianal नालव्रण में सीधे इंजेक्शन की सीडी रोगियों की यादृच्छिक placebo नियंत्रित परीक्षण का पता चला सांख्यिकीय महत्वपूर्ण नैदानिक और रेडियोलॉजिकल नालव्रण चिकित्सा का सबूत है, corroborating मेटा-विश्लेषण के निष्कर्षों को10। के लिए कारणों में एमएससी चिकित्सा की कम प्रभावकारिता नसों के लिए चमकदार सीडी के लिए अपर्याप्त जांच की गई है, लेकिन एक कारण सूजन की साइट के लिए MSCs के अपर्याप्त डाक हो सकता है । बृहदांत्र सूजन के मॉडलों में Murine अध्ययन का प्रदर्शन किया है कि केवल MSCs का एक छोटा सा प्रतिशत (1-5%) नसों में सूजन बृहदांत्र तक पहुंचने के इंजेक्शन; शेष MSCs फेफड़ों द्वारा फ़िल्टर कर रहे है (प्रथम-पास प्रभाव)1, 2 ,5,11,12. एकाधिक murine अनुसंधान अध्ययन इसलिए कोलाइटिस के पशु मॉडल में एमएससी प्रशासन के लिए intraperitoneal मार्ग (आईएफसआई) का इस्तेमाल किया है4। हालांकि, वे यह भी दिखा दिया है कि केवल कोशिकाओं का एक छोटा सा अंश तक पहुंचने और engraft बृहदांत्र और है कि प्रभावकारिता घुलनशील paracrine कारकों के स्राव से संबंधित है, ट्यूमर परिगलन कारक की तरह-inducible जीन 6 प्रोटीन (टीएसजी-6)2। प्रतिरक्षादमन और चिकित्सा के एमएससी तंत्र एक multipronged दृष्टिकोण है कि paracrine शामिल शामिल है; सेल निकटता-स्वतंत्र कारकों, टीएसजी-6 की तरह; और सेल निकटता पर निर्भर कारकों, जैसे क्रमादेशित मृत्यु-ligand 1 (पीडी-L1); या दांतेदार 1 । इसलिए, MSC स्थानीयकरण सूजन की साइट के लिए वृद्धि हुई प्रभावकारिता9,13में परिणाम हो सकता है । वास्तव में, एक ताजा अध्ययन से पता चला कि MSCs सीधे बृहदांत्र चोट के स्थल पर प्रत्यारोपित स्रावित angiogenesis द्वारा उपचार के परिणामस्वरूप-संवहनी endothelial वृद्धि कारक (वीईजीएफ़) को बढ़ावा देने । दूसरी ओर, एक न्यूनतम चिकित्सा प्रभाव नसों में इंजेक्शन5के बाद नोट किया गया था । सूजन की साइट के लिए अपने स्थानीयकरण बढ़ाने के लिए (यानी, साैंप चूहों में छोटी आंत), बाईं निलय में एमएससी प्रशासन के लिए इस अल्ट्रासाउंड निर्देशित intracardiac इंजेक्शन तकनीक विकसित किया गया था. छवि निर्देशित इंजेक्शन एक सटीक इंजेक्शन, जो सफलता की एक उच्च दर की ओर जाता है और रुग्णता और मृत्यु दर में कमी के लिए सुनिश्चित करता है । इसके अलावा, बाईं निलय में MSCs के इंजेक्शन उन्हें धमनी परिसंचरण के लिए बचाता है, जहां वे फेफड़ों में फंस बनने से पहले सूजन छोटी आंत तक पहुँच सकते हैं.

इस अध्ययन में, मानव अस्थि मज्जा-व्युत्पंन MSCs (hMSCs) सीडी के साैंप-1/YitFc (साैंप) murine मॉडल में इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया गया14। साैंप जीर्ण सूजन की एक अच्छी तरह से विशेषता सहज murine मॉडल है कि लगभग १००% penetrance14के साथ छोटे आंत्र सूजन विकसित करता है । सूजन किसी भी रासायनिक, प्रतिरक्षा, या आनुवंशिक हेरफेर के अभाव में माइक्रोफ्लोरा के जवाब में विकसित करता है और बारीकी से मानव सीडी11जैसा दिखता है । लिंग-और आयु-मिलान शोथ-मुक्त AKR/J (AKR) चूहों, साैंप के माता-पिता का नियंत्रण चूहों, इस अध्ययन में उपयोग किया गया.

hMSCs अलग थे और अस्थि मज्जा (बी एम) से प्रयोगशाला में विस्तारित नमूनों की पुष्टि के बाद सूचित सहमति का उपयोग कर मांय और पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल15,16से प्राप्त की । अलगाव और विस्तार के बाद, osteogenic में एमएससी की क्षमता, adipogenic, और chondrogenic भेदभाव प्रयोगशाला में कई परख द्वारा मूल्यांकन किया गया था15। osteogenic कार्यात्मक परख hydroxyapatite के चीनी मिट्टी cubes/tricalcium फॉस्फेट मैट्रिक्स द्वारा प्रदर्शन किया गया hMSCs युक्त प्रतिरक्षा CB17-Prkdc SCID चूहों में चमड़े का17। घन परख आस्टियोजेनेसिस और chondrogenesis क्षमता दर्शाता है और व्यक्तिगत एमएससी की तैयारी17के मूल्यांकन के लिए अंतिम परीक्षण माना जाता है । इंजेक्शन के बाद vivo में hMSCs कल्पना करने के लिए, lentivirus ट्रिपल रिपोर्टर जीन के निर्माण के साथ hMSCs transduce के लिए इस्तेमाल किया गया था कि जुगनू luciferase (fl), monomeric लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (mRFP) के होते हैं, और दाद सिंप्लेक्स वायरल thymidine कळेनासे (टीटीके ), एक संशोधित myeloproliferative सार्कोमा वायरस (mnd) प्रमोटर18द्वारा संचालित । जुगनू luciferase ट्रिपल रिपोर्टर में एक एंजाइम है कि गुप्त hMSCs में oxyluciferin के लिए luciferin इंजेक्शन और उत्पादन फोटॉनों/ यह एक vivo में ऑप्टिकल इमेजिंग प्रणाली में संवेदनशील चार्ज-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा (bioluminescence) द्वारा पता चला है, चूहों में लाइव hMSCs के दृश्य को सक्षम करने. Bioluminescence इमेजिंग (BLI) एक संवेदनशील तकनीक है कि कोशिकाओं पर नज़र रखने के लिए और पूर्व vivo विश्लेषण के लिए प्रश्नपत्र का इस्तेमाल किया जा सकता है । एक मजबूत mnd प्रवर्तक का उपयोग ट्रिपल फ्यूजन रिपोर्टर जीन का निर्माण निरंतर अभिव्यक्ति ड्राइव और अधिक से अधिक 16 सप्ताह के लिए इंजेक्शन hMSCs के इमेजिंग के लिए अनुमति देता है19। hMSCs transduce करना मुश्किल है और कम transduction क्षमता है । एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग कर, hMSCs transduction दक्षता में सुधार किया गया था और transgene अभिव्यक्ति18बढ़ाया गया था । mRFP अभिव्यक्ति का प्रयोग (ट्रिपल रिपोर्टर जीन में से एक) प्रवाह cytometry पर, ८३% तक की एक उच्च दक्षता के साथ hMSCs transduce करने की क्षमता का प्रदर्शन किया गया । भेदभाव परख और vivo में घन परख transduced hMSCs की क्षमता को chondrocytes, adipocytes, और osteocytes17में अंतर का प्रदर्शन किया ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > अध्ययन में सभी चूहों के प्रयोगों और प्रक्रियाओं को केस वेस्टर्न रिजर्व यूनिवर्सिटी & #39; एस इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड फीमेल कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया. प्रक्रियाओं का मूल्यांकन और प्रयोगशाला पशु देखभाल (AAALAC) मांयता प्राप्त सुविधा के प्रत्यायन के लिए संघ में आयोजित किया गया । बीएम एक विश्वविद्यालय के अस्पतालों संस्थागत समीक्षा बोर्ड के तहत aspirated था मामले में स्टेम सेल कोर सुविधा पर अनुमोदित प्रोटोकॉल मामला पश्चिमी रिजर्व विश्वविद्यालय में सूचित सहमति के बाद ।

< p class = "jove_title" > १. संस्कृति और Transduction मानव अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न Mesenchymal स्टेम सेल (hMSCs)

< p class = "jove_content" > नोट: hMSCs का अलगाव पिछले प्रकाशनों में विस्तार से वर्णित है < सुप क्लास = "xref" > 15 , < सुप class = "xref" > 20 .

  1. संस्कृति पृथक hMSCs Dulbecco & #39; s संशोधित ईगल मध्यम-कम ग्लूकोज (DMEM-एलजी) मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक । संस्कृति ३७ & #176; C, ९५% आर्द्रता, और 5% कं 2 के साथ T175 कुप्पी में 25 मिलीलीटर वृद्धि मध्यम के साथ । हर 3-4 दिन मध्यम बदलें । 14 दिन पर, hMSCs के प्राथमिक मार्ग प्रदर्शन करते हैं ।
    1. जब कोशिकाओं ८०% संगम तक पहुँचने, पूरी तरह से पुराने माध्यम को दूर करने और धीरे से कोशिकाओं को धो बाँझ फॉस्फेट के 5 मिलीलीटर-बफर खारा (पंजाबियों; के लिए ७५-सेमी ऊतक संस्कृति कुप्पी).
    2. की कुप्पी से पंजाबियों को हटाने और ०.२५% trypsin-ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के 4 मिलीलीटर जोड़ें । ३७ & #176; सी के लिए 5-10 मिनट पर मशीन में कुप्पी वापस प्लेस । जोखिम के समय के रूप में संभव के रूप में संक्षिप्त रखें ।
    3. जब कोशिकाओं के बहुमत अच्छी तरह से गोल हो गए है या संस्कृति पकवान से अलग है, गोजातीय बछड़ा सीरम की मात्रा trypsin की आधी मात्रा के बराबर जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो ।
    4. एक उपयुक्त आकार केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण । 5 मिनट के लिए ४०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक और फिर ध्यान से हटाने supernatant.
    5. (DMEM-LG + 10% FBS) मध्यम के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं reसस्पैंड और एक hemocytometer.
      के साथ कोशिकाओं की गणना नोट: इस बिंदु पर, कोशिकाओं उपसंस्कृत या transduced ट्रिपल रिपोर्टर के साथ किया जा सकता है ।
  2. ट्रिपल रिपोर्टर के साथ hMSCs के transduction प्रदर्शन करते हैं ।
    1. बीज १.५ x 10 6 कोशिकाओं को एक T175 कुप्पी में । संस्कृति 25 मिलीलीटर में वृद्धि मध्यम में ३७ & #176; C, ९५%, आर्द्रता और 5% सह 2 . अनुलग्न करने के लिए कक्षों के लिए 24 h प्रतीक्षा करें ।
    2. 15-एमएल ट्यूबों में एक वायरस कॉकटेल बनाने के लिए, संदर्भ में वर्णित के रूप में < सुप वर्ग = "xref" > १८ .
      1. गल lentivirus पर ३७ & #176; ग में एक जल स्नान । Add १६० & #181; एक 5 मिलीग्राम/एमएल proteamine सल्फेट समाधान में Dulbecco & #39; एस संशोधित ईगल मीडियम (DMEM) को 8 एमएल ऑफ कल्चरल मीडियम (DMEM-LG + 10% FBS) की अंतिम एकाग्रता के लिए १०० & #181; g/एमएल. 3 एस के लिए भंवर 5 (1 समय गल) के संक्रमण (मुि) के एक वायरस गुणा जोड़ें .
    3. को कोशिका संस्कृति की कुप्पी (स्टेप 1.2.1) से हटाकर मीडियम निकाल दें और वायरस के कॉकटेल को कोशिकाओं में डालें. ३७ & #176 पर 10 ज के लिए मशीन; सी, ९५% आर्द्रता, और 5% कं 2 .
  3. के 4 मिलीलीटर जोड़ें १०० & #181; जी/एमएल proteamine सल्फेट DMEM के 4 मिलीलीटर में-एलजी + 10% FBS और एक अतिरिक्त 14 ज.
    4. के लिए मशीन
  4. (DMEM-LG + 10% FBS) के 25 मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित करके 24 घंटे के बाद transduction बंद कर दें ।
  5. प्रवाह द्वारा mRFP व्यंजक का मूल्यांकन करके transduction दक्षता की पुष्टि करें cytometry < सुप वर्ग = "xref" > १८ .
    नोट: यहां, hMSCs कि ६५% से अधिक दक्षता के साथ transduced थे इस्तेमाल किया गया ।
  6. एक सप्ताह में दो बार ताजा मध्यम (DMEM-LG + 10% FBS) के 25 मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित करके कोशिकाओं का विस्तार । Culture on ३७ & #176; C, ९५%, आर्द्रता और 5% कं 2 . बीतने के बाद वे ८०% संगम तक पहुंचने के लिए सेल ।
  7. एक बार कोशिकाओं की वांछित संख्या तक पहुंच गया है, 1.1.2-1.1.4 कदम प्रति trypsinization प्रदर्शन ।
  8. गिनती कोशिकाओं और उन्हें बाँझ पंजाबन (1x) में अंतिम एकाग्रता में 1 x 10 6 कोशिकाओं/75 & #181; L. अल्ट्रासाउंड मशीन के लिए परिवहन के लिए बर्फ पर कोशिकाओं रखें । प्रयोगों के लिए, मार्ग संख्या 2-5 से hMSCs का उपयोग करें.
< p class = "jove_title" > 2. छोड़ दिया में अल्ट्रासाउंड-निर्देशित Intracardiac इंजेक्शन hMSCs के-निलय

< p वर्ग = "jove_content" > नोट: उपयोग SAMP1/YitFc के साथ स्थापित छोटे आंत्र सूजन और उम्र-और लिंग-मिलान AKR/जे चूहों प्रयोगों के लिए. विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त शर्तों के तहत साैंप और AKR चूहों को बनाए रखने, उन्हें मानक प्रयोगशाला चाउ फ़ीड, और 12-h प्रकाश/अंधेरे चक्र पर उन्हें रखने के लिए । यहां, अल्ट्रासाउंड निर्देशित कार्डियक इंजेक्शन एक समर्पित रोगज़नक़ में प्रदर्शन किया गया मुक्त कार्डियक अल्ट्रासाउंड CWRU पशु अनुसंधान सुविधा है कि एक विशुद्ध और ७०% शराब के साथ कुल्ला किया गया था में स्थित कमरे में । प्रयोगशाला अनुसंधान कर्मियों intracardiac इंजेक्शन के दौरान व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण, गाउन सहित, आंख ढाल के साथ चेहरा मास्क, और बाँझ दस्ताने पहनना चाहिए । माउस के शरीर की गर्मी प्रक्रिया की अवधि के लिए बनाए रखा जाना चाहिए ।

  1. माउस anesthetizing से पहले अल्ट्रासाउंड इमेजिंग प्रणाली की स्थापना की । इस प्रोटोकॉल के लिए, माउस इकोकार्डियोग्राम के लिए डिज़ाइन की गई अल्ट्रासाउंड मशीन का उपयोग करें ।
    1. पावर चालू करें और नए अध्ययन को स्थापित करने के लिए transducer (30 MHz) प्रारंभ करें ।
  2. Anesthetize एक प्रेरण चैंबर में माउस १००% ऑक्सीजन में ०.२ की दर से 3-4% isoflurane का उपयोग कर-०.५ L/एक नाक शंकु के माध्यम से १००% ऑक्सीजन में 2% isoflurane के साथ पूरी प्रक्रिया के लिए पशु बनाए रखें । पैर की अंगुली को पिंच करके, माउस को रोलिंग करके इमेजिंग करने से पहले उचित anesthetization की पुष्टि करें, और आंदोलन के अभाव को देख रहे हैं ।
    नोट: नेत्र मरहम corneal सुखाने को रोकने के लिए संज्ञाहरण के प्रेरण के बाद आंखों के लिए लागू किया जाना चाहिए । anesthetized चूहों इमेजिंग मशीनों ( यानी, bioluminescence इमेजिंग प्रणाली और अल्ट्रासाउंड), जहां वे संवेदनाहारी isoflurane की एक रखरखाव खुराक प्राप्त होगा करने के लिए स्थानांतरण । संज्ञाहरण शुरू समय और संज्ञाहरण की पूरी अवधि के लिए पूंछ और पैर पैड हर 10 मिनट पर चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी को देख कर संज्ञाहरण की गहराई का निर्धारण.
  3. इमेजिंग टेबल और अल्ट्रासाउंड जेल के तापमान सेट करने के लिए ३७ & #176; ग.
  4. पूरी तरह से हेयर रिमूवल क्रीम का प्रयोग कर anesthetized माउस के छाती क्षेत्र पर फर से हटा दें.
  5. लापरवाह स्थिति में इमेजिंग मेज पर माउस जगह है और दोनों ऊपरी और निचले अंगों को सुरक्षित प्रक्रिया के दौरान शरीर आंदोलन से बचने के लिए चिपकने वाला टेप के साथ । सभी चूहों के लिए प्रक्रिया के दौरान एक इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम मॉनिटर का उपयोग करें ।
  6. एक ७०% इथेनॉल झाड़ू के बाद एक 10% povidone/आयोडीन झाड़ू का उपयोग कर छाती क्षेत्र की त्वचा को साफ । माउस के छाती क्षेत्र के लिए जेल की एक मोटी परत लागू करें ।
  7. माउंट transducer धारक में और अपनी स्थिति को समायोजित जब तक वाम निलय स्पष्ट रूप से देखने के क्षेत्र में दिखाई देता है ।
  8. लोड १५० & #181; l के transduced hMSC सेल का निलंबन (2 x 10 6 hMSCs १५० & #181 में, बाँझ पंजाबियों के एल) एक 1-एमएल एक 28-जी सुई के साथ सिरिंज में और उचित धारक के लिए सिरिंज सुरक्षित. pulsating खून की कल्पना करने के लिए, सिरिंज में एक छोटी सी हवा कॉलम रखें । झुरमुट से बचने के लिए इंजेक्शन से पहले कोशिकाओं को सस्पेंड कर देना ।
  9. माउस छाती की ओर सिरिंज अग्रिम, अल्ट्रासाउंड मार्गदर्शन का उपयोग कर सुई पथ को समायोजित, और वाम निलय दर्ज करें.
  10. अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के मार्गदर्शन के बाद, पसलियों के बीच अंतरिक्ष के माध्यम से और माउस के बाईं निलय में सिरिंज सुई घुसना.
    नोट: सिरिंज सुई टिप ultrasonographic छवि पर बाईं निलय में स्पष्ट रूप से दिखाई जानी चाहिए. उचित स्थान आगे सिरिंज में ताजा धमनी रक्त बहिर्वाह द्वारा की पुष्टि की जानी चाहिए । ये एक सफल सम्मिलन के संकेत हैं.
  11. hMSC सेल निलंबन बहुत धीरे 2 मिनट से अधिक इंजेक्शन, कोमल पूर्व आवेदनssure
  12. निलंबित कोशिकाओं के इंजेक्शन के बाद, धीरे सुई वापस लेने, अल्ट्रासाउंड जेल से साफ है, और टेप संयम से माउस को रिहा ।
  13. एक नए, साफ पिंजरे में एक गरम पैड के साथ पशु जगह ।
    नोट: प्रक्रिया के पूरा होने के बाद, एक गर्म वातावरण में चूहों को वसूली तक प्रदान किया जाना चाहिए । अधिक ताप से बचना चाहिए, के बाद से परिधीय vasodilation वसूली समझौता । चूहों को बारीकी से निगरानी की जानी चाहिए और अंय चूहों से उनकी पूरी वसूली तक अलग रखा, उनके लिए स्टर्नल recumbency बनाए रखने की क्षमता से संकेत दिया ।
  14. पशु की निगरानी जब तक वे संज्ञाहरण से पूरा वसूली और दैनिक प्रयोग के अंत तक प्राप्त करने ।
< p class = "jove_title" > 3. Bioluminescence (BLI) इमेजिंग ऑफ hMSCs

  1. इमेज intracardiac इमेजिंग सिस्टम में Bioluminescence इंजेक्शन के बाद चूहों 24 एच. vivo इमेजिंग सॉफ्टवेयर में को स्टार्ट करें । इमेजिंग सिस्टम को प्रारंभ करें और एक नया अध्ययन खोलें ।
    1. नियंत्रण कक्ष में, क्लिक करके इमेजिंग पैरामीटर सेट करें & #34; अनुक्रम सेटअप. & #34; इमेजिंग मोड में, select & #34; luminescence & #34; र & #34;p hotograph. & #34; ०.५ एस से 10 मिनट के लिए एक्सपोजर टाइम्स सेट करें. बिन्नी को & #34 पर सेट करें; मीडियम & #34; और द F /stop & #34; 1. & #34; उत्तेजना फ़िल्टर को सेट करें & #34; ब्लॉक & #34; और उत्सर्जन फ़िल्टर को & #34; open. & #34; दृश्य के फ़ील्ड को सेट करें & #34; C & #34; दो चूहों के लिए. प्राप्ति नियंत्रण कक्ष पर क्लिक करके अनुक्रम सेटअप छवि विज़ार्ड में जोड़ें ।
  2. ऑक्सीजन पंप पर स्विच और दोनों प्रेरण चैंबर और मशीन के अंदर नाक शंकु में २.५% के लिए isoflurane सेट ।
  3. के साथ माउस आईएफसआई इंजेक्षन ३०० & #181; D-Luciferin (१२.५ मिलीग्राम/एमएल) के एल.
  4. जगह संज्ञाहरण प्रेरण चैंबर में माउस ।
    1. 2-3 मिनट के बाद, में vivo इमेजिंग चैंबर में माउस हस्तांतरण, संज्ञाहरण कई गुना पर नाक शंकु में सिर के साथ । इमेजिंग के दौरान आंखों की सुरक्षा के लिए ऑप्टिकल ऑइंटमेंट लागू करें । एकाधिक चूहों छवि करने के लिए, आसंन चूहों पर प्रकाश की परछाई को रोकने के लिए काले प्रकाश चकरा का उपयोग करें ।
  5. क्लिक करें & #34; मोल & #34; बटन छवि अधिग्रहण शुरू करने के लिए 10 डी-Luciferin इंजेक्शन के बाद मिन.
  6. दोहराएँ चरण ३.३-३.५ छवि अधिक चूहों के लिए.
    7. vivo     इमेज अर्जन में के बाद
  7. , euthanize चूहों को कं द्वारा 2 साँस लेना ग्रीवा विस्थापन द्वारा पीछा किया, मृत्यु की पुष्टि करने के लिए. ex विवो विश्लेषण करते.
    1. अगर 20 मिनट के बाद ex vivo विश्लेषण किया जाता है, तो चूहों को त्यागने से पहले luciferin इंजेक्शन (step ३.३) को दोहराएं; BLI इंजेक्शन के बाद 20 मिनट की कमी हो सकती है । luciferin
  8. टुकड़े चूहों पूरे जठरांत्र संबंधी मार्ग को हटाने के लिए ( अर्थात, पेट से मलाशय को ), mesenteric लिम्फ नोड (मिलियन), फेफड़ों, तिल्ली, और जिगर. इन्हें संदंश और कैंची का प्रयोग करके पेट्री व्यंजन में रखें < सुप class = "xref" > 2 , < सुप class = "xref" > 4 .
  9. इमेजिंग चैंबर में explanted अंगों से युक्त पेट्री पकवान जगह और कदम ३.१-३.६ के अनुसार BLI छवियों का अधिग्रहण ।
  10. छवि अधिग्रहण के बाद, इष्टतम काटने तापमान (OCT) यौगिक युक्त नमूना molds के लिए explanted अंगों हस्तांतरण । Cryofreeze पर मोल्ड्स को-८० & #176; सी ड्राई आइस का प्रयोग कर के. hMSCs की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए जमे हुए अनुभागों पर anti-luciferase एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए immunohistochemistry करें < सुप वर्ग = "xref" > १६ .
  11. के ठहराव के लिए, उपकरण पट्टी में ब्याज (ROI) उपकरण के क्षेत्र का उपयोग करें < सुप वर्ग = "xref" > १६ , < सुप क्लास = "xref" > १९ . रॉय फ्रेम का चयन करें और इसे छवि पर ब्याज के क्षेत्र में ले जाएं । & #34 पर क्लिक करें; ROI मापन & #34; और SEQ फ़ाइल स्वरूप में डेटा सहेजें । डेटा को. txt फ़ाइल के रूप में निर्यात करें और ठहराव < सुप वर्ग के लिए मूल सांख्यिकीय परीक्षण करने के लिए सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर का उपयोग करना = "xref" > 16 .

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Representative Results

चित्रा 1 से पता चलता है कि hMSCs एक उच्च दक्षता पर ट्रिपल रिपोर्टर के साथ transduced जा सकता है, उनके स्टेम सेल संपत्तियों के संरक्षण । Transduced hMSCs वास्तविक समय में BLI (चित्रा 1C, चित्रा 3) द्वारा visualized किया जा सकता है । इस उपंयास, साैंप चूहों के बाईं निलय में hMSCs के अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन इंजेक्शन की एक बहुत ही उच्च सफलता दर सुनिश्चित करता है, न्यूनतम रुग्णता और मृत्यु के साथ चूहों की तेजी से वसूली के लिए अनुमति (चित्रा 2). hMSCs के साथ एक चूहा इंजेक्शन के लिए औसत समय लगभग 10 मिनट है, और कम से 8-9% रुग्णता और मृत्यु दर इस तकनीक के साथ मनाया गया । मृत्यु का प्रमुख कारण स्ट्रोक और रक्तस्रावी pericardial बहाव से कार्डियक तीव्रसम्पीड़न है. पूर्व vivo विश्लेषण intracardiac के बाद 24 एच प्रदर्शन किया (अंतर धमनी) hMSC के प्रशासन की पुष्टि करता है कि प्रशासन के परिणाम साैंप चूहों की सूजन छोटी आंत को hMSCs के डाक में इस मार्ग, के रूप में सूजन के लिए विरोध मुक्त चूहों पर नियंत्रण (चित्रा 3 सी और डी). इसके अलावा, hMSCs सूजन मुक्त AKR चूहों की छोटी आंत में रहने के लिए और जमा या फेफड़ों में फंस हो रही शुरू नहीं करते हैं (चित्र बी).

Figure 1
चित्र 1 . hMSCs को Vivo विज़ुअलाइज़ेशन में और स्टेम सेल गुणों के प्रतिधारण के साथ Transduced के लिए एक उच्च दक्षता के साथ किया जा सकता है । (क) transduced hMSCs की सूक्ष्म छवि. प्रवाह cytometry (ख) और BLI (ग)के साथ मूल्यांकन mRFP अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित के रूप में मानव MSCs के सफल transduction । Transduced hMSCs स्टेम सेल गुणों को बनाए रखने, के रूप में भेदभाव परख कि Transduced hMSCs की क्षमता को chondrocytes, adipocytes, और osteoblasts में अंतर प्रदर्शन द्वारा की पुष्टि की । एक कार्यात्मक परख के लिए, hydroxyapatite/tricalcium फॉस्फेट मैट्रिक्स के सिरेमिक क्यूब्स प्रतिरक्षा CB17-Prkdc SCID चूहों में चमड़े से प्रत्यारोपित किए गए hMSCs दाता हड्डी के रूप में अस्थानिक की क्षमता को प्रदर्शित करने के लिए (D)। स्केल सलाखों में एक = ५०० µm. स्केल सलाखों के C संकेत इकाइयों में BLI (103 फोटॉनों/s/cm2/steradian) । D में स्केल बार्स = २०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन के लिए उपकरण । (क) उपकरणों की एक मनोरम दृश्य: कार्डियक अल्ट्रासाउंड इमेजिंग प्रणाली (लाल वर्ग), transducer अपने apposite धारक में घुड़सवार, संज्ञाहरण के लिए nosecone के साथ धारक और शल्य तालिका (हरी वर्ग), और साँस लेना संज्ञाहरण मशीन प्रेरण चैंबर (पीला वर्ग) के साथ । (ख) सिरिंज सुई की Ultrasonographic छवि: सुई टिप (लाल तीर) स्पष्ट रूप से बाएँ निलय (पीले तीर) के अंदर दिखाई देता है. (ग) नई धमनी में रक्त बहिर्वाह सिरिंज में सिरिंज सुई के सफल सम्मिलन hMSC प्रशासन करने से पहले बाएँ निलय में पुष्टि करता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . साैंप चूहों में Intracardiac/इंट्रा-धमनी प्रशासन के बाद छोटी आंत को hMSCs information to. 3-4 चूहों के प्रतिनिधि छवियों/समूह, इंजेक्शन के बाद euthanized 24 एच और तीन स्वतंत्र प्रयोगों से दिखाए जाते हैं. vivo में bioluminescence इमेजिंग साैंप और AKR चूहों में hMSCs की उपस्थिति को दर्शाता है 24 इंजेक्शन के बाद एच (ए)। साैंप चूहों में पूर्व vivo विश्लेषण दर्शाता है कि hMSCs तरजीही छोटी आंत (यानी, सूजन की साइट) (डी), जबकि वे सूजन की छोटी आंत में रहने के लिए नहीं कर रहे हैं-मुक्त नियंत्रण AKR चूहे (C)। वास्तव में, पहले धमनी बीतने के बाद, hMSCs AKR चूहों के फेफड़ों में अधिक जमा शुरू, के रूप में साैंप चूहों का विरोध किया (ख).  hMSCs का एक अंश तिल्ली, यकृत और फेफड़ों में साैंप और AKR चूहों (बी, सी, डी) का भी पता लगाया जा सकता है.  स्केल बार्स BLI (103 फोटॉनों/s/cm2/steradian) की इकाइयां इंगित करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस अध्ययन में hMSCs के अल्ट्रासाउंड निर्देशित intracardiac इंजेक्शन के लिए एक उपंयास तकनीक का वर्णन प्रयोगात्मक सीडी के एक छोटे आंत्र माउस मॉडल में । इस तकनीक के अस्तित्व और सफलता के बहुत ही उच्च दर है, सुई के पथ के रूप में वास्तविक समय, उच्च माउस के संकल्प छवियों निलय छोड़ दिया, अल्ट्रासाउंड द्वारा प्रदान के आधार पर समायोजित किया जा सकता है । बाईं निलय को प्रसव का लाभ यह है कि hMSCs तो इंट्रा arterially और बाईपास शिरापरक संचलन वितरित कर रहे हैं, इस प्रकार फेफड़ों में कोशिकाओं के एकत्रीकरण से परहेज । पहले, मन्या धमनी कैथीटेराइजेशन इंट्रा-धमनी डिलिवरी के लिए MSCs16,21इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । मन्या कैथीटेराइजेशन विधि धमनी के अंदर एक कैथेटर जगह के क्रम में मन्या धमनी को बेनकाब करने के लिए सर्जरी शामिल है. कैथेटर कोशिकाओं के चढ़ाए के लिए महाधमनी चाप की ओर उन्नत है । कैथेटर बाद में हटा दिया जाता है और मन्या धमनी ligated. बाईं निलय में MSCs के अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन के लिए इस उपंयास तकनीक, मन्या धमनी कैथीटेराइजेशन की तुलना में, के रूप में कम इनवेसिव है, बहुत तेजी से है (लगभग 10 मिनट/माउस बनाम ६० मिनट/माउस), और कम रुग्णता और मृत्यु है (& #60; 10% बनाम 30%) । माउस अल्ट्रासाउंड के नैदानिक अनुवाद-hMSCs के निर्देशित intracardiac इंजेक्शन मानव नैदानिक परीक्षणों के लिए बेहतर mesenteric धमनी के कैथीटेराइजेशन के माध्यम से किया जाएगा (वर्तमान में क्रोनिक mesenteric ischemia के उपचार के लिए प्रदर्शन किया और असभ्य जठरांत्र रक्तस्राव) रोगग्रस्त छोटी आंत के लिए hMSCs देने के लिए ।

वहां कई संशोधनों और चूहों के बाईं निलय में अल्ट्रासाउंड-निर्देशित intracardiac इंजेक्शन hMSCs के निवारण के बारे में विचार कर रहे हैं । प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण पहलू अल्ट्रासाउंड के उपयोग के लिए छोड़ निलय में इंजेक्शन सुई गाइड माहिर है । किसी भी प्रक्रिया की तरह, उचित प्रशिक्षण, अभ्यास, और विशेषज्ञ प्रतिक्रिया सफलतापूर्वक इस प्रक्रिया को पूरा करने के लिए महत्वपूर्ण घटक हैं । गरीब तकनीक रक्तस्रावी pericardial बहाव और मौत से कार्डियक तीव्रसम्पीड़न के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । सेल का झुरमुट और मस्तिष्क को embolization के जोखिम को कम करने के लिए (यानी, स्ट्रोक), यह एक इंजेक्शन से पहले hMSCs reसस्पेंड करने के लिए आवश्यक है. इस प्रक्रिया को लागू करने से पहले, यह विशेषज्ञ सलाह प्राप्त करने के लिए स्थानीय पशु अनुसंधान सुविधा के आरोप में पशुचिकित्सा परामर्श करने के लिए महत्वपूर्ण है । सुनिश्चित करें कि पशुओं के सुरक्षित और प्रभावी उपयोग के लिए दिशानिर्देश चूहों को अनजाने चोट को कम करने के लिए पीछा कर रहे हैं ।

चूहों में इंजेक्शन के बाद hMSCs के वितरण की जांच करने के लिए, hMSCs उच्च दक्षता के साथ, ट्रिपल रिपोर्टर के साथ सफलतापूर्वक transduced थे. भेदभाव परख प्रदर्शन किया transduced hMSCs की क्षमता chondrocytes, adipocytes, और osteocytes में अंतर करने के लिए18। osteogenic कार्यात्मक परख के लिए, hydroxyapatite/tricalcium फॉस्फेट मैट्रिक्स के सिरेमिक क्यूब्स प्रतिरक्षा SCID चूहों में चमड़े से प्रत्यारोपित किए गए और hMSCs दाता हड्डी के रूप में अस्थानिक की क्षमता का प्रदर्शन किया17,18 . इन भेदभाव और कार्यात्मक परख प्रदर्शित करता है कि transduced hMSCs अपने स्टेम सेल संपत्तियों को बनाए रखने । इस अध्ययन के परिणामों से पता चलता है कि transduced hMSCs intracardiac इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया साैंप चूहों में छोटी आंत के लिए स्थानीयकरण, जो साैंप चूहों में सूजन की साइट है. आंतों में सूजन-मुक्त AKR चूहों, केवल hMSCs की एक अल्पसंख्यक आंतों के लिए स्थानीयकृत 24 एच इंजेक्शन के बाद, जिसका अर्थ है कि, सूजन के अभाव में, hMSCs आंत में नहीं रहते. इस डेटा कई अंय अध्ययनों कि MSCs की क्षमता को स्थानांतरित करने के लिए और चोट के स्थल पर engraft के साथ सामंजस्य में है, जैसे तीव्र रोधगलन में दिल22 और घायल बीएम एक विकिरण में घायल पैर16। अन्य रोगों में की तरह, MSCs के स्थानीय आवेदन बृहदांत्र चोट मॉडल के लिए सूजन उन्नति पर प्रभावकारिता दिखाया गया है23. चूहों में कोलाइटिस के एक 2, 4, 6-trinitrobonzene sulfonic एसिड (TNBS) मॉडल में, हयाशी एट अल. इंजेक्टेड बीएम-MSCs को उजागर क्षेत्र के आसपास, चूहे बृहदांत्र के म्यूकोसा में व्युत्पंन, और कोलाइटिस 23 के त्वरित चिकित्सा का प्रदर्शन .

Manieri एट अल द्वारा हाल ही में एक अध्ययन । बाहर बृहदांत्र में पेट MSCs के इंडोस्कोपिक सहायता इंजेक्शन के एक उपंयास तकनीक का इस्तेमाल किया, बृहदांत्र चोट की साइट, प्रोस्टाग्लैंडीन की कमी चूहों में और उनके प्रभाव के गठन को रोकने में दिखाया अल्सर5मर्मज्ञ । साैंप छोटे आंत्र सूजन का एक मॉडल है, और इन चूहों अपने बृहदांत्र में सहज सूजन विकसित नहीं है । हमारी प्रयोगशाला के आकलन और चूहों में बृहदांत्र सूजन और ट्यूमर के विकास के ठहराव के लिए एक इंडोस्कोपिक विधि का विकास और पुष्टि की है । हालांकि, इंडोस्कोपिक डिवाइस एक जीवित माउस24में छोटी आंत तक पहुंचने में सक्षम नहीं हैं । स्कोरिंग प्रणाली केवल इच्छामृत्यु के बाद साैंप चूहों में सूजन के आकलन के लिए टर्मिनल पद्धति के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । इसलिए, इंडोस्कोपिक विधि साैंप मॉडल में MSCs के स्थानीय अनुप्रयोग के लिए उपयुक्त नहीं है । इंजेक्शन के इस उपंयास तकनीक का उपयोग करके, छोटी आंत को MSCs के बढ़ाया स्थानीयकरण प्राप्त किया जा सकता है । क्या सूजन छोटी आंत को बढ़ा स्थानीयकरण वृद्धि की प्रभावकारिता में अनुवाद करेंगे ज्ञात नहीं है और भविष्य के अध्ययन का ध्यान केंद्रित किया जाएगा । साैंप मॉडल के अलावा, MSCs के अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन छोटे आंत्र सूजन के अन्य मॉडलों में hMSCs के बढ़ाया स्थानीयकरण के लिए एक उपयोगी तरीका होगा, जैसे प्रयोगात्मक सीडी के TNFΔRE6 murine मॉडल.

BLI एक संवेदनशील और सुविधाजनक तकनीक है जिसे वीवो मेंhMSCs ट्रैक करने के लिए प्रश्नपत्र का इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह hMSC डाक के सटीक ठहराव के लिए अनुमति नहीं देता है । चूहों में ट्रिपल रिपोर्टर-transduced hMSCs का उपयोग करने का एक लाभ यह है कि ट्रिपल रिपोर्टर में एंजाइम टीटीके अधिक मात्रात्मक पोजीट्रान उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) इमेजिंग19के लिए अनुमति देता है । एक गणना टोमोग्राफी के साथ (एक ट्रेसर जांच के साथ) अत्यधिक मात्रात्मक पीईटी इमेजिंग के संयोजन (सीटी) स्कैन (स्थानीयकरण प्रदान) रोगग्रस्त स्थल पर engrafted hMSCs की संख्या का एक मात्रात्मक अनुमान के लिए अनुमति देता है, के रूप में गामा गिनती के लिए आनुपातिक हैं व्यवहार्य hMSCs टीटीके जीन के साथ लेबल की संख्या । hMSC स्थानीयकरण के सटीक ठहराव hMSCs डाक और चिकित्सीय प्रभावकारिता का प्रतिशत निर्धारित करने में मदद कर सकते हैं और भविष्य की पढ़ाई का ध्यान केंद्रित किया जाएगा.

इस तकनीक, इसके कई फायदे के बावजूद, कुछ सीमाएं हैं: i) चूहों के लिए एक महंगी कार्डियक अल्ट्रासाउंड इमेजिंग प्रणाली के लिए आवश्यकता, द्वितीय) मृत्यु दर और intracardiac इंजेक्शन के साथ जुड़े रुग्णता, और iii) के लिए इस्तेमाल किया जा अक्षमता स्लो इन्फ्यूश़न (यानी,मी > ओवर आवर्स) कोशिकाओं और अन्य अणुओं की. इन सीमाओं के बावजूद, यह hMSCs के इंट्रा धमनी इंजेक्शन के लिए मन्या धमनी कैथीटेराइजेशन के वर्तमान तकनीक पर कई लाभ है, के रूप में ऊपर प्रकाश डाला.

अंत में, इस अध्ययन के परिणाम प्रभावशीलता और अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन तकनीक की सुविधा के लिए प्रयोगात्मक सीडी के साैंप मॉडल में सूजन की साइट के लिए hMSCs के स्थानीयकरण में सुधार प्रदर्शित करता है । भविष्य के अध्ययनों से पता चल जाएगा अगर hMSCs के अंतर में वृद्धि हुई डाक-धमनी वितरण छोटे आंत्र सूजन के मॉडलों में वृद्धि हुई चिकित्सकीय प्रभावकारिता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

Maneesh दवे को रक्षा अनुदान PR141774 और Crohn और कोलाइटिस फाउंडेशन ऑफ अमेरिका कैरियर डेवलपमेंट अवार्ड विभाग द्वारा समर्थित है । फैबियो Cominelli की प्रयोगशाला को NIH पलाश DK042191 (एफसीए), DK055812 (एफसीए), DK091222 (एफसीए), और DK07948 (एफसीए) द्वारा समर्थित किया गया है. अर्नोल्ड Caplan की प्रयोगशाला एल डेविड और ई. वर्जीनिया बाल्डविन फाउंडेशन द्वारा भाग में समर्थित है । फंडिंग एजेंसियों के अध्ययन विश्लेषण या पांडुलिपि के लेखन में कोई भूमिका नहीं थी । इसकी सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM-LG   Gibco 31600-091
0.25% trypsin-EDTA Gibco 25-200-072
Proteamine Sulfate Sigma Aldrich P4020-1G
D-Luciferin Goldbio luck-500
Fetal Bobine Serum Gibco 26140-079
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062
PBS HyClone SH30256.01
175 cm tissue cutlure flasks Corning 431080
75 cm tissue cutlure flasks Corning 430720
Centrifuge tubes Crysalgen 23-2265
Tissue-Plus O.C.T. compound Fisher HealthCare 4585
Cryomold Standard Tissue-Tek  4557
Lenti-Pac HIV Expression Packaging System GeneCopoeia HPK-LvTR-20 
Povidone Ionidine swabs Medline MDS093901
Hair removal cream Nair N/A
Isoflurane  Piramal Helathcare  NDC 66794 013 25
Forceps  Fine Science Tools 11200-33
Dissection scissors (Wagner) Fine Science Tools Wagner 14068-12
Puralube vet ointment Puralube NDC 17033-211-38
Aquasonic 100 ultrasound transmission gel Parker laboratories 01 08
Petri dish Fisher Scientific FB0875711A
SAMP mice Cleveland Digestive Disease Research Core Centre
AKR mice Cleveland Digestive Disease Research Core Centre
Vevo 770 imaging system  Visual Sonics, Toronto, Canada
 IVIS spectrum series system  PerkinElmer, Waltham, MA
Living image software  CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA
Triple reporter Kindly provided by Dr. Zheng- Hong Lee, CWRU, (citation 19)

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References

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दवा अंक १२७ Mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) Crohn की बीमारी SAMP1/YitFc अल्ट्रासाउंड निर्देशित intracardiac इंजेक्शन hMSC transduction bioluminescence इमेजिंग
अल्ट्रासाउंड निर्देशित Intracardiac इंजेक्शन मानव Mesenchymal स्टेम कोशिकाओं प्रयोगात्मक सूजन आंत्र रोगों के Murine मॉडल में उपयोग के लिए आंत को डाक बढ़ाने के लिए
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Dave, M., Menghini, P., Sugi, K., Somoza, R. A., Lee, Z., Jain, M., Caplan, A., Cominelli, F. Ultrasound-guided Intracardiac Injection of Human Mesenchymal Stem Cells to Increase Homing to the Intestine for Use in Murine Models of Experimental Inflammatory Bowel Diseases. J. Vis. Exp. (127), e55367, doi:10.3791/55367 (2017).

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