Summary
Den ojämna förlust av medium från mikrotiterplattor påverkar reproducerbarhet enhetlig flercelliga tumör sfäroid formation. Förbättra odlingsbetingelser för att reducera betydande medelförlust kommer att förbättra reproducerbarheten för sfäroid bildning och resultaten av sfäroida-baserade analyser som använder den vätske overlay teknik.
Abstract
Tumörmodeller som nära imiterar in vivo förhållanden blir allt populärare i läkemedelsforskning och utveckling för screening av potentiella läkemedel mot cancer. Flercelliga tumör sfäroider (MCTSes) effektivt efterlikna fysiologiska förhållanden av solida tumörer, vilket gör dem utmärkt in vitro-modeller för optimering och validering mål. Av de olika tekniker som är tillgängliga för MCTS kultur, är det vätske overlay metod på agaros en av de billigaste metoderna för MCTS generation. Emellertid kan tillförlitlig överföring av MCTS kulturer använder flytande-overlay för high-throughput screening äventyras av ett antal begränsningar, inkluderande beläggningen av mikrotiterplattor (MPs) med agaros och reproducerbarhet enhetlig MCTS bildning över brunnar. MPs är betydligt benägna till kant effekter som resulterar från överdriven avdunstning av medium från utsidan av plattan, vilket förhindrar användningen av hela plattan för drogtester. Detta manuskript ger detaljerade tekniska förbättringar av vätske overlay teknik för att öka skalbarheten och reproducerbarhet enhetlig MCTS bildning. Dessutom, information om en enkel, halvautomatisk och allmängiltiga verktyg för utvärdering av MCTS har efter läkemedelsbehandling presenteras.
Introduction
Cancerceller i tumörer är fysiologiskt anordnade i en komplex, 3-dimensionell (3D) struktur omgiven av extracellulär matrix och interagerande celler. Som nästan alla celler i vävnader bor i en 3D-miljö, har behovet av mer fysiologiskt relevant in vitro tumörmodeller som efterliknar tumör egenskaper resulterat i utvecklingen av ett flertal 3D odlingstekniker 1, 2, 3. Dessa modeller blir nu fundamentala forskningsverktyg för att studera rollen av tumören mikro på metastas och cellsvar på läkemedel i 3D 2. Dessutom, jämfört med 2-dimensionella (2D) cellkulturer 4, 3D-modeller möjliggöra en bättre förståelse av tumör stroma interaktioner som påverkar cellsignalvägar.
Flercelliga tumör sfäroider (MCTSes) av cancercellinjer används ofta i 3D cell culture modeller på grund av deras relativa närhet till in vivo-tumörer. Av de flera tekniker som används, har vätske overlay teknik (LOT) av MCTS generation på agaros-belagda plattor vunnit stort intresse för optimering och mål validering 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Detta framgår tydligt av de nya studier som var framgångsrikt kunna köra pilot skärmar av föreningsbibliotek i MCTS kulturerna med LOT 6, 7. Men väl till brunnar variationen i MCTS morfologi och tillväxt på grund av avdunstning-inducerad ojämn förlust av mediet är vanliga hinder som följer LOT använder mikrotiterplattor (MPS). Följaktligen, bildandet av icke-likformig MCTSes komprometterar betydelse och relevansav data från farmakologiska analyser 8, 12, 13. Förutom de reproducerbara frågor, ett annat praktiskt problem som påverkar LOT-baserade high-throughput assays är beläggningen av de MPs med agaros vid användning av automatiska vätskedispensering enheter. Även om utmatningsenheten kan hållas uppvärmd för att förhindra gelning av agaros, är igensättning av dispenseringskassetten och slangar en potentiell bekymmer för robotsystem 6.
För att övervinna några av dessa utmaningar, har vi nyligen tagit fram några ändringar i partiet för MCTS kultur 8. Dessa ändringar är huvudsakligen baserade på olika sätt för att förhindra ojämn medelförlust från MPs som använder instrument som är vanligt förekommande i high-throughput screening laboratorier. En detaljerad procedur för den modifierade LOT för genereringen av enhetlig storlek och reproducerbara MCTSes tvärs 384-brunnars plattor (WPS) presenteras här. Manuskriptet presenterar också en halvautomatiserad rutin för utvärdering av MCTS storlek, särskilt i partiellt sönderdelade, läkemedelsbehandlade MCTSes som inte har en klart definierad gräns för mätning av tvärsnittsarean.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av agaros-belagda plattor
- Väg 0,75 g låg smältpunkt agaros och lägga till 100 ml McCoys 5A medium (med eller utan fenolrött) utan serum. Värm lösningen i en mikrovågsugn och virvla varje 1-2 min för att fullständigt lösa agarosen. Autoklavera lösningen för att sterilisera den.
- Kyl den autoklaveras agaros till ca 70 ° C och filtrera den genom en 500 ml, 0,22 ^ m filtertopp genom vakuumfiltrering i ett laminärt flöde låda. Alikvotera 0,75% filtrerade agaroslösningen (FAS) i mindre volymer om du inte använder hela lösningen på en gång. Lagra denna redo att använda agaroslösningen aseptiskt i ett kallt rum eller 4 ° C kylskåp i upp till fyra veckor.
- Fäst en liten tub med en plast- eller metallspets dispense kassett till en Combi reagens dispenser och prime kassetten med 70% etanol (EtOH) och sedan med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i en inloppslåda.
- Före användning, värma en lagrad alikvot av FAS i n mikrovågsugn för att smälta det. Prime doserings kassett med agaroslösningen och päls 384 brunnar, vävnadsodling (TC) -behandlade "special" mikro med 15 mikroliter av FAS. Tillåta agarosen i plattan svalna under 15-20 min innan sådd av cellerna. Förvara agarosen belagda plattor aseptiskt, insvept i en polyetenpåse i ett kallt rum eller vid 4 ° C och bort från direkt ljus.
OBS: Undvik upprepad uppvärmning av 0,75% FAS för att förhindra en förändring i koncentrationen av agaros i förrådslösningen. Agaros-belagda plattor kan förvaras i upp till 2 veckor vid förvaring under ovan nämnda betingelser. FAS kräver inte uppvärmning under beläggningen av plattorna. - Rengöra dispenser kassetten genom att prima den med 70-80 ° C sterilt vatten för att avlägsna eventuellt kvarvarande agaros i kassett tips och tuber.
2. Cell Culture och MCTS Formation
- Kultur humana kolorektal cancer HCT116 celler, såsom beskrivits tidigarelass = "xref"> 8.
- Ta bort erforderligt antal agaros belagda, 384 brunnar, TC-behandlade mikro från kylförvaring och jämvikt dem till rumstemperatur (RT) under 15 minuter.
- Förbered Combi reagensbehållare för cellsådd genom priming en vanlig slang dispense kassett med 70% EtOH och steril PBS. Justera sådd volymen till önskad mikroliter och dispenseringshastigheten till medium med hjälp av manuella inställningsknapparna på automaten.
OBS: Hela cellsådd process utförs under sterila betingelser och i ett laminärt flöde låda. - Dissociera vidhäftande celler från vävnadsodlingskolv med användning av en rekombinant cell-dissociation enzym. Göra en cellsuspension lager i en steril bägare med utsädes celler vid en densitet av 2,5 x 10 4 celler / ml per brunn i 50 mikroliter av komplett tillväxtmedium. När sådd mer än en 384-WP, rör cellerna med användning av en magnetisk omrörare för att hindra dem från att sedimentera till botten av bägaren.
- tillåtaplattor för att vila under 30 min vid RT och centrifugera sedan i 15 min vid 4 x g.
- Samtidigt, ta en förångning-minska miljö locket och fyll den med 8 ml sterilt H2O eller 5% dimetylsulfoxid (DMSO) i kortsidorna (vänster och höger) med en 5 ml pipett (Figur 1A). Först, dispensera 4 ml av fyllningsvätska in i vänstra tråget genom svepning av pipettspetsen långsamt upp och ner. Upprepa detta steg med den högra tråg.
OBS: Se till att vätskan läggs till sido trågen inte samman i mitten av locket, och lämna en lucka för gasutbyte (Figur 1A). Tillsats av en överskottsmängd av H 2 O resulterar i läckage av H2O till utsidan av locket och därefter in i de yttre brunnarna i 384-brunnars TC-plattor. - Fyll vätskereservoaren i 384-brunnars TC platta med sterilt H2O och ersätta de vanliga platt lock med de vätskefyllda miljö lock (Figur 2A).
- Placera plattorna i en 37 ° C roterande inkubator med 95% fuktighet, 5% CO2, och 20% O2, och tillåta cellerna att aggregera i MCTSes i 4 dagar. Undvik att öppna inkubatordörren för länge i de efterföljande dagar för att förhindra luftfuktigheten från att falla abrupt.
3. Medium Exchange med ett robotsystem
- På dag 4 efter MCTS bildning, tillsätt 30 mikroliter av förvärmda medium per brunn med en automatiserad mikro bricka dispenser. Tillåta MCTSes växa under ytterligare 3 dagar. Byt mediet regelbundet varje 3 dagar, tills de uppnår önskad storlek för experiment.
- Att aspirera en definierad volym av mediet från varje brunn, empiriskt justera z -Höjd brickans grenröret. Aspirera 30 mikroliter medium per brunn och ersätta den med 30 mikroliter av färska, förvärmda medium.
OBS: Ställ in doseringshastigheten och den hastighet med vilken brickan grenröret färdas neri brunnar på den lägsta nivån för att minimera turbulens i brunnarna.
4. Hög halt avbildning av MCTS och halvautomatiska bildanalys
- Bild MCTS i en hög halt automatiserat avbildningssystem med hjälp av en 4X luft mål (NA 16).
- Ställa in exponeringstiden till 11 ms och binning till 4 x 4. Justera Antalet och avståndet mellan z--stacks och pixel binning såsom önskas för experimentet för att fånga ett helt MCTS per brunn.
- Bearbeta bilderna stegvis, som beskrivs i "readme," med hjälp av en intern rutin skrivna i programmeringsspråket.
OBS! .m Kod och .txt readme filer finns som kompletterande kodfiler (Figur 1B). Rutinen mäter MCTS området, större och mindre axlar, omkrets, och hållfasthet från 2D-bilder.
Figur 1:Framställning av miljö lock och ett flödesschema över den halvautomatiska rutin. (A) Bilden av en förångning-minska miljö lock fylld med rätt (vänster) och överskott (höger) mängd för att fylla vätska (här, 5% DMSO). Pilen indikerar kortside tråg för att lägga till vätska. Asterisken visar den lucka i mitten av locket efter tillsatsen av den korrekta volymen av DMSO. (B) Ett arbetsflöde som visar de olika stegen i halvautomatiska bildanalys rutin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den ojämna förlust av medium, i synnerhet från perifera brunnar, är en ofta stött på problem i MPs med små odlingsvolymer. Avsevärt förbättrade odlingsbetingelser, såsom inkubatorer med väl kontrollerad temperatur / befuktningssystem och indunstning minskande parlamentsledamöter och platt lock, minska betydande förlust av medel över brunnar 8. För att mäta den relativa avdunstning, var lika stora volymer av Orange G (OG) till varje brunn, och förändringen i OG absorbans under 3 dagar spelades in i plattor med regelbundna och miljö lock i standard och roterande inkubatorer. Plattbrunnar var uppdelade i 6 grupper baserat på deras avstånd från kanten av plattan (Figur 2A). I grupper 1-4, fanns det en betydande förändring i absorbans OG över tiden i plattor med regelbundna lock i en standardinkubator (Figur 2B). Även om det fanns också en variation i OG absorbans frångrupp 1 brunnar i plattor enligt miljö lock / roterande inkubator kombination (Figur 2C), variationskoefficienterna (CV) var mycket lägre jämfört med de plattorna med regelbundna lock i en standardinkubator (figur 2D).
Avdunstningen-inducerade ojämn förlust medium är en av de potentiella orsakerna till väl till brunnar variationen i MCTS storlek och analys avläsning i MPs 8. Men 384 brunnar TC plattor med miljö lock / roterande inkubator kombinationen resulterade i bildandet av enhetliga MCTSes över 6 grupper av brunnar (Figur 2E). Däremot MCTSes i form av plattor med den vanliga lock / standard inkubator kombination varierar kraftigt i storlek och fasthet (Figur 3F). Soliditet är ett mått på MCTS sfärisk som ger graden av sönderfall av MCTS. Soliditeten hos en 2D regionen är den del av de bildpunkter i convex skrovet av regionen av intresse (ROI) och bestäms genom att dividera arean av ROI genom att området för den konvexa höljet av ROI. Både runda och elliptiska regioner har en soliditet på 1, och som MCTS sönderfaller, minskar soliditeten. Skillnaden i området har redan rapporterats i Das et al. (2016) 8. Volymen beräknades från de större och mindre axlarna hos de MCTSes.
Figur 2: Plattor med minimal avdunstning resulterar i ökad MCTS reproducerbarhet. (A) En platta karta presenteras för att visa uppdelningen av brunnar i 6 grupper. (B och C) Det finns en betydande tidsberoende variation i relativ absorbans på OG från brunnar i grupper 1-4 i form av plattor odlade i en standardinkubator med regelbundna lock (B) och från grupp 1 vills i plattor med miljö lock i en roterande inkubator (C). Dag 3-5 OG absorbanser normaliseras till dag 0. (D) var i genomsnitt meritförteckningar för OG absorbans grupp 1 brunnar från dagar 3-5 visas för de två platt lock / inkubator kombinationer. CV är medelvärden av 3 oberoende experiment. (E) MCTSes bildade i plattor med miljö lock / roterande inkubator kombination skilde sig inte signifikant mellan de 6 grupper av brunnar. (B) Men plattor med regelbundna lock i en standardinkubator bildas MCTSes av varierande storlek. Data visas för n> 60 MCTSes per grupp. Lådorna och horisontella barer inom rutorna i boxplots representerar de 25: e och 75: e percentilen och medianen, respektive. Hårkristallerna representerar de 5: e och 95: e percentilen, och de extremvärden anges med de i linje liggande svarta prickar i de boxplots. P-värdena av Kruskal-Wallis-analys presenteras nedan each boxplot. Uppgifterna är från åtminstone 3 oberoende experiment per platta lock / inkubator kombination. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att bestämma den potentiella tillämpningen av rutinen, var 7 dagar gamla MCTSes behandlas med paklitaxel (PTX), vinkristin (VCR), oxaliplatin (OXA), doxorubicin (DOX), och 5-fluorouracil (5-FU) på 3 olika koncentrationer i 4 dagar. Läkemedlen erhölls från Universitetssjukhuset Olomouc, Palacky University. MCTS bilderna analyserades sedan, och området, större och mindre axlar, omkrets, och soliditet behandlade MCTSes jämfördes med kontroller (CTL). De större och mindre axlar användes för att beräkna den geometriska volymen. Det fanns en koncentrationsberoende minskning av MCTS area och volym efter läkemedelsbehandling (Figur 3). Även 0,001 mikrogram / ml VCR och 0,4 mikrogram / ml DOX och 5-FU resulterade i ökning av MCTS område, volymen ökades signifikant endast efter 0,001 mikrogram / ml videobandspelare. MCTS omkretsen var signifikant endast vid de högsta koncentrationerna av PTX, DOX, och 5-FU, som helt påverkat MCTS storlek. PTX och VCR på 0,25 mikrogram / ml och 0,06 | ig / ml och DOX och 5-FU vid 100 | ig / ml resulterade i en signifikant minskning av soliditeten, vilket tyder på en fullständig-till-partiell sönderdelning av MCTSes (Figur 3).
Figur 3: Mått på läkemedelseffekter i MCTSes by the halvautomatiserad rutin. (A) Bilder av CTL och läkemedelsbehandlade MCTSes presenteras. Skalstreck = 10 | im. Koncentrationer i | ig / ml ges för varje bild. (B) De stapeldiagram visar en dosberoende effekt av PTX, video, OXA, DOX, och 5-FU påarea och volym av 7 dagar gamla MCTSes efter 4 dagars behandling. MCTS perimetrar reducerades signifikant efter 0,25 mikrogram / ml PTX och 100 mikrogram / ml DOX och 5-FU. Läkemedelskoncentrationer som resulterade i en fullständig till partiell sönderdelning av MCTSes signifikant minskade MCTS soliditet jämfört med CTL. Data är medelvärden ± standardavvikelse för minst 5 MCTSes från 3 oberoende plattor. * p <0,001, # p <0,01, φ p <0,05 läkemedelsbehandlade kontra CTL, en-vägs ANOVA med Dunnetts multipla jämförelsetest. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beläggning 384-Well TC plattor med filtrerad Agarose
Sedvanligt i LOT är att använda en 1-1,5% låg smältpunkt agaros att belägga plattorna, vilket kräver agarosen och / eller dispense enheten hållas uppvärmd för att förhindra gelning av agarosen 6. Gelning av agarosen är av potentiell oro samtidigt förbereda flera plattor med hjälp av flytande doserings kassetter med små slangöppningar som sträcker sig mellan 0,2 och 0,4 mm i diameter. För att övervinna potentiella problemet med igensättning fördelnings kassetter, var 0,75% FAS används, eftersom det kräver ingen extra uppvärmning under dispensering. För övrigt var det också observeras att en 0,75% FAS inte gelar så snabbt som ofiltrerad 1-1,5%, eller till och med 0,75%, agaros lösning. Använda 0,75% FAS, tar det mindre än 35 s för att belägga en hel 384 brunnar TC platta utan att täppa dispenseringskassetten. Kassetten kan rengöras i slutet genom att prima den med uppvärmt vatten för att avlägsna rest engarose, som skulle kunna täppa spetsarna när kassetten inte används.
Miljö Lock och Rotary Incubator över Regelbunden Plate Lock och Incubator
Avdunstningen-inducerade ojämn förlust av mediet påverkar avsevärt reproducerbarheten enhetlig MCTS bildning och därmed äventyrar resultatet av analyserna 14. Överraskande, grupp 1 brunnar i 384-brunns TC plattor enligt miljö lock / roterande inkubator kombinationen visade en statistiskt signifikant variation i OG absorbans (figur 2C). Men en låg CV OG absorbans i grupp 1 brunnar indikerar att avdunstningen i de yttre brunnarna i 384 brunnar TC plattor i roterande inkubator med miljö lock är inte så överdrivet att påverka MCTS tillväxt (figur 2D). Detta framgår av de jämnstora MCTSes bildas i grupp 1 brunnar på plattor med miljö lock / roterande inkubator kombination. Också, minskad förlustmedium hindrar väl till brunnar variationen i läkemedelsanalyser från 384 brunnar TC plattor odlade i roterande inkubator med miljö lock 8.
Den presenterade metoden resulterar också i bildning av enhetliga MCTSes av några andra cancer och icke-cancerösa cellinjer 8. Men eftersom alla celler inte i sig kan aggregera i MCTSes på en icke vidhäftande yta, denna metod många inte vara lämpliga för andra cellinjer som inte testades för reproducerbarheten för enhetlig MCTS bildning. Dessutom låg fokus främst på användningen av en avancerad teknik inkubator i kombination med avdunstning minskande parlamentsledamöter och plåtlock för att öka reproducerbarhet MCTS bildning. En annan billig och enkel lösning för att öka reproducerbarhet MCTS bildning kan vara användningen av embryo-grade mineralolja och andas tätningsband eller membran, som förhindrar avdunstning men tillåta normal gasutbyte en5. Även agaros ger extra tjocklek till tallriken bottnar, som kan vara ett hinder för hög halt bildbehandling, inte skärpedjupet som skapats av en agaros botten i genomlysning imaging inte hindra ställandet av MCTS storlek och form efter läkemedelsbehandling. Därför kommer den presenterade metoden vara av potentiellt intresse för forskare inför reproducerbarhet frågor i partiet av MCTS kultur.
Halvautomatisk bildanalys Rutin
Även om det finns många halvautomatiska / automatisk programvara för MCTS bildanalys, är mätning av storleken av total till delvis sönderdelade MCTSes efter läkemedelsbehandling benägna att fel 16, 17. I det första steget av det presenterade rutinen är den bäst fokuserade bilden automatiskt från uppsättningen z -stack bilder genom att beräkna normen för gradienten av bilden och väljer ett med den största 0,999 quantile. Detta är en robust och brusokänsliga mått på den maximala.
Därefter mörkare gränser beskäras och de bearbetade bilderna lagras på den ursprungliga upplösningen i Portable Network Graphics format. Denna process minskar den totala storleken från 2,5 GB, från avbildning hela 384 brunnar, TC-behandlad platta, till cirka 100 MB. Därefter mitten av MCTS hittas genom ett varv med en cirkulär filter av användardefinierad radie (vi använder 20 pixlar, Figur 4A). En tydlig lokalt minimum av den filtrerade bilden anges positionen för centrum (Figur 4A). Att gå från detta centrum i koncentriska ringarna är median gråskalevärde, M, i varje skal beräknas som en funktion av skalradien R. Därefter är den första (betydande) högst den numeriska derivatan av funktionen M (R) funnet (figur 4B). Poängen M OPT för denna maximala tas som den optimala tröskeln, och bilden är segmented av tröskel på denna nivå.
MCTS identifieras som den största centrala segmentet av bilden. Detta förfarande fungerar oftast bättre än standardtröskel teknik eftersom den är i stånd att separera MCTS kärnan från sönderdelande delar som ofta utvecklas med läkemedelsbehandling (figur 4C och 4D). Dessutom tillvägagångssätt som här gör implicit användning av sfärisk av MCTS. Enkla tröskelrutiner eller algoritmer baserade på aktiva konturer, inte utnyttja a priori kunskap som ett sfäriskt föremål är att hittas. När MCTS är tydligt detekteras och avgränsad, är den maximala M OPT tydlig och enkel. Rutinen mäter sedan egenskaperna hos MCTS, såsom området, större och mindre axlar, omkrets, och soliditet monterade ellips, och sparar en förhandsvisning av den segmenterade bilden. Om den maximala är inte klart, och / eller om flera lokala maxima är närvarande, en prevy av den föreslagna segmente sparas i en mapp korrigering.
I det näst sista steget, rutinen går användaren genom mapp korrigering för att manuellt justera den föreslagna segmente genom att flytta tröskel upp eller ned och val av en polygonal region av intresse för att skära av möjliga redundanta delar av masken. Efter denna manual korrigering rutinen åtgärder och sparar MCTS egenskaper, såsom beskrivits ovan.
Figur 4: Illustration av bildsegmente förfarande. (A) I mitten av MCTS är märkt med en grön asterisk. Ett exempel av ringen dras i rött. (B) Median gråskalevärde i varje skal är plottad som en funktion av skalet radie (blå linje). Den numeriska derivatan av denna kurva beräknas (röd linje). Den första betydande maximum av den numeriska derivatan hittas (svart asterisk). (C) Den resulterande korrekt segmentering av bilden i MCTS kärnan och bakgrunden med sönderfallande MCTS delar. (D) Felaktig segmente erhålls genom Otsu metod. 4X mål; Skalstreck = 500 | j, m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från det tjeckiska ministeriet för utbildning, ungdom och Sport (LO1304) och den tekniska byrån i Tjeckien (TE01020028). Författarna vill tacka Dr Lakshman Varanasi för att ta stillbilder av miljö lock.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Low-melting |
| McCOY's 5A Medium | Sigma-Aldrich | M8403 | |
| “rapid” Filtermax filter | TPP | 99505 | 0.22 μm, 500 mL |
| Multidrop™ Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | |
| Small Tube Dispensing cassette | Thermo Fisher Scientific | 24073295 | Metal tip |
| 384-well TC plate | PerkinElmer | 6057308 | Plate type- CellCarrier |
| Standard Tube Dispensing Cassette | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | |
| MicroClime Environmental Lid | Labcyte | LLS-0310 | |
| DMSO | Sigma | D4540 | |
| Rotary Incubator (SteriStore ) | HighRes Biosolutions | 23641 | Serial No.: D00384 |
| Microplate Washer Dispenser | BioTek | Unspecified | Model: EL406 |
| High-Content Imaging System (CellVoyager ) | Yokogawa Electric Corporation | Unspecified | Model: CV7000 |
| Orange G | New England Biolabs | B7022S | |
| TrypLE™ Express recombinant cell dissociation reagent | Thermo Fisher Scientific | 12604021 | Phenol red free |
References
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
- Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening. Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. , 69-70 (2014).
- Fischbach, C., Kong, H. J., Hsiong, S. X., Evangelista, M. B., Yuen, W., Mooney, D. J. Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).
- Lao, Z., et al. Improved Methods to Generate Spheroid Cultures from Tumor Cells, Tumor Cells & Fibroblasts or Tumor-Fragments: Microenvironment, Microvesicles and MiRNA. PLoS ONE. 10 (7), e0133895 (2015).
- Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Exp. Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).
- Li, Q., et al. 3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen. J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).
- Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation. J. Biomol. Screen. , (2016).
- Celli, J. P., et al. An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models. Sci. Rep. 17 (4), 3751 (2014).
- Solomon, M. A., Lemera, J., D'Souza, G. G. M. Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics. J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).
- Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).
- Walzl, A., et al. A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity. Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).
- Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays. Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci. Rep. 6, 19103 (2016).
- Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes. Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).
- Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures. Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).
- Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically. J. Vis. Exp. (89), e51639 (2014).
