Summary
ההפסד האחיד של מדיום מצלחות microtiter משפיע על השחזור של היווצרות אליפטית גידול רבה-תאיים אחידה. שיפור תנאי תרבות כדי לצמצם את אובדן בינוני משמעותי ישפר את השחזור של היווצרות אליפטית ותוצאות מבחנים מבוסס אליפטית בטכניקה הנוזלת כיסוי.
Abstract
מודלים גידול כי לחקות באופן הדוק בתנאים vivo הופכים פופולריים יותר ויותר גילוי ופיתוח תרופות להקרנה של תרופות נוגדות סרטן פוטנציאליים. Spheroids הגידול תאיים (MCTSes) ביעילות לחקות את התנאים הפיזיולוגיים של גידולים מוצקים, מה שהופך אותם מצוין במודלים חוץ גופית עבור אופטימיזציה להוביל ואימות היעד. מתוך הטכניקות השונות העומדות לתרבות MCTS, שיטת נוזלי כיסוי על agarose היא אחת השיטות הכי הזולות לייצור MCTS. עם זאת, ההעברה האמינה של תרבויות MCTS באמצעות נוזלי כיסוי להקרנת תפוקה גבוהה עלולה לסכן ידי מספר המגבלות, כולל הציפוי של צלחות microtiter (MPS) עם agarose ואת irreproducibility של היווצרות אחידה MCTS פני בארות. חברי פרלמנט נוטים באופן משמעותי בימים אלה לדחוק תופעות נובעות אידוי יתר של מדיום מן הצד החיצוני של הצלחת, למנוע את משך השימוש של הצלחת כולה על תרופהבדיקות. כתב יד זה מספק שיפורים טכניים מפורטים לטכניקה הנוזלת כיסוי כדי להגדיל את יכולת ההרחבה ואת השחזור של היווצרות MCTS האחידה. בנוסף, פרטים על כלי תוכנה פשוטה, חצי אוטומטי, וישים באופן אוניברסלי להערכת MCTS כולל לאחר טיפול תרופתי מוצג.
Introduction
תאים סרטניים בגידולים מסודרים פיסיולוגי מבנה מורכב, 3-ממדי (3D) המוקף מטריקס ותאי אינטראקציה. כמו כמעט כל התאים ברקמות מתגוררים בסביבת 3D, הצורך יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית במודלי גידול במבחנה מחקות תכונות גידול הביא לפיתוח טכניקות תרבות 3D מספר 1, 2, 3. מודלים אלה עכשיו הופכים כלי מחקר בסיסיים עבור לומד את התפקיד של microenvironment הגידול על תגובה גרורה ותא כדי רפוי ב -3 D 2. יתר על כן, לעומת 2-ממדים (2D) תא תרבויות 4, מודלי 3D לאפשר הבנה טובה יותר של אינטראקציות גידולי stroma, אשר משפיעות מסלולי איתות תאיים.
spheroids גידול התאי (MCTSes) של שורות תאים סרטניות נמצא בשימוש תדיר ג תאי 3Dמודלים ulture בשל הקרבה היחסית שלהם גידולים in vivo. מתוך מספר הטכניקות בשימוש, טכניקת כיסוי-הנוזלית (הרבה) של דור MCTS על צלחות מצופות agarose צברה עניין משמעותי עבור אימות אופטימיזציה עופרת יעד 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11. הדבר ניכר מן המחקרים האחרונים כי הצליחו בהצלחה לרוץ מסכי טייס של ספריות מתחמות בתרבויות MCTS באמצעות לוט 6, 7. עם זאת, גם ל-גם השתנות במורפולוגיה MCTS וצמיחה עקב האובדן האחיד הנגרם האידוי של מדיום הם מכשולים נפוצים שמלווים במגרש באמצעות צלחות microtiter (חברי הפרלמנט). כתוצאה מכך, ההיווצרות של לא אחידה MCTSes פשרות המשמעות ורלוונטיתנתוני מבחנים תרופתיים 8, 12, 13. בנוסף לנושאי השחזור, בעיה מעשית אחר המשפיעה מבחני תפוקה גבוהה מבוססות לוט הוא הציפוי של חברי הפרלמנט עם agarose בעת השימוש נוזלי אוטומטית מחלק יחידות. למרות היחידה מהחלק יכולה להישמר מחוממת כדי למנוע את gelling של agarose, הסתימה של קלטת מחלק הצינורות היא דאגת פוטנציאל מערכות רובוטיות 6.
כדי להתגבר על חלק מהאתגרים הללו, אנו פתחנו לאחרונה כמה שינויים במגרש עבור MCTS תרבות 8. שינויים אלה מבוססים בעיקר על דרכים אפשריות למניעת נשירה בינונית אחידה מן החברים הפרלמנט באמצעות מכשירים מצויים לרוב במעבדות הקרנת תפוקה גבוהה. נוהל מפורט של המגרש שונה עבור הדור של MCTSes בגודל לשחזור באופן אחיד על פני 384-גם צלחות (WPS) מוצגות כאן. כתב היד גם מציגה שגרה אוטומטית למחצה להערכת גודל MCTS, במיוחד בחלקו מתפורר, MCTSes מטופלים בתרופה כי אין גבול ברור למדידת שטח חתך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת צלחות מצופות Agarose
- לשקול 0.75 גרם של נקודת agarose התכה נמוכה ולהוסיף אותו ל -100 מ"ל של מדיום 5A של מקוי (עם או ללא פנול אדום) ללא בסרום. מחממים את הפתרון במיקרוגל ו מערבולת כל 1-2 דקות כדי לפזר את agarose לחלוטין. חיטוי הפתרון לעקר אותה.
- מצננים את autoclaved agarose לכ -70 מעלות צלזיוס, לסנן אותו דרך העליון 500 מ"ל, 0.22 מיקרומטר מסנן על ידי סינון ואקום בתוך קופסה זרימה למינרית. Aliquot פתרון agarose המסונן 0.75% (FAS) לתוך כמויות קטנות יותר אם לא באמצעות הפתרון כולו בבת אחת. בחנות זו בסביבה נקייה מחיידקים פתרון agarose מוכן לשימוש בחדר קר או 4 ° C במקרר עד 4 שבועות.
- צרף צינור קטן עם בפלסטיק או קלטת מחלק שקצו מתכת מנפק מגיב קומבי וראש הקלטת עם 70% אתנול (EtOH) ולאחר מכן עם פוספט שנאגר המלוח סטרילית (PBS) בקופסא זרימה.
- לפני השימוש, לחמם aliquot מאוחסן של FAS i n במיקרוגל כדי להמיס אותו. ראש הקלטת מחלק עם פתרון agarose ומעיל 384 גם, בתרבית רקמה (TC) -treated "מיוחד" microplates עם 15 μL של FAS. אפשר agarose בצלחת לצינון למשך 15-20 דקות לפני זריעת התאים. אחסן את הצלחות מצופות agarose בסביבה נקיה מחיידקים, עטופות בשקית פוליאתילן בחדר קר או ב 4 ° C, הרחק מאור שמש ישיר.
הערה: הימנע חימום חוזר ונשנה של 0.75% FAS למנוע שינוי בריכוז של agarose בפתרון המניות. צלחות מצופות agarose ניתן לאחסן עד 2 שבועות כאשר הם מאוחסנים בתנאים הנ"ל. FAS אינו דורש חימום במהלך הציפוי של צלחות. - נקה את הקלטת מהחלק ידי תחול זה עם 70-80 ° C מים סטריליים כדי להסיר כל agarose שנותר טיפי הקלטת וצינורות.
גיבוש 2. תא תרבות MCTS
- תרבות תאי HCT116 אדם גסת קרצינומה, כפי שתואר לעילילדה = "Xref"> 8.
- הסר את המספר הדרוש של מצופה agarose, 384 גם, TC שטופלו microplates מ בקירור לאזן אותם לטמפרטורת החדר (RT) במשך 15 דקות.
- הכן את המנפק מגיב קומבי עבור זריעת תאים על ידי תחול קלטת מחלק הצינור רגילה עם 70% EtOH ו PBS סטרילית. כוון את עוצמת קול הזריעה אל μL הנדרש ואת המהירות שספק עד בינוני באמצעות לחצני הגדרה הידניים על המנפק.
הערה: תהליך זריעת תא כולו מבוצע בתנאים סטריליים בתוך קופסא זרימה למינרית. - לנתק תאים חסידים מהבקבוק בתרבית הרקמה באמצעות אנזים דיסוציאציה תאי רקומביננטי. הפוך מלאה השעית תא מבחנה סטרילית עם תאי זרע בצפיפות של 2.5 x 10 4 תאים / מיליליטר לכל היטב 50 μL של מדיום גידול להשלים. כאשר זריעה יותר מאחד 384-WP, מערבבים את התאים בעזרת בוחש מגנטי כדי למנוע מהם מלהתיישב לתחתית הכוס.
- אפשרצלחות לנוח למשך 30 דקות ב RT ואז צנטריפוגות במשך 15 דקות ב 4 x ז.
- בינתיים, לקחת מכסה הסביבה להפחתת אידוי ולמלא אותו עם 8 מ"ל של H 2 O סטרילי או 5% sulfoxide דימתיל (DMSO) בצדדים קצר (שמאל וימין) באמצעות (איור 1 א) 5 מ"ל פיפטה. ראשית, לוותר 4 מ"ל של מילוי נוזל לתוך השוקת בצד שמאל על ידי גורף את קצה פיפטה לאט למעלה ולמטה. חזור על פעולה זו עם השוקת בצד הימני.
הערה: ודא כי הנוזל מתווסף שקתות הצד אינו מתבצע במרכז המכסה, ולהשאיר פער לחילופי גז (איור 1 א). הוספת סכום עודף של H 2 O תוצאות החלחול של H 2 O על הצד החיצוני של המכסה ולאחר מכן לתוך הבארות החיצוניות של 384 גם צלחות TC. - מלאו את מיכל נוזל של הצלחת TC 384 גם עם סטרילי H 2 O ולהחליף את מכסים בצלחת רגיל עם מכסים סביבתי מלא נוזל (איור 2 א).
- מניחים את הצלחות באינקובטור רוטרי 37 מעלות צלזיוס עם לחות 95%, 5% CO 2, ו -20% O 2, ולאפשר לתאים כדי לצבור לתוך MCTSes במשך 4 ימים. הימנע מפתיחת הדלת בחממה במשך זמן רב מדי בימים שלאחר מכן כדי למנוע את רמת הלחות מלהפיל בפתאומיות.
3. המרה בינונית באמצעות מערכת רובוטית
- ביום 4 לאחר היווצרות MCTS, להוסיף 30 μL של המדיום מראש חימם לכל טוב באמצעות מתקן מכונת כביסה microplate אוטומטיות. אפשר MCTSes לגדול במשך 3 ימים נוספים. החלף את המדיום קבוע כל 3 ימים, עד שהם מגיעים לגודל הרצוי לניסויים.
- כדי לשאוב נפח מוגדר בינוני מכל טוב, באופן אמפירי להתאים את z -height של סעפת מכונת הכביסה. לשאוב 30 μL של המדיום לכל טוב ולהחליפו 30 μL של מדיום חדש, מחומם מראש.
הערה: הגדרת מהירות מהחלק את המהירות שבה סעפת מכונת הכביסה נוסעת במורדלתוך בארות בשיעור הנמוך ביותר כדי למזער מערבולת הבארות.
4. הדמית ביצועי תוכן של MCTS וניתוח תמונה חצי אוטומטי
- תמונה את MCTS במערכת הדמיה אוטומטית גבוה תוכן באמצעות מטרת אוויר 4X (NA 16).
- קבע את זמן החשיפה ל -11 מילי-שניות ואת binning עד 4 x 4. התאם את מספר או רווחים של z -stacks ואת binning פיקסל כפי הרצוי כדי שהניסוי ללכוד MCTS כולו לכל טוב.
- לעבד את בשלבי תמונות, כמתואר "readme," באמצעות שגרה ללא צורך במיקור חוץ נכתבה בשפת תכנות.
הערה: קבצי קוד .M ו readme .txt זמינים כקבצי קוד משלים (איור 1B). המודד השיגרתי באזור MCTS, צירים ראשיים ומשניות, היקף מוצק מתמונות 2D.
איור 1:הכנת מכסים סביבתיים תרשים זרימה של השגרה חצי האוטומטית. (א) תמונה של מכסה סביבה להפחתת אידוי מלא הנכון (משמאל) העודף (מימין) כמות מילוי נוזלי (כאן, DMSO 5%). החץ מציין שוקת הקצרה בצד להוספת נוזל. הכוכבית ממחישה את הפער באמצע המכסה בעקבות התוספת של הנפח הנכון של DMSO. (ב) עבודה מראה את השלבים כרוכים משגר ניתוח תמונה אוטומטי למחצה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההפסד לא השווה של מדיום, במיוחד מבארות פריפריה, הוא בעיה נתקלה לעתים קרובות חברי פרלמנט עם כרכי תרבות קטנים. באופן משמעותי תנאי תרבות משופרים, כגון חממות עם מבוקר היטב מערכות טמפרטורה / humidification וחברי פרלמנט מפחיתי אידוי מכסה בצלחת, להפחית את האובדן המשמעותי של מדיום על פני בארות 8. כדי למדוד את האידוי יחסית, כמויות שווות של אורנג 'G (OG) נוספו כל טוב, והשינוי ספיג OG מעל 3 ימים נרשם צלחות עם מכסים קבועים וסביבתיים באינקובטורים סטנדרטיים סיבוביים. בארות פלייט חולקו 6 קבוצות על בסיס המרחק בין שולי הצלחת (איור 2 א). בקבוצות 1-4, חל שינוי משמעותי את הספיגה של OG לאורך זמן צלחות עם מכסים קבועים בתוך חממה סטנדרטית (איור 2 ב). למרות שלא היה גם וריאציה ספיגה OG מקבוצת 1 בארות צלחות תחת שילוב חממה הסביבתי המכסה / הסיבובי (איור 2 ג), המקדמים של השתנות (CVS) היו נמוכות בהרבה בהשוואה לאלו של צלחות עם מכסים קבועים בתוך חממה סטנדרטית (איור 2 ד).
ההפסד האחיד הנגרם האידוי של מדיום הוא אחת הסיבות פוטנציאל גם ל-גם השתנות גודל MCTS ואת הודעת assay חברי פרלמנט 8. עם זאת, 384 גם צלחות TC עם שילוב החממה הסביבתי המכסה / רוטרי הביאו להיווצרות של MCTSes האחידה על פני 6 הקבוצות של בארות (איור 2E). לעומת זאת, MCTSes צלחות עם שילוב חממה קבוע המכסה / תקן להשתנות באופן משמעותי גודל ויציבות (איור 3F). איתנות היא מדד של כדוריות MCTS ונותנת מידת ההתפוררות של MCTS. האיתנות של אזור 2D היא שיעור הפיקסלים השיתוףגוף nvex של האזור של עניין (ROI) והוא נקבע על ידי חלוקת השטח של ההחזר על ההשקעה על ידי האזור של קמור של ROI. יש שני האזורים העגולים ו אליפטי מוצק של 1, וככל MCTS מתפורר, המוצקות פוחתת. ההבדל בתחום כבר דווח אל Das et. (2016) 8. ההיקף חושב מתוך הצירים הראשיים ומשניות של MCTSes.
איור 2: צלחות עם תוצאת אידוי מינימאלית שחזור מוגבר MCTS. (א) מפת צלחת מוצגת להראות חלוקת הבארות לתוך 6 קבוצות. (B ו- C) קיימות שונות משמעותיות תלוי זמן הספיג היחסי של OG מבארת בקבוצות 1-4 צלחות בתרבית חממה סטנדרטית עם מכסים רגילים (B) וממנה אנו קבוצת 1LLS צלחות עם מכסי סביבת חממה סיבובית (C). יום 3-5 OG absorbances מנורמל עד היום 0. (D) בממוצע קו"ח של ספיגת OG של קבוצה 1 בארות מימים 3-5 מוצגות עבור שילובים שני צלחת מכסה / חממה. קו"ח הן ממוצעים של 3 ניסויים בלתי תלויים. (E) MCTSes נוצר צלחות עם שילוב חממה הסביבתי מכסה / סיבובית לא היה שונה משמעותי על פני 6 הקבוצות של בארות. (ב) עם זאת, צלחות עם מכסים קבועים בתוך חממת תקן נוצר MCTSes באורך משתנה. הנתונים מוצגים עבור n> 60 MCTSes לכל קבוצה. התיבות והברים אופקיים בתוך תיבות boxplots מייצגים את 25 וה 75 עשירונים וה החציוני, בהתאמה. הזיפים לייצג את העשירונים 5 וה 95 ה, ואת חריגים מסומנים על ידי נקודות שחורות מיושרים boxplots. P-ערכי של ניתוח Kruskal-Wallis מוצגים להלן EACh boxplot. הנתונים הם מתוך לפחות 3 ניסויים בלתי תלויים לכל שילוב חממת צלחת מכסה /. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
כדי לקבוע את תחולתה הפוטנציאל של השגרה, 7 ימים בת MCTSes טופלו פקליטקסל (PTX), vincristine (VCR), אוקסליפלטין (OXA), דוקסורוביצין (DOX), ו -5 flurouracil (5-FU) בשעה 3 ריכוזים שונים במשך 4 ימים. התרופות התקבלו אולומוץ החולים האוניברסיטאי, Palacky האוניברסיטה. תמונות MCTS נותחו לאחר מכן, ואת השטח, צירים ראשיים ומשניות, היקף מוצקות של MCTSes מטופלים הושוו לקבוצת ביקורת (תאי-ההרג). הצירים הראשיים ומשניות שמשו כדי לחשב את הנפח הגיאומטרי. חלה ירידה תלויית ריכוז בתחום MCTS ונפח לאחר טיפול תרופתי (איור 3). למרות 0.001 מיקרוגרם / מ"ל VCR ו -0.4 מיקרוגרם / מ"ל DOX ו -5 FU הביא לגידול באזור MCTS, היקף הוגדל רק משמעותית בעקבות 0.001 מיקרוגרם / מ"ל VCR. היקף MCTS היה שונה באופן משמעותי רק הריכוזים הגבוהים ביותר של PTX, DOX, ו 5-FU, אשר לחלוטין השפיע על גודל MCTS. PTX ו VCR ברמה של 0.25 מיקרוגרם / מ"ל ו 0.06 מיקרוגרם / מ"ל ו DOX ו -5 FU ב 100 מיקרוגרם / מ"ל הביאו לירידה משמעותית מוצקות, מה שמעיד על התפוררות מוחלטת אל חלקי של MCTSes (איור 3).
איור 3: מדוד של שפעות תרופת MCTSes ידי השגרה חצי אוטומטי. (א) תמונות של CTL ו MCTSes מטופלים בתרופה מוצגות. בר סולם = 10 מיקרומטר. ריכוזים ב מיקרוגרם / מ"ל מקבלים עבור כל תמונה. (ב) גרפים בר להראות השפעה תלוית-מינון של PTX, וידיאו, OXA, DOX, ו 5-FU עלשטח ונפח של 7 MCTSes בן למחרת 4 ימי טיפול. היקפה MCTS הופחתו משמעותית בעקבות 0.25 מיקרוגרם / מ"ל PTX ו -100 מיקרוגרם / מ"ל DOX ו 5-FU. ריכוזי תרופה שכתוצאה ממנה ההתפוררות המוחלטת אל חלקים של MCTSes קטינה באופן משמעותי מוצקות MCTS לעומת CTL. הנתונים הם ממוצע ± סטיית התקן של 5 MCTSes לפחות מ 3 צלחות עצמאיות. * p <0.001, p # <0.01, p φ <0.05 תרופה שטופלה לעומת CTL, חד סטרי ANOVA עם מבחן ההשוואה הנפוץ של Dunnett. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ציפוי צלחות TC 384 ובכן עם מסונן Agarose
המנהג הסטנדרטי לוט הוא להשתמש נקודת agarose 1-1.5% התכה נמוכה כדי לצפות את הצלחות, המחייבת את agarose ו / או יחידת ניפוק להישמר מחומם כדי למנוע את gelling של agarose 6. Gelling של agarose הוא דאגת פוטנציאל בעת הכנת הצלחות מרובות באמצעות קלטות מחלק נוזל עם פתחי צינורות קטנים הנעים בין 0.2 ל 0.4 מ"מ קוטר. כדי להתגבר על הבעיה הפוטנציאלית של סתימת קלטות מהחלק, 0.75% FAS שמשו, כפי שהוא לא דורש חימום נוסף במהלך מהחלק. אגב, זה גם נצפה כי FAS 0.75% לא להגליד מהר ככל ללא סינון 1-1.5%, או אפילו 0.75%, פתרון agarose. באמצעות 0.75% FAS, זה לוקח פחות מ -35 שניות כדי מעיל צלחת TC 384 גם כולו מבלי לסתום את הקלטת מחלק. הקלטת ניתן לנקות בסוף ידי תחול אותו עם מים חמים כדי להסיר שאריותgarose, אשר יכול לסתום את הטיפים כאשר הקלטת אינה בשימוש.
ומכסה סביבת רוטרי חממה מעל מכסה צלחת רגיל חממה
ההפסד האחיד הנגרם האידוי של מדיום משפיע באופן משמעותי השחזור של היווצרות אחידה MCTS וכתוצאה מכך פוגע התוצאה של המבחנים 14. באופן מפתיע, קבוצת 1 בארות של צלחות TC 384 גם תחת שילוב החממה הסביבתי מכסה / רוטרי הראו וריאציה מובהקת סטטיסטי ספיג OG (איור 2 ג). עם זאת, קורות חיים נמוכים של ספיגת OG בבארות קבוצת 1 מציינים כי האידוי של בארות החיצוניות של צלחות TC 384 גם בחממה הסיבובית עם מכסי סביבה הוא לא כל כך מוגזם כמו להשפיע גם על צמיחת MCTS (איור 2 ד). זה בא לידי ביטוי מן MCTSes האחיד בגודל נוצר בקבוצת 1 בארות צלחות עם / המכסה הסביבתי שילוב החממה סיבובי. כמו כן, הקטינה ההפסדשל מדיום מונע השתנות ל-היטב היטב מבחני תרופת מצלחות TC 384 גם בתרבית החממה הסיבובית עם מכסי סביבה 8.
המתודולוגיה הציג גם תוצאות היווצרות MCTSes האחיד של כמה סרטן אחר שורות תאים שאינם סרטניים 8. עם זאת, מאז כל התאים לא יכולים מטבעם לצבור לתוך MCTSes על משטח שאינו חסיד, שיטה זו רבה ואינה מתאימה שורות תאים אחרות שלא נבדקו עבור השחזור של היווצרות אחידה MCTS. בנוסף, הדגש היה בעיקר על שימוש באינקובטור מתקדמת טכנולוגיה בשילוב עם חברי פרלמנט מפחיתי אידוי מכסה בצלחת להגדיל את השחזור של היווצרות MCTS. עוד פתרון זול וקל להגדיל את השחזור של היווצרות MCTS יכול להיות השימוש בשמן מינרלי העובר כיתה לנשימת איטום קלטות או ממברנות, אשר למנוע אידוי אלא לאפשר חילוף גזים נורמלים 15. למרות agarose מוסיף עובי נוסף לצלחת תחתית, אשר יכול לשמש מחסום בפני הדמיה גבוהה תוכן, עומק השדה טופל על ידי תחתון agarose בתחום הדמית אור מועבר לא לעכב את בירור גודל MCTS וצורה לאחר טיפול תרופתי. לכן, השיטה המוצגת תהיה עניין פוטנציאל חוקרים עם בעיות שחזור במגרש של תרבות MCTS.
שגרתי ניתוח תמונה חצי אוטומטי
אמנם יש הרבה חצי אוטומטי / אוטומטי התוכנה זמינה עבור ניתוח התמונה MCTS, מדידת גדלים של שלמה אל-חלקית מתפורר MCTSes לאחר טיפול תרופתי הוא נוטה לטעויות 16, 17. בשלב הראשון של השגרה הציגה, התמונה הממוקדת הטוב ביותר תיבחר באופן אוטומטי מהסט של תמונות -stack z באמצעות חישוב הנורמה של השיפוע של התמונה ובחירה אחד עם קואה 0.999 הגדולהntile. זהו מדד חזק ורעש רישיות של המקסימום.
בא, הגבולות הכהים נחתכים ואת תמונות המעובד מאוחסנות ברזולוציה המקורית בפורמט נייד גרפיקת הרשת. תהליך זה מקטין את הגודל הכולל מ -2.5 GB, בהדמיית צלחת 384 גם, TC שטופלה כולו, כ 100 MB. בהמשך לכך, במרכז MCTS נמצא דרך פיתול עם מסנן עגול ברדיוס המוגדרים על ידי המשתמש (אנו משתמשים 20 פיקסלים; איור 4 א). מינימום מקומי ברור של התמונה המסוננת מספק את המיקום של המרכז (איור 4 א). העברה ממרכז זה annuli קונצנטריים, הערך בגווני אפור החציוני, M, בכל מעטפת מחושב כפונקציה של רדיוס הקליפה, ר 'לאחר מכן, המקסימום (המשמעותי) הראשון של הנגזר המספרי של פונקצית M (R) הוא נמצא (איור 4B). בשפ M נקודת מקסימום זה נלקח כמו הסף האופטימלי, והתמונה היא שלegmented ידי thresholding ברמה זו.
את MCTS מזוהה הקטע המרכזי הגדול של התמונה. הליך זה בדרך כלל עובד טוב יותר מאשר טכניקת thresholding הרגילה, כי הוא מסוגל להפריד בין ליבת MCTS מן החלקים מתפוררים כי לעתים קרובות תוצאה של טיפול תרופתי (האיור 4C ו 4D). יתר על כן, הגישה שאומצה כאן עושה שימוש מרומז של הכדוריות של MCTS. שגרות thresholding פשוט, או אלגוריתמים המבוססים על קווי המתאר פעילים, אין לנצל את הידע אפריורי כי אובייקט כדורי הוא להימצא. כאשר MCTS מזוהה בבירור ופירט, כבושי M מקסימלית ברורים אחת. שהגרה ואז מודדת את המאפיינים של MCTS, כמו האזור, צירים ראשיים ומשניות, היקף מוצקות של האליפסה המצוידת, ושומרה תצוגה מקדימה של התמונה המפולחת. אם המקסימום הוא לא ברור, ו / או אם היא מקסימום המקומי קיים מספר מראשלאור הפילוח הציע נשמר לתוך תיקיית תיקון.
בשלב הלפני האחרון, השגרה נכנסת המשתמש דרך תיקיית התיקון להתאים את הפילוח המוצע באופן ידני על ידי הזזת את הסף או למטה ובחירת אזור מצולעים של עניין כדי לחתוך חלקים מיותרים אפשריים של המסכה. לאחר תיקון ידני זה, לאמצעים השגרתיים ושומר המאפיינים MCTS, כפי שתואר לעיל.
איור 4: איור של הליך פילוח תמונה. (א) במרכז MCTS מסומן בכוכבית ירוקה. דוגמה של annulus מופנית באדום. (ב) שווי בגווני אפור החציוני כל פגז הוא זמם כפונקציה של רדיוס הקליפה (קו כחול). הנגזר המספרי של עקומה זו מחושב (קו אדום). מא המשמעותית הראשונהximum של הנגזר המספרי נמצא (כוכבית שחור). (ג) פילוח נכון וכתוצאה מכך של התמונה לתוך ליבת MCTS ורקע עם חלקי MCTS מתפוררים. (ד) פילוח שגוי מתקבל על ידי השיטה של Otsu. מטרת 4X; סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממשרד החינוך הצ'כי, הנוער והספורט (LO1304) והסוכנות הטכנולוגית של צ'כיה (TE01020028). המחברים מבקשים להודות לד"ר לאקשמן ורנאסי שהקדיש תמונות סטילס של עפעפיים סביבתיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Low-melting |
| McCOY's 5A Medium | Sigma-Aldrich | M8403 | |
| “rapid” Filtermax filter | TPP | 99505 | 0.22 μm, 500 mL |
| Multidrop™ Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | |
| Small Tube Dispensing cassette | Thermo Fisher Scientific | 24073295 | Metal tip |
| 384-well TC plate | PerkinElmer | 6057308 | Plate type- CellCarrier |
| Standard Tube Dispensing Cassette | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | |
| MicroClime Environmental Lid | Labcyte | LLS-0310 | |
| DMSO | Sigma | D4540 | |
| Rotary Incubator (SteriStore ) | HighRes Biosolutions | 23641 | Serial No.: D00384 |
| Microplate Washer Dispenser | BioTek | Unspecified | Model: EL406 |
| High-Content Imaging System (CellVoyager ) | Yokogawa Electric Corporation | Unspecified | Model: CV7000 |
| Orange G | New England Biolabs | B7022S | |
| TrypLE™ Express recombinant cell dissociation reagent | Thermo Fisher Scientific | 12604021 | Phenol red free |
References
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
- Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening. Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. , 69-70 (2014).
- Fischbach, C., Kong, H. J., Hsiong, S. X., Evangelista, M. B., Yuen, W., Mooney, D. J. Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).
- Lao, Z., et al. Improved Methods to Generate Spheroid Cultures from Tumor Cells, Tumor Cells & Fibroblasts or Tumor-Fragments: Microenvironment, Microvesicles and MiRNA. PLoS ONE. 10 (7), e0133895 (2015).
- Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Exp. Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).
- Li, Q., et al. 3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen. J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).
- Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation. J. Biomol. Screen. , (2016).
- Celli, J. P., et al. An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models. Sci. Rep. 17 (4), 3751 (2014).
- Solomon, M. A., Lemera, J., D'Souza, G. G. M. Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics. J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).
- Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).
- Walzl, A., et al. A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity. Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).
- Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays. Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci. Rep. 6, 19103 (2016).
- Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes. Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).
- Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures. Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).
- Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically. J. Vis. Exp. (89), e51639 (2014).
