Summary
فقدان متفاوتة من متوسطة من صفيحة معايرة دقيقة يؤثر على استنساخ تشكيل الورم كروي متعددة الخلايا موحد. تحسين ظروف التربية للحد من فقدان المتوسطة هامة من شأنها تحسين استنساخ تشكيل كروي ونتائج فحوصات على أساس كروي باستخدام تقنية السائل تراكب.
Abstract
نماذج الورم التي تشبه عن كثب في ظروف المجراة تزداد شعبية في اكتشاف وتطوير الأدوية لفحص المخدرات المحتملة المضادة للسرطان. الكروية ورم الخلايا (MCTSes) تحاكي بشكل فعال الظروف الفسيولوجية من الأورام الصلبة، مما يجعلها ممتازة نماذج في المختبر لتعظيم الاستفادة الرصاص والتحقق من صحة الهدف. من مختلف التقنيات المتاحة للثقافة MCTS، طريقة السائل تراكب على الاغاروز هي واحدة من أكثر الطرق غير مكلفة لتوليد المراكز. ومع ذلك، فإن نقل موثوق بها من الثقافات المراكز باستخدام السائل تراكب لفحص عالية الإنتاجية يجوز المساس بها عدد من القيود، بما في ذلك طلاء صفيحة معايرة دقيقة (النواب) مع الاغاروز وirreproducibility من تشكيل المراكز موحد عبر الآبار. نواب عرضة بشكل كبير إلى حافة الآثار التي تنتج عن تبخر الزائد من المتوسط من الخارج من لوحة، ومنع استخدام لوحة كاملة لمكافحة المخدراتالاختبارات. توفر هذه المخطوطة التحسينات الفنية التفصيلية لأسلوب السائل تراكب لزيادة قابلية واستنساخ تشكيل المراكز موحد. بالإضافة إلى ذلك، وتفاصيل عن بسيط، وأداة البرمجيات شبه التلقائي، وقابلة للتطبيق عالميا لتقييم المراكز ميزات بعد عرض العلاج من تعاطي المخدرات.
Introduction
يتم ترتيب الخلايا السرطانية في الأورام من الناحية الفسيولوجية في بنية معقدة، 3 الأبعاد (3D) وتحيط بها المصفوفة خارج الخلية والخلايا التفاعل. ان ما يقرب من جميع الخلايا في الأنسجة الموجودة في بيئة 3D، أدى الحاجة إلى أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية في نماذج ورم في المختبر التي تحاكي صفات الورم في تطوير العديد من التقنيات ثقافة 3D 1، 2، 3. هذه النماذج أصبحت الآن أدوات البحث الأساسية لدراسة دور المكروية ورم خبيث في الخلايا وردا على العلاجات في 3D 2. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع 2-الأبعاد الثقافات (2D) خلية 4، 3D نماذج تسمح لفهم أفضل للتفاعلات ورم سدى، والتي تؤثر على خلية مسارات الإشارات.
وكثيرا ما تستخدم الكروية ورم الخلايا (MCTSes) من خطوط الخلايا السرطانية في 3D الخلية جنماذج ulture بسبب القرب النسبي لفي الجسم الحي الأورام. للخروج من العديد من التقنيات في الاستخدام، وقد اكتسب تقنية السائل تراكب (الكثير) من الجيل المراكز على لوحات المغلفة الاغاروز اهتماما كبيرا للرصاص الأمثل والهدف التحقق من صحة 5، 6، 7، 8، 9، 10، 11. وهذا واضح من الدراسات الحديثة التي استطاعت بنجاح لتشغيل شاشات التجريبية من المكتبات مجمع في الثقافات المراكز باستخدام الكثير 6 و 7. ومع ذلك، وتقلب جيدا لجيدا في المراكز التشكل والنمو بسبب فقدان الناجم عن تبخر متفاوتة من متوسطة عقبات المشتركة التي تصاحب الكثير باستخدام صفيحة معايرة دقيقة (النواب). ونتيجة لذلك، وتشكيل غير موحدة MCTSes يؤثر سلبا على أهمية وجدوىبيانات من فحوصات الدوائية 8 و 12 و 13. بالإضافة إلى قضايا استنساخ، مشكلة عملية أخرى تؤثر على أساس LOT-فحوصات عالية الإنتاجية هي طلاء النواب مع الاغاروز عند استخدام السائل التلقائي وحدات الاستغناء. على الرغم من أن وحدة الاستغناء يمكن أن تظل ساخنة لمنع التبلور من الاغاروز، وانسداد الكاسيت صرفها والأنابيب هو مصدر قلق محتمل لأنظمة روبوتية 6.
للتغلب على بعض من هذه التحديات، ونحن قد وضعت مؤخرا بعض التعديلات في الكثير من أجل الثقافة MCTS 8. وتستند هذه التعديلات أساسا على السبل الممكنة لمنع فقدان المتوسطة متفاوتة من النواب باستخدام الأدوات التي توجد عادة في المختبرات فحص عالية الإنتاجية. إجراء مفصل من الكثير المعدلة لتوليد MCTSes الحجم بشكل موحد واستنساخه عبر 3وقدم لوحات 84-جيدا (WPS) هنا. يعرض المخطوطة أيضا روتين مؤتمتة شبه لتقييم حجم المراكز، لا سيما في MCTSes تفككت جزئيا، المعالجة المخدرات التي ليس لها حدود واضحة المعالم لقياس مساحة المقطع العرضي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد لوحات مغلفة الاغاروز-
- تزن 0.75 غرام من ذوبان منخفضة نقطة الاغاروز وإضافته إلى 100 مل من المتوسط 5A مكوي و(مع أو بدون أحمر الفينول) دون المصل. الحرارة الحل في الميكروويف وعباب كل 1-2 دقيقة إلى حل تماما الاغاروز. الأوتوكلاف الحل لتعقيمها.
- تبريد تعقيمها الاغاروز إلى حوالي 70 درجة مئوية وتصفية عليه من خلال 500 مل، 0.22 ميكرون فلتر أعلى عن طريق الترشيح فراغ في مربع تدفق الصفحي. قسامة 0.75٪ تصفيتها حل الاغاروز (FAS) في أحجام أصغر إذا لم تكن تستخدم الحل كله في وقت واحد. تخزين هذا الاستخدام على استعداد الاغاروز حل جو معقم و مطهر في غرفة باردة أو 4 درجات مئوية الثلاجة لمدة تصل إلى 4 أسابيع.
- نعلق أنبوب صغير مع plastic- أو كاسيت ذات الرؤوس المعدنية الاستغناء عن لموزع كاشف كومبي ورئيس الكاسيت مع 70٪ من الإيثانول (ETOH) ثم العقيمة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في مربع التدفق.
- قبل الاستخدام، وتسخين قسامة المخزنة من FAS ط ن الميكروويف لتذوب فيه. رئيس الكاسيت الاستغناء عن حل الاغاروز ومعطف 384 بشكل جيد، زراعة الأنسجة (TC) المعالجة بالإثير "خاص" microplates مع 15 ميكرولتر من FAS. السماح للالاغاروز في لوحة لتبرد لمدة 15-20 دقيقة قبل البذر الخلايا. تخزين لوحات المغلفة الاغاروز جو معقم و مطهر، ملفوفة في كيس البولي ايثيلين في غرفة باردة أو عند 4 درجات مئوية، وبعيدا عن الضوء المباشر.
ملاحظة: تجنب التدفئة المتكررة من 0.75٪ FAS لمنع حدوث تغيير في تركيز الاغاروز في المحلول. لوحات المغلفة الاغاروز يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 2 أسابيع عند تخزينها وفقا للشروط المذكورة أعلاه. وFAS لا يتطلب التدفئة خلال طلاء لوحات. - تنظيف كاسيت الاستغناء بواسطة فتيلة مع 70-80 درجة مئوية الماء المعقم لإزالة أي الاغاروز المتبقية في نصائح الكاسيت والأنابيب.
2. خلية الثقافة والمراكز تشكيل
- ثقافة الخلايا HCT116 سرطان القولون والمستقيم الإنسان، كما هو موضح سابقامعشوقة = "XREF"> 8.
- إزالة العدد المطلوب من المغلفة الاغاروز، 384 جيدا، TC المعاملة microplates من التخزين البارد ويوازن بينها إلى درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 15 دقيقة.
- إعداد موزع كاشف كومبي بذر الخلية فتيلة الكاسيت أنبوب صرف القياسية مع 70٪ ETOH وبرنامج تلفزيوني العقيمة. ضبط مستوى الصوت البذر إلى ميكرولتر المطلوب وسرعة صرفها والمتوسطة باستخدام أزرار الضبط اليدوي على موزع.
ملاحظة: يتم تنفيذ عملية الخلية البذر بأكملها تحت ظروف معقمة وفي مربع تدفق الصفحي. - فصل الخلايا الملتصقة من قارورة زراعة الأنسجة باستخدام انزيم خلية التفكك المؤتلف. جعل مخزون تعليق خلية في دورق العقيمة مع خلايا البذور في مناطق ذات كثافة من 2.5 × 10 4 خلية / مل لكل بئر في 50 ميكرولتر من متوسط النمو الكامل. عندما بذر أكثر من 384-WP، وإثارة الخلايا باستخدام محرك مغناطيسي لمنعهم من الاستقرار إلى الجزء السفلي من الكأس.
- السماح لللوحات للراحة لمدة 30 دقيقة في RT ثم الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة على 4 ز س.
- وفي الوقت نفسه، أخذ غطاء البيئي الحد من التبخر، وملء مع 8 مل من H 2 O معقمة أو 5٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) في الجانبين قصيرة (اليسار واليمين) باستخدام 5 مل ماصة (الشكل 1A). أولا، الاستغناء عن 4 مل من ملء السائل في الحوض الصغير في الجانب الأيسر عن طريق تجتاح طرف ماصة ببطء صعودا وهبوطا. كرر هذه الخطوة مع أدنى مستوى في الجانب الأيمن.
ملاحظة: تأكد من أن السائل يضاف إلى أحواض الجانب لا دمج في وسط غطاء، وترك فجوة لتبادل الغازات (الشكل 1A). إضافة كميات زائدة من H 2 O النتائج في تسرب H 2 O إلى السطح الخارجي للغطاء، وبعد ذلك في الآبار الخارجي لوحات TC 384 أيضا. - ملء خزان السائل من لوحة TC 384 بشكل جيد مع H 2 O معقمة واستبدال أغطية لوحة منتظمة مع الأغطية البيئية مليئة السائل (الشكل 2A).
- وضع لوحات في حاضنة 37 درجة مئوية دوارة مع الرطوبة 95٪، 5٪ CO 2، و 20٪ O 2، وتسمح للخلايا لتجميع في MCTSes لمدة 4 أيام. تجنب فتح باب الحاضنة لفترة طويلة جدا في الأيام اللاحقة من أجل منع مستوى الرطوبة من التسرب فجأة.
3. متوسط الصرف باستخدام نظام الروبوتية
- في يوم 4 التالية تشكيل المراكز، إضافة 30 ميكرولتر من المتوسط قبل تحسنت لكل بئر باستخدام الآلي موزع صفيحة الغسالة. السماح للMCTSes لتنمو لمدة 3 أيام إضافية. استبدال المتوسطة بانتظام كل 3 أيام، حتى بلوغهم الحجم المطلوب للتجريب.
- لنضح حجم محدد من المتوسط من كل جانب، وضبط تجريبيا ض -height من مشعب غسالة. نضح 30 ميكرولتر من المتوسطة لكل بئر واستبدالها مع 30 ميكرولتر من الطازجة والمتوسطة قبل تحسنت.
ملاحظة: تعيين سرعة صرفها والسرعة التي مشعب غسالة يسافر باستمرارفي الآبار في أدنى معدل للحد من الاضطرابات في الآبار.
التصوير 4. عالية المحتوى من المراكز وشبه الآلي تحليل الصور
- صورة MCTS في نظام التصوير الآلي عالية المحتوى باستخدام الهدف الهواء 4X (NA 16).
- تعيين وقت التعرض إلى 11 مللي وbinning إلى 4 × 4. ضبط عدد وتباعد -stacks ض وbinning بكسل النحو المرغوب فيه للتجربة لالتقاط MCTS كامل لكل بئر.
- معالجة متدرج الصور، كما هو موضح في "التمهيدي"، باستخدام الروتين في المنزل مكتوب في لغة البرمجة.
كما تتوفر ملفات التعليمات البرمجية التكميلية (الشكل 1B) رمز. م والتمهيدي. TXT الملفات: ملاحظة. التدابير الروتينية المنطقة MCTS، المحاور الرئيسية والثانوية، محيط، وصلابة من الصور 2D.
شكل 1:إعداد الأغطية البيئية ومخطط من روتين شبه التلقائي. (أ) صورة من الغطاء البيئي الحد من تبخر مليئة الصحيح (يسار) والفائض (يمين) مقدار ملء السائل (هنا، 5٪ DMSO). يشير السهم إلى أدنى مستوى في الجانب القصير لإضافة السائل. تظهر النجمة الفجوة في منتصف الغطاء بعد إضافة وحدة التخزين الصحيحة من DMSO. (ب) سير عمل تبين الخطوات المتبعة في روتين مؤتمتة شبه تحليل الصور. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
فقدان متفاوتة من المتوسط، ولا سيما من الآبار المحيطة، هي قضية كثيرا ما تصادف في البرلمان مع وحدات التخزين ثقافة الصغيرة. تحسن كبير في الظروف والثقافة، مثل حاضنات مع أنظمة تسيطر عليها بشكل جيد للحرارة / الترطيب والنواب الحد من التبخر وأغطية لوحة، والحد من خسائر كبيرة في المتوسط عبر الآبار 8. لقياس التبخر النسبي، وأضيفت كميات متساوية من البرتقال G (خطأ في مرماه) إلى كل بئر، وكانت قد سجلت التغيير في OG الامتصاصية على مدى 3 أيام في لوحات ذات الأغطية العادية والبيئية في حاضنات القياسية والدوارة. تم تقسيم الآبار لوحة إلى 6 مجموعات بناء على المسافة من حافة لوحة (الشكل 2A). في مجموعات 1-4، وكان هناك تغير كبير في امتصاص OG مع مرور الوقت في لوحات ذات الأغطية العادية في حاضنة القياسية (الشكل 2B). على الرغم من أن هناك أيضا تباين في OG الامتصاصية من، وكانت معاملات التباين (السير الذاتية) مجموعة 1 الآبار في لوحات تحت غطاء / مجموعة حاضنة الدوارة البيئي (الشكل 2C) أقل بكثير مقارنة مع أولئك من لوحات ذات الأغطية العادية في حاضنة القياسية (الشكل 2D).
خسارة الناجمة عن تبخر متفاوتة المتوسطة هي واحدة من الأسباب المحتملة لتقلب جيدا إلى جيدا في حجم المراكز وقراءات الفحص في البرلمان 8. ومع ذلك، أدت لوحات TC 384 بشكل جيد مع غطاء / مجموعة حاضنة الدوارة البيئي في تشكيل MCTSes موحدة عبر 6 مجموعات من الآبار (الشكل 2E). في المقابل، MCTSes في لوحات مع غطاء / مجموعة حاضنة القياسية العادية تختلف اختلافا كبيرا في الحجم والصلابة (الشكل 3F). صلابة هو مقياس لMCTS كروية ويعطي درجة من تفكك المراكز. صلابة منطقة 2D هي نسبة بكسل في التعاونيتم تحديد nvex بدن المنطقة ذات الاهتمام (ROI) وبقسمة مجال العائد على الاستثمار من خلال المنطقة للبدن محدب من العائد على الاستثمار. كلا المنطقتين دائرية وبيضاوي الشكل لديها صلابة 1، وكما يتحلل في المراكز، يقلل من صلابة. وذكرت تقارير الفرق في المنطقة في داس وآخرون. (2016) 8. تم حساب حجم من المحاور الرئيسية والثانوية للMCTSes.
الشكل 2: لوحات مع الحد الأدنى من نتيجة التبخر في زيادة استنساخ المراكز. (A) ويرد خريطة لوحة لإظهار تقسيم الآبار إلى 6 مجموعات. (B و C) وهناك تباين وتعتمد على وقتا كبيرا في الامتصاصية النسبي للOG من الآبار في مجموعات 1-4 في لوحات مثقف في حاضنة القياسية مع الأغطية العادية (ب) ومن مجموعة 1 نحنLLS في لوحات ذات الأغطية البيئية في حاضنة الدوارة (C). الامتصاصية يوم 3-5 OG تم تطبيع إلى اليوم 0. (D) وبلغ متوسط السير الذاتية للOG الامتصاصية من مجموعة وترد 1 الآبار من أيام 3-5 لاثنين من لوحة تركيبات غطاء / الحاضنة. السيرة الذاتية هي متوسطات من 3 تجارب مستقلة. لم (E) MCTSes تشكلت في لوحات مع مجموعة غطاء / الدوارة الحاضنة البيئية لا تختلف اختلافا كبيرا في جميع أنحاء 6 مجموعات من الآبار. (ب) ومع ذلك، لوحات ذات الأغطية العادية في حاضنة القياسية شكلت MCTSes من حجم متغير. وتظهر بيانات ل n> 60 MCTSes لكل مجموعة. الصناديق وقضبان أفقية داخل صناديق في boxplots تمثل 25 و 75 المئين الخامس والوسيط، على التوالي. تمثل شعيرات من ال 5 و 95 تشرين النسب المئوية، ويتم الإشارة إلى القيم المتطرفة من النقط السوداء الانحياز في boxplots. وقدم القيم ص التحليل كروسكال واليس أدناه مجموعة شرق افريقياح boxplot. البيانات هي من لا يقل عن 3 تجارب مستقلة لكل لوحة مزيج غطاء / الحاضنة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
لتحديد إمكانية تطبيق من الروتين، وعولج MCTSes من العمر يوم 7 مع باكليتاكسيل (PTX)، الفينكريستين (VCR)، اوكزالبلاتين (OXA)، دوكسوروبيسين (DOX)، و 5 فلورويوراسيل (5-FU) في 3 تركيزات مختلفة لمدة 4 أيام. تم الحصول على الأدوية من مستشفى أولوموك جامعة، جامعة بالاتسكي. ثم تم تحليل الصور المراكز، وتمت مقارنة هذه المنطقة، المحاور الرئيسية والثانوية، محيط، وصلابة MCTSes تعامل مع الضوابط (CTLs). واستخدمت المحاور الرئيسية والثانوية لحساب حجم الهندسي. كان هناك انخفاض تعتمد على التركيز في مجال المراكز وحدة التخزين بعد العلاج من تعاطي المخدرات (الشكل 3). على الرغم من 0.001 ميكروغرام / مل الخامسأدى CR و 0.4 ميكروغرام / مل DOX و5-FU في الزيادة في منطقة المراكز، وحجم وزيادة كبيرة إلا بعد 0.001 ميكروغرام / مل VCR. كان MCTS محيط مختلفة إلى حد كبير فقط على أعلى تركيزات PTX، DOX، و5-FU، والتي أثرت تماما حجم المراكز. أدى PTX والفيديو عند 0.25 ميكروغرام / مل و 0.06 ميكروغرام / مل وDOX و5-FU على 100 ميكروغرام / مل في حدوث انخفاض كبير في صلابة، مما يشير إلى تفكك-الكامل-لجزئية من MCTSes (الشكل 3).
الشكل (3): التدبير من آثار المخدرات في MCTSes من روتين شبه الآلي. يتم عرض (A) صور CTL وMCTSes المعالجة المخدرات. شريط النطاق = 10 ميكرون. يتم إعطاء التركيزات في ميكروغرام / مل لكل صورة. (ب) الرسوم البيانية تظهر تأثير تعتمد على الجرعة من PTX، جهاز فيديو، OXA، DOX، و5-FU علىالمساحة والحجم من 7 MCTSes البالغ من اليوم التالي 4 أيام من العلاج. تم تخفيض محيط المراكز بشكل كبير بعد 0.25 ميكروغرام / مل PTX و 100 ميكروغرام / مل DOX و5-FU. تركيزات الدواء التي أسفرت عن تفكك-الكامل-لجزئية من MCTSes انخفاض كبير MCTS صلابة مقارنة CTL. البيانات هي يعني ± SD لا يقل عن 5 MCTSes من 3 لوحات مستقلة. * ع <0.001، # ف <0.01، φ ص <المعاملة المخدرات 0.05 مقابل CTL، في اتجاه واحد أنوفا مع التجارب المقارنة متعددة Dunnett ل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طلاء 384 حسنا لوحات TC مع المصفاة الاغاروز
الممارسة القياسية في الكثير هو استخدام 1-1.5٪ منخفضة ذوبان نقطة الاغاروز لمعطف لوحات، الأمر الذي يتطلب الاغاروز و / أو وحدة الاستغناء أن تبقى ساخنة لمنع التبلور من الاغاروز 6. في التبلور من الاغاروز يشكل مصدر قلق محتمل بينما كان يستعد لوحات متعددة باستخدام أشرطة الاستغناء السائل مع فتحات الأنابيب الصغيرة التي تتراوح بين 0.2 و 0.4 مم في القطر. للتغلب على مشكلة محتملة من انسداد أشرطة صرفها، وكان يستخدم 0.75٪ FAS، كما أنه لا يتطلب أي تدفئة إضافية خلال الاستغناء. بالمناسبة، لوحظ أيضا أن 0.75٪ FAS لا هلام بأسرع ما غير المرشحة 1-1.5٪، أو حتى 0.75٪، حل الاغاروز. باستخدام 0.75٪ FAS، فإنه يأخذ أقل من 35 الصورة لمعطف لكامل 384 جيدا لوحة TC دون انسداد الكاسيت صرفها. يمكن تنظيفها الكاسيت في نهاية بواسطة فتيلة مع الماء الساخن لإزالة المتبقيgarose، والتي يمكن أن تسد نصائح عندما الكاسيت ليس قيد الاستخدام.
غطاء البيئي والروتاري حاضنة خلال منتظم غطاء لوحة وحاضنة
خسارة الناجمة عن تبخر متفاوتة من المتوسط يؤثر بشكل كبير على استنساخ تشكيل المراكز موحد، وبالتالي تقلل من جدوى نتائج فحوصات 14. والمثير للدهشة، وأظهرت مجموعة 1 الآبار لوحات TC 384 وأيضا في إطار مجموعة غطاء / الدوارة حاضنة البيئي الاختلاف ذات دلالة إحصائية في OG الامتصاصية (الشكل 2C). ومع ذلك، السيرة الذاتية انخفاض OG الامتصاصية في مجموعة 1 الآبار إلى أن تبخر في الآبار الخارجي لوحات 384 جيدا TC في الحاضنة الدوارة مع الأغطية البيئية ليست مفرطة بحيث تؤثر على نمو MCTS (الشكل 2D). وهذا واضح من MCTSes الحجم بشكل موحد شكلت في مجموعة 1 الآبار في لوحات مع غطاء / مجموعة حاضنة الدوارة البيئي. أيضا، وانخفاض خسارةمتوسطة يمنع تقلب جيدا إلى جيدة في فحوصات المخدرات من لوحات TC 384 جيدا تربيتها في الحاضنة الدوارة مع الأغطية البيئية 8.
النتائج منهجية قدمت أيضا في تشكيل MCTSes زي السرطان الأخرى قليلة وخطوط الخلايا غير السرطانية 8. ومع ذلك، ونظرا لأن جميع الخلايا لا يمكن أن تتجمع بطبيعتها إلى MCTSes على سطح غير ملتصقة، وهذه الطريقة الكثير لا تكون مناسبة لخطوط الخلايا الأخرى التي لم يتم اختبار للاستنساخ تشكيل المراكز موحد. بالإضافة إلى ذلك، كان التركيز أساسا على استخدام حاضنة التكنولوجيا المتقدمة في تركيبة مع نواب الحد من التبخر وأغطية لوحة لزيادة استنساخ تشكيل المراكز. حل آخر رخيصة وسهلة لزيادة استنساخ تشكيل المراكز يمكن أن يكون استخدام زيت جنين الصف المعدنية وتنفس الختم الأشرطة أو الأغشية، والتي تمنع تبخر ولكن تتيح تبادل الغاز الطبيعي 15. على الرغم من الاغاروز يضيف سمك اضافية لوحة قيعان، التي يمكن أن تكون عائقا أمام تصوير عالية المحتوى، وعمق الميدان التي تم إنشاؤها من قبل أسفل الاغاروز في التصوير الضوء المرسل لا يعوق التثبت من حجم المراكز وشكل بعد العلاج من تعاطي المخدرات. ولذلك، ستكون الطريقة المعروضة من الفائدة المحتملة للباحثين تواجه قضايا استنساخ في الكثير من الثقافة المراكز.
الآلية شبه صورة روتين تحليل
على الرغم من أن هناك العديد من شبه الآلي / البرمجيات المتاحة لتحليل الصور المراكز الآلي، وقياس أحجام-كاملة إلى جزئيا MCTSes تفككت بعد العلاج من تعاطي المخدرات هو عرضة للأخطاء 16 و 17. في الخطوة الأولى من الروتين المقدمة، تم اختيار الصورة الأفضل تركز تلقائيا من مجموعة من الصور -stack ض من خلال حساب قاعدة من قواعد التدرج الصورة واختيار واحد مع أكبر 0.999 غنى عنهNTILE. هذا هو مقياس قوة والضوضاء حساسة من الحد الأقصى.
بعد ذلك، يتم اقتصاص الحدود قتامة ويتم تخزين الصور المجهزة في القرار الأصلي في شكل رسومات الشبكة المحمولة. هذه العملية تقلل من الحجم الإجمالي من 2.5 GB، من التصوير على كامل 384 بئر، لوحة تعامل TC، إلى ما يقرب من 100 ميغا بايت. وفي وقت لاحق، تم العثور على وسط المراكز من خلال التفاف مع فلتر دائري نصف قطرها المعرفة من قبل المستخدم (نستخدم 20 بكسل، الشكل 4A). وهناك حد أدنى المحلية واضح من الصورة التي تمت تصفيتها يوفر موقف المركز (الشكل 4A). الانتقال من هذا المركز في للحلقة متحدة المركز، ويتم احتساب قيمة تدرج الرمادي متوسط، M، في كل قذيفة بوصفها وظيفة من وعاء نصف قطرها، R. بعد ذلك، وأول (كبير) كحد أقصى للمشتقات العددية وظيفة M (R) هي العثور على (الشكل 4B). يؤخذ الأراضي الفلسطينية المحتلة نقطة M من هذا الحد الأقصى كما عتبة الأمثل، والصورة هي الصورةegmented من العتبة عند هذا المستوى.
يتم تحديد المراكز باعتبارها أكبر شريحة المركزي للصورة. هذا الإجراء عادة ما تعمل على نحو أفضل من تقنية العتبة القياسية لأنها قادرة على فصل الأساسية المراكز من أجزاء التفكك التي غالبا ما تنتج عن العلاج من تعاطي المخدرات (الشكل 4C و 4D). وعلاوة على ذلك، فإن النهج المعتمد هنا يجعل من استخدام ضمني كروية من المراكز. إجراءات بسيطة العتبة، أو خوارزميات تقوم على ملامح نشطة، لا استغلال المعرفة مسبقا التي كائن كروية التي يمكن العثور عليها. عندما تم الكشف عن المراكز بشكل واضح ومرسوم، والحد الأقصى M الأراضي الفلسطينية المحتلة واضحة واحدة. الروتين ثم يقيس خصائص المراكز، مثل منطقة، المحاور الرئيسية والثانوية، محيط، وصلابة القطع الناقص المجهزة، ويحفظ معاينة للصورة مجزأة. إذا كان الحد الأقصى ليست واضحة، و / أو إذا متعددة ماكسيما المحلية موجودة، مسبقايتم حفظ نظرا لتجزئة المقترح إلى مجلد التصحيح.
في الخطوة ما قبل الأخيرة، وروتين يمشي المستخدم من خلال مجلد تصحيح لضبط تجزئة اقترح يدويا عن طريق تحريك عتبة أعلى أو لأسفل واختيار المنطقة المضلعة التي تهم بقطع أجزاء زائدة عن الحاجة المحتملة للقناع. بعد هذا التصحيح اليدوي، والتدابير الروتينية ويوفر خصائص المراكز، كما هو موضح أعلاه.
الشكل 4: رسم توضيحي لإجراء تقطيع الصورة. (أ) يتم وضع علامة على مركز MCTS مع النجمة الخضراء. ويوجه مثال على بالطوق باللون الأحمر. (ب) قيمة الرمادي متوسط في كل قذيفة وتآمر بوصفها وظيفة من وظائف دائرة نصف قطرها قذيفة (الخط الأزرق). يحسب مشتق العددية لهذا المنحنى (خط أحمر). أول ماجستير كبيرتم العثور على ximum للمشتقات العددية (النجمة السوداء). (ج) مما أدى تجزئة الصحيحة للصورة في صلب المراكز والخلفية مع الأجزاء المراكز التفكك. (د) تقسيم غير الصحيحة التي حصلت عليها طريقة أوتسو ل. الهدف 4X. شريط مقياس = 500 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من وزارة التشيك التربية والتعليم والشباب والرياضة (LO1304) والوكالة التكنولوجية للجمهورية التشيكية (TE01020028). فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور اكشمان فاراناسي لأخذ الصور الثابتة من الأغطية البيئية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Low-melting |
| McCOY's 5A Medium | Sigma-Aldrich | M8403 | |
| “rapid” Filtermax filter | TPP | 99505 | 0.22 μm, 500 mL |
| Multidrop™ Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | |
| Small Tube Dispensing cassette | Thermo Fisher Scientific | 24073295 | Metal tip |
| 384-well TC plate | PerkinElmer | 6057308 | Plate type- CellCarrier |
| Standard Tube Dispensing Cassette | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | |
| MicroClime Environmental Lid | Labcyte | LLS-0310 | |
| DMSO | Sigma | D4540 | |
| Rotary Incubator (SteriStore ) | HighRes Biosolutions | 23641 | Serial No.: D00384 |
| Microplate Washer Dispenser | BioTek | Unspecified | Model: EL406 |
| High-Content Imaging System (CellVoyager ) | Yokogawa Electric Corporation | Unspecified | Model: CV7000 |
| Orange G | New England Biolabs | B7022S | |
| TrypLE™ Express recombinant cell dissociation reagent | Thermo Fisher Scientific | 12604021 | Phenol red free |
References
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
- Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening. Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. , 69-70 (2014).
- Fischbach, C., Kong, H. J., Hsiong, S. X., Evangelista, M. B., Yuen, W., Mooney, D. J. Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).
- Lao, Z., et al. Improved Methods to Generate Spheroid Cultures from Tumor Cells, Tumor Cells & Fibroblasts or Tumor-Fragments: Microenvironment, Microvesicles and MiRNA. PLoS ONE. 10 (7), e0133895 (2015).
- Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Exp. Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).
- Li, Q., et al. 3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen. J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).
- Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation. J. Biomol. Screen. , (2016).
- Celli, J. P., et al. An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models. Sci. Rep. 17 (4), 3751 (2014).
- Solomon, M. A., Lemera, J., D'Souza, G. G. M. Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics. J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).
- Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).
- Walzl, A., et al. A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity. Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).
- Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays. Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci. Rep. 6, 19103 (2016).
- Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes. Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).
- Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures. Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).
- Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically. J. Vis. Exp. (89), e51639 (2014).
