Summary
La perdita irregolare del mezzo da micropiastre influisce sulla riproducibilità del multicellulare formazione del tumore sferoide uniforme. Il miglioramento delle condizioni di coltura per ridurre la perdita significativa medio migliorare la riproducibilità della formazione sferoide ei risultati dei dosaggi sferoidali a base usando la tecnica liquido-overlay.
Abstract
Modelli tumorali che strettamente imitano le condizioni in vivo stanno diventando sempre più popolare in scoperta di nuovi farmaci e lo sviluppo per lo screening di potenziali farmaci anti-cancro. Sferoidi tumorali multicellulari (MCTSes) imitano in modo efficace le condizioni fisiologiche di tumori solidi, che li rende eccellente in modelli in vitro per l'ottimizzazione di piombo e validazione del target. Tra le varie tecniche disponibili per la cultura MCTS, il metodo liquido-overlay su agarosio è uno dei metodi più economiche per la generazione MCTS. Tuttavia, il trasferimento affidabile di culture MCTS utilizzando liquido-overlay per high-throughput screening può essere compromessa da una serie di limitazioni, tra cui il rivestimento di piastre microtiter (MP) con agarosio e l'irriproducibilità di formazione MCTS uniforme attraverso pozzi. Mp sono significativamente inclini a effetti di bordo che derivano da eccessiva evaporazione del mezzo dall'esterno della piastra, impedendo l'uso della intera piastra per drogatest. Questo manoscritto fornisce miglioramenti tecnici dettagliati alla tecnica liquido-overlay per aumentare la scalabilità e la riproducibilità di formazione uniforme MCTS. Inoltre, dettagli su un semplice, strumento software semi-automatico, e universalmente applicabile per la valutazione delle caratteristiche MCTS dopo trattamento farmacologico è presentato.
Introduction
Le cellule tumorali nei tumori sono fisiologicamente disposti in un complesso di 3-dimensionale struttura, (3D), circondato da matrice extracellulare e le cellule interagiscono. Come quasi tutte le cellule nei tessuti risiedono in un ambiente 3D, la necessità di più fisiologicamente rilevanti in modelli tumorali in vitro che imitano tratti tumorali ha portato allo sviluppo di varie tecniche di coltura 3D 1, 2, 3. Questi modelli stanno diventando strumenti di ricerca fondamentali per studiare il ruolo del microambiente tumorale sulla metastasi e delle cellule risposta alle terapie in 3D 2. Inoltre, rispetto al 2-dimensionali culture (2D) di cella 4, modelli 3D consentono una migliore comprensione delle interazioni tumore-stroma, che interessano vie di segnalazione cellulare.
sferoidi tumorali multicellulari (MCTSes) su linee cellulari tumorali sono spesso utilizzati nella cella 3D cmodelli ULTURA a causa della loro relativa vicinanza ai tumori in vivo. Delle diverse tecniche in uso, la tecnica liquido overlay (LOT) di generazione MCTS su piastre di agarosio rivestite ha raggiunto livelli significativi per l'ottimizzazione di piombo e di destinazione convalida 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Questo è evidente dai recenti studi che sono stati con successo in grado di eseguire schermi pilota di librerie di composti nelle culture MCTS utilizzando Lotto 6, 7. Tuttavia, well-to-bene variabilità MCTS morfologia e la crescita a causa della perdita irregolare di evaporazione indotta di media sono ostacoli comuni che accompagnano la LOT utilizzando micropiastre (MPS). Di conseguenza, la formazione di non uniforme MCTSes compromette la significatività e rilevanzaI dati ottenuti in saggi farmacologici 8, 12, 13. Oltre ai problemi di riproducibilità, un altro problema pratico che colpisce saggi high throughput LOT-base è il rivestimento dei mp con agarosio utilizzando liquido automatica unità di erogazione. Sebbene l'unità di dosaggio può essere mantenuto riscaldato per evitare la gelificazione agarosio, l'intasamento della cassetta erogazione e il tubo è un potenziale preoccupazione per sistemi robotici 6.
Per superare alcune di queste sfide, abbiamo recentemente messo a punto alcune modifiche nella LOT per MCTS cultura 8. Queste modifiche si basano principalmente sui possibili modi per prevenire la perdita media irregolare dai deputati con strumenti che si trovano comunemente nei laboratori high-throughput screening. Una procedura dettagliata della LOT modificato per la generazione di MCTSes uniformemente dimensioni e riproducibili attraverso 3Piastre 84 pozzetti (WP) è presentato qui. Il manoscritto presenta anche una routine semi-automatizzato per la valutazione delle dimensioni MCTS, particolarmente in parzialmente disintegrate, MCTSes trattati con farmaci che non hanno un confine ben definito per la misura della sezione trasversale.
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Protocol
1. Preparazione di piastre rivestite Agarose
- Pesare 0,75 g di basso punto di fusione agarosio e aggiungerlo a 100 ml di mezzo di McCoy 5A (con o senza rosso fenolo) senza siero. Riscaldare la soluzione in un forno a microonde e agitare ogni 1-2 minuti per sciogliere completamente l'agarosio. Autoclave la soluzione per sterilizzarlo.
- Raffreddare la autoclavato agarosio a circa 70 ° C e filtrata attraverso un 500 mL, 0,22 micron filtro superiore per filtrazione sotto vuoto in un contenitore di flusso laminare. Aliquota della soluzione di agarosio filtrata 0,75% (FAS) in volumi più piccoli se non si utilizza l'intera soluzione in una sola volta. Conservare agarosio soluzione asetticamente pronta per l'uso in una stanza fredda o 4 ° C frigorifero per 4 settimane.
- Attaccare un piccolo tubo con una plastica o di cassette erogazione punta metallica per un dispensatore di reagente Combi e adescare la cassetta con il 70% di etanolo (EtOH) e poi con sterile phosphate-buffered saline (PBS) in una scatola di flusso.
- Prima dell'uso, riscaldare un'aliquota memorizzata di FAS i n il forno a microonde per sciogliere esso. Prime la cassetta di erogazione con la soluzione di agarosio e cappotto 384 pozzetti, coltura tissutale (TC) -treated "speciale" micropiastre con 15 ml di FAS. Lasciare che il agarosio nel piatto si raffreddi per 15-20 minuti prima della semina le cellule. Conservare le piastre di agarosio rivestite asettico, avvolto in un sacchetto di polietilene in un ambiente freddo o a 4 ° C e al riparo dalla luce.
NOTA: Evitare il riscaldamento ripetuto del 0,75% FAS per impedire una variazione della concentrazione di agarosio in soluzione madre. piastre di agarosio rivestite possono essere conservati fino a 2 settimane se conservato nelle condizioni sopra citate. Il FAS non richiede riscaldamento durante il rivestimento di lastre. - Pulire la cassetta di erogazione da adescamento con 70-80 ° C acqua sterile per eliminare ogni residuo di agarosio nelle punte cassette e tubi.
2. cellulare Cultura e Formazione MCTS
- cellule HCT116 carcinoma colorettale umano Cultura, come descritto in precedenzalass = "xref"> 8.
- Rimuovere il numero richiesto di agarosio rivestite, 384 pozzetti, TC-trattati micropiastre da celle frigorifere e di equilibrare a temperatura ambiente (RT) per 15 minuti.
- Preparare il dispensatore di reagente Combi per la semina delle cellule per l'innesco di una cassetta tubo di erogazione di serie con il 70% EtOH e PBS sterile. Regolare il volume semina alla richiesta microlitri e la velocità di erogazione di media utilizzando i pulsanti di impostazione manuale sul dispenser.
NOTA: L'intero processo di semina cellulare viene effettuata in condizioni sterili e in una scatola di flusso laminare. - Dissociarsi cellule aderenti dal pallone di coltura di tessuto utilizzando un enzima ricombinante cellule dissociazione. Effettuare una sospensione di cellule in un becher sterile con alveoli ad una densità di 2,5 x 10 4 cellule / ml per pozzetto in 50 ml di terreno di coltura completo. Quando semina più 384 WP, mescolare le cellule con un agitatore magnetico per impedire loro di sedimentazione al fondo del bicchiere.
- Lasciare che ilpiastre di riposare per 30 minuti a RT e quindi si centrifuga per 15 minuti a 4 x g.
- Nel frattempo, fare un coperchio di evaporazione ambientale-riduzione e riempirlo con 8 mL di H 2 O sterile o 5% dimetilsolfossido (DMSO) nei lati corti (sinistra e destra) utilizzando una pipetta da 5 ml (Figura 1A). Innanzitutto, dispensare 4 ml di liquido di riempimento nel trogolo lato sinistro da spazzare la punta della pipetta lentamente su e giù. Ripetere questa operazione con trogolo destra.
NOTA: Assicurarsi che il liquido aggiunto gli abbeveratoi laterali non unisce al centro del coperchio, e lasciare uno spazio per lo scambio di gas (Figura 1A). L'aggiunta di un eccesso di H 2 O provoca infiltrazioni di H 2 O all'esterno del coperchio e successivamente nei pozzetti esterni delle piastre a 384 pozzetti TC. - Riempire il serbatoio del liquido della piastra TC 384 pozzetti con H 2 O sterile e sostituire i coperchi piastra regolari con i coperchi ambientali contenenti liquido (Figura 2A).
- Posizionare le piastre in un incubatore rotativo 37 ° C con il 95% di umidità, 5% di CO 2, e 20% O 2, e permettono alle cellule di aggregano in MCTSes per 4 giorni. Evitare di aprire la porta incubatore per troppo tempo nei giorni successivi al fine di evitare che il livello di umidità dal cadere bruscamente.
3. Scambio medio Utilizzando un sistema robotico
- Il giorno 4 dopo la formazione di MCTS, aggiungere 30 ml di media pre-riscaldato per pozzetto utilizzando un dispensatore di micropiastre di lavaggio automatizzato. Consentire le MCTSes a crescere per altri 3 giorni. Sostituire il medium regolarmente ogni 3 giorni, fino a quando raggiungono le dimensioni desiderate per la sperimentazione.
- Per aspirare un volume definito di media da ogni pozzetto, regolare empiricamente z -altezza del collettore rondella. Aspirare 30 ml di media per pozzetto e sostituirlo con 30 ml di fresco, di media pre-riscaldato.
NOTA: impostare la velocità di erogazione e la velocità con cui il collettore di washer viaggia lungonei pozzi al tasso più basso per ridurre al minimo la turbolenza nei pozzetti.
4. Alto-contenuti Imaging di MCTS e semi-automatico Image Analysis
- Immagine del MCTS in un sistema di imaging automatizzato ad alta contenuto utilizzando un obiettivo aereo 4X (NA 16).
- Impostare il tempo di esposizione di 11 ms e il binning di 4 x 4. Regolare il numero e la spaziatura delle z -Pile e il binning dei pixel come desiderato per l'esperimento di catturare un intero MCTS per pozzetto.
- Elaborare le immagini graduale, come descritto nel "readme", impiegando la procedura in casa scritto in linguaggio di programmazione.
NOTA: Il codice .m e readme .txt file sono disponibili come file di codice supplementari (Figura 1B). Le misure di routine l'area MCTS, assi maggiori e minori, il perimetro e solidità dalle immagini 2D.
Figura 1:Preparazione dei coperchi ambientali e un diagramma di flusso della routine semiautomatico. (A) Immagine di un coperchio ambientale evaporazione riduzione riempito con il corretto (a sinistra) e l'eccesso (a destra) quantità di liquido di riempimento (qui, 5% DMSO). La freccia indica trogolo lato corto per l'aggiunta di liquido. L'asterisco indica il vuoto nel mezzo del coperchio dopo l'aggiunta del corretto volume di DMSO. (B) Un flusso di lavoro che mostra i passaggi necessari per l'analisi delle immagini di routine semi-automatizzato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Representative Results
La perdita irregolare di media, in particolare dai pozzi periferici, è un problema frequente nella parlamentari con piccoli volumi di coltura. Sostanzialmente migliorate condizioni di coltura, come le incubatrici con / sistemi ben controllati temperatura di umidificazione e parlamentari evaporazione di riduzione e coperchi piastra, riducono la perdita significativa di media attraverso pozzi 8. Per misurare la relativa evaporazione, sono stati aggiunti volumi uguali di Orange G (OG) per ciascun bene, e il cambiamento di OG assorbanza nell'arco di 3 giorni è stato registrato in piastre con i coperchi regolari e ambientali in incubatori standard e rotanti. Pozzetti della piastra sono stati divisi in 6 gruppi in base alla loro distanza dal bordo della piastra (Figura 2A). Nei gruppi 1-4, c'è stato un significativo cambiamento nella assorbanza OG nel tempo in piastre con coperchi regolari in un incubatore standard (Figura 2B). Anche se ci fosse anche una variazione di assorbanza OG dagruppo 1 pozzetti delle piastre sotto il coperchio / rotante combinazione incubatore ambientale (Figura 2C), i coefficienti di variazione (CV) erano molto inferiori rispetto a quelli delle piastre con coperchi regolari in un incubatore standard (Figura 2D).
La perdita irregolare di evaporazione indotta di mezzo è una delle possibili cause di variabilità well-to-well dimensioni MCTS e dosaggio lettura in mp 8. Tuttavia, piastre TC 384 pozzetti con l'associazione ambientale coperchio / rotante incubatore portato alla formazione di MCTSes uniforme di tutti i gruppi di 6 pozzetti (figura 2E). Al contrario, MCTSes piastre con le regolari combinazione incubatore coperchio / di serie variano in modo significativo in termini di dimensioni e solidità (Figura 3F). Solidità è una misura di MCTS sfericità e dà il grado di disintegrazione della MCT. La solidità di una regione 2D è la proporzione dei pixel nella convex scafo della regione di interesse (ROI) ed è determinato dividendo l'area della ROI per l'area della convesso della ROI. Entrambe le regioni circolari ed ellittiche hanno una solidità di 1, e come disintegra il MCTS, la solidità diminuisce. La differenza di superficie è già stata riportata in Das et al. (2016) 8. Il volume è stato calcolato dai maggiori e minori assi delle MCTSes.
Figura 2: Piastre con il minimo risultato dell'evaporazione in un aumento della riproducibilità MCTS. (A) Una mappa lastra viene presentato per mostrare la divisione dei pozzi in 6 gruppi. (B e C) C'è una variazione dipendente dal tempo significativo nella relativa assorbanza OG da pozzi in gruppi 1-4 in piastre coltivate in un incubatore standard coperchi regolari (B) e dal gruppo 1 abbiamoriempie in piastre con coperchi ambientali in un incubatore rotante (C). Assorbanza Giorno 3-5 OG sono normalizzati in giorno 0. (D) calcolato CV di OG assorbanza del gruppo 1 pozzi di giorni 3-5 sono indicati per le combinazioni del coperchio / incubatore due piastre. CV sono medie di 3 esperimenti indipendenti. (E) MCTSes formate in lastre con la combinazione coperchio / incubatore rotante ambientale non differivano significativamente tra i 6 gruppi di pozzi. (B) Tuttavia, piatti con coperchi regolari in un incubatore standard di formati MCTSes di dimensioni variabili. I dati sono mostrati per n> 60 MCTSes per gruppo. Le scatole e barre orizzontali all'interno delle scatole dei grafici a scatole rappresentano i 25 ° e 75 ° percentile e mediana, rispettivamente. I baffi rappresentano il 5 ° e il 95 ° percentile, ed i valori anomali sono indicati con i punti neri allineate nei grafici a scatole. Il P-valori delle analisi di Kruskal-Wallis sono presentati di seguito each boxplot. I dati provengono da almeno 3 esperimenti indipendenti per piastra combinazione coperchio / incubatore. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Per determinare il potenziale applicabilità della routine, 7 giorni vecchi MCTSes sono stati trattati con paclitaxel (PTX), vincristina (VCR), oxaliplatino (OXA), doxorubicina (DOX), e 5-flurouracil (5-FU) a 3 diverse concentrazioni per 4 giorni. I farmaci sono stati ottenuti dal University Hospital di Olomouc, Palacky University. Le immagini MCTS sono stati poi analizzati, e la zona, assi maggiore e minore, perimetro e solidità MCTSes trattati sono stati confrontati con controlli (CTL). Gli assi maggiore e minore sono stati usati per calcolare il volume geometrico. C'è stata una diminuzione di concentrazione-dipendente della zona MCTS e volume dopo trattamento farmacologico (Figura 3). Sebbene 0,001 mg / mL VCR e 0,4 mg / ml DOX e 5-FU ha determinato aumento della superficie MCTS, il volume è stato significativamente aumentato solo seguendo 0,001 mg / ml videoregistratore. MCTS perimetro era significativamente differente solo alle più alte concentrazioni di PTX, DOX, e 5-FU, che ha completamente colpito la dimensione MCTS. PTX e VCR a 0.25 mg / ml e 0,06 mg / ml e DOX e 5-FU in 100 ug / mL portato ad una diminuzione significativa nella solidità, indicando una disgregazione completa a parziale dei MCTSes (Figura 3).
Figura 3: Misura degli effetti della droga in MCTSes dalla routine semi-automatizzato. (A) Immagini di CTL e MCTSes trattati con farmaci vengono presentati. Barra di scala = 10 micron. Le concentrazioni in mg / ml sono dati per ogni immagine. (B) I grafici a barre mostrano un effetto dose-dipendente del PTX, videoregistratore, OXA, DOX, e 5-FU sularea e volume di 7 MCTSes un giorno dopo 4 giorni di trattamento. perimetri MCTS sono stati significativamente ridotti seguendo 0,25 mg / ml PTX e 100 mg / ml DOX e 5-FU. concentrazioni del farmaco che hanno portato alla completa disintegrazione-to-parziale di MCTSes significativamente ridotti MCTS solidità rispetto al CTL. I dati sono la media ± SD di almeno 5 MCTSes da 3 piastre indipendenti. * p <0,001, # p <0.01, φ p <0.05 trattati con farmaci contro CTL, una via ANOVA con test di confronto multiplo di Dunnett. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Rivestimento 384 pozzetti TC con filtrata Agarosio
La pratica standard in LOT è utilizzare un punto agarosio bassofondente 1-1,5% per rivestire le piastre, che richiede l'agarosio e / o unità di dosaggio da tenere riscaldata per impedire la gelificazione del agarosio 6. La gelificazione agarosio è potenzialmente preoccupanti durante la preparazione di piastre multiple utilizzando cassette dosaggio liquidi con piccole aperture tubi compresi tra 0,2 e 0,4 mm di diametro. Per superare il problema potenziale di intasamento cassette di erogazione, 0,75% FAS stato utilizzato, in quanto non richiede ulteriore riscaldamento durante l'erogazione. Per inciso, è stato anche osservato che un 0,75% FAS non gel più rapidamente filtrato 1-1,5%, o anche 0,75%, soluzione di agarosio. Utilizzando 0,75% FAS, ci vogliono meno di 35 s per rivestire un intero piatto di TC-384 e senza intasare la cassetta di erogazione. La cassetta può essere pulito alla fine per adescamento con acqua riscaldata per rimuovere residui di ungarose, che potrebbero intasare i suggerimenti quando la cassetta non è in uso.
Coperchio ambientale e Incubatore Rotary oltre Coperchio Piastra regolare e Incubatore
La perdita irregolare di evaporazione indotta di media influisce significativamente la riproducibilità della formazione uniforme MCTS e compromette pertanto il risultato dei test 14. Sorprendentemente, gruppo 1 pozzetti di piastre TC 384 pozzetti sotto la combinazione coperchio / incubatore rotativo ambientale hanno mostrato una variazione statisticamente significativa a OG assorbanza (Figura 2C). Tuttavia, un basso CV di OG assorbanza nel gruppo 1 pozzi indica che l'evaporazione nei pozzetti esterni delle piastre da 384 pozzetti TC nell'incubatrice rotante con coperchi ambientali non è così eccessiva da influenzare la crescita MCTS (Figura 2D). Questo è evidente dai MCTSes dimensioni in modo uniforme formate nel gruppo 1 pozzi in lastre con la combinazione ambientale coperchio / rotativo incubatore. Inoltre, ha ridotto la perditadi media impedisce variabilità well-to-bene nel test di droga da lastre TC 384 pozzetti coltura nell'incubatrice rotante con coperchi ambientali 8.
La metodologia presentata inoltre provoca la formazione di MCTSes uniformi di qualche altro cancro e linee di cellule non cancerose 8. Tuttavia, dal momento che tutte le cellule non possono intrinsecamente aggregarsi in MCTSes su una superficie non aderente, questo metodo molti non essere adatto per altre linee cellulari che non sono stati testati per la riproducibilità della formazione uniforme MCTS. Inoltre, l'attenzione si è concentrata principalmente sull'uso di un incubatore tecnologia avanzata in combinazione con mp evaporazione-riduzione e coperchi piastra per aumentare la riproducibilità della formazione MCTS. Un'altra soluzione economica e facile da aumentare la riproducibilità della formazione MCTS potrebbe essere l'uso di olio embrio-grade minerale e traspirante nastri o membrane, che impediscono l'evaporazione ma sigillatura lasciare scambio di gas normale 15. Anche se agarosio aggiunge spessore supplementare al piatto fondo, che può essere una barriera per alto contenuto di immagini, la profondità di campo creato da un fondo di agarosio nell'imaging luce trasmessa non ostacola l'accertamento di dimensioni MCTS e la forma dopo il trattamento farmacologico. Pertanto, il metodo presentato sarà di potenziale interesse per i ricercatori che affrontano problemi di riproducibilità nel molta cultura MCTS.
Immagine semi-automatico di analisi di routine
Sebbene vi siano molti semi-automatizzato / software disponibile per MCTS analisi automatizzata, la misurazione delle dimensioni di completo-to-parzialmente MCTSes disintegrate dopo trattamento farmacologico è soggetto a errori 16, 17. Nella prima fase della routine presentata, la migliore immagine focalizzata viene automaticamente selezionata dal set di immagini impili z calcolando la norma del gradiente dell'immagine e selezionando quella con la più 0,999 quaNTILE. Questa è una misura robusto e rumore insensibile del massimo.
Successivamente, i bordi scuri sono tagliate e le immagini elaborate vengono memorizzate alla risoluzione originale in formato Portable Network Graphics. Questo processo riduce la dimensione totale di 2,5 GB, dall'imaging un intero 384 pozzetti, piatto TC-trattati, a circa 100 MB. Successivamente, il centro del MCTS è trovato attraverso una convoluzione con un filtro circolare di raggio definito dall'utente (usiamo 20 pixel; Figura 4A). Un minimo locale chiara dell'immagine filtrata fornisce la posizione del centro (Figura 4A). Passando da questo centro di corone circolari concentriche, il valore di grigio medio, M, in ogni guscio è calcolato in funzione del raggio shell, R. Successivamente, la prima (sostanziale) massimo della derivata numerica della funzione M (R) è trovato (Figura 4B). Il punto M OPT di questa massima è pari alla soglia ottimale, e l'immagine è segmented dalla soglia a questo livello.
Il MCTS è identificato come il segmento centrale dell'immagine. Questa procedura di solito funziona meglio rispetto alla tecnica thresholding standard in quanto è in grado di separare il nucleo MCTS dalle parti disintegrazione che spesso risultano dal trattamento farmacologico (Figura 4C e 4D). Inoltre, l'approccio adottato qui fa uso implicito della sfericità della MCT. Semplici routine thresholding, o algoritmi basati sui contorni attivi, non sfruttano la conoscenza a priori che un oggetto sferico si trova. Quando il MCTS è chiaramente individuato e delineato, il massimo M OPT è chiara e semplice. La routine misura quindi le caratteristiche del MCTS, come ad esempio l'area, gli assi maggiore e minore, il perimetro e la solidità dell'ellisse attrezzata, e salva l'anteprima dell'immagine segmentata. Se il massimo non è chiara, e / o se più massimi locali sono presenti, un prevista la segmentazione suggerito viene salvata in una cartella di correzione.
Nel penultimo passo, la routine guida l'utente attraverso la cartella di correzione per regolare manualmente la segmentazione suggerito spostando la soglia alto o in basso e selezionando una regione poligonale di interesse per tagliare eventuali parti ridondanti della maschera. Dopo questa correzione manuale, le misure di routine e memorizza le caratteristiche MCTS, come descritto sopra.
Figura 4: Illustrazione della procedura di segmentazione delle immagini. (A) Il centro del MCTS è contrassegnato con un asterisco verde. Un esempio di corona circolare è disegnato in rosso. (B) Il valore di grigio mediano ogni guscio è tracciata in funzione del raggio shell (linea blu). La derivata numerica di questa curva viene calcolata (linea rossa). Il primo ma sostanzialeximum della derivata numerica viene trovato (asterisco nero). (C) La conseguente corretta segmentazione dell'immagine nel nucleo MCTS e lo sfondo con le parti MCTS disintegrazione. (D) la segmentazione errato ottenuto con il metodo di Otsu. obiettivo 4X; Barra di scala = 500 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal ministero ceco dell'Istruzione, della gioventù e dello sport (LO1304) e l'Agenzia Tecnologica della Repubblica Ceca (TE01020028). Gli autori desiderano ringraziare il Dott Lakshman Varanasi per scattare le immagini fisse di coperchi ambientali.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Low-melting |
| McCOY's 5A Medium | Sigma-Aldrich | M8403 | |
| “rapid” Filtermax filter | TPP | 99505 | 0.22 μm, 500 mL |
| Multidrop™ Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | |
| Small Tube Dispensing cassette | Thermo Fisher Scientific | 24073295 | Metal tip |
| 384-well TC plate | PerkinElmer | 6057308 | Plate type- CellCarrier |
| Standard Tube Dispensing Cassette | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | |
| MicroClime Environmental Lid | Labcyte | LLS-0310 | |
| DMSO | Sigma | D4540 | |
| Rotary Incubator (SteriStore ) | HighRes Biosolutions | 23641 | Serial No.: D00384 |
| Microplate Washer Dispenser | BioTek | Unspecified | Model: EL406 |
| High-Content Imaging System (CellVoyager ) | Yokogawa Electric Corporation | Unspecified | Model: CV7000 |
| Orange G | New England Biolabs | B7022S | |
| TrypLE™ Express recombinant cell dissociation reagent | Thermo Fisher Scientific | 12604021 | Phenol red free |
References
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
- Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening. Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. , 69-70 (2014).
- Fischbach, C., Kong, H. J., Hsiong, S. X., Evangelista, M. B., Yuen, W., Mooney, D. J. Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).
- Lao, Z., et al. Improved Methods to Generate Spheroid Cultures from Tumor Cells, Tumor Cells & Fibroblasts or Tumor-Fragments: Microenvironment, Microvesicles and MiRNA. PLoS ONE. 10 (7), e0133895 (2015).
- Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Exp. Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).
- Li, Q., et al. 3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen. J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).
- Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation. J. Biomol. Screen. , (2016).
- Celli, J. P., et al. An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models. Sci. Rep. 17 (4), 3751 (2014).
- Solomon, M. A., Lemera, J., D'Souza, G. G. M. Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics. J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).
- Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).
- Walzl, A., et al. A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity. Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).
- Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays. Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci. Rep. 6, 19103 (2016).
- Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes. Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).
- Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures. Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).
- Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically. J. Vis. Exp. (89), e51639 (2014).
