Summary
mikrotiter plakaları orta düzensiz kaybı üniforma çok hücreli tümör sfero oluşumu tekrarlanabilirlik etkiler. Kültür şartlarının iyileştirilmesi küremsi oluşumu tekrarlanabilirlik ve sıvı üst tabaka tekniği ile küremsi bazlı deneylerin sonuçları geliştirmek önemli bir orta kaybını azaltmak.
Abstract
Yakından in vivo koşullarda taklit Tümör modelleri potansiyel anti-kanser ilaçların taranması için ilaç keşfi ve geliştirilmesi giderek daha popüler hale gelmektedir. Çok hücreli tümör sferoidler (MCTSes) etkili bir talebi optimizasyonu ve hedef doğrulama için in vitro bir model bunları uygun hale getirir, katı tümörlerin fizyolojik koşulları taklit eder. MCTS kültürü için çeşitli tekniklerin dışında, agaroz üzerinde sıvı bindirme yöntemi MCTS üretimi için en ucuz yöntemlerden biridir. Bununla birlikte, yüksek verimli tarama için sıvı kaplama kullanarak MCTS kültürleri güvenilir aktarım agaroz ile mikrotiter plakaları (MAS) kaplanması ve kuyu boyunca tek MCTS formasyonunun irreproducibility dahil kısıtlamaları bir dizi tarafından tehlikeye. Milletvekilleri ilaç için tüm plaka kullanımını engelleyen, plaka dış ortamdaki aşırı buharlaşma sonucu etkileri kenar önemli yatkındırtestleri. Bu el yazması üniforma MCTS formasyonu ölçeklenebilirlik ve tekrarlanabilirlik arttırmak için sıvı bindirme tekniği detaylı teknik geliştirmeler sağlar. ilaç tedavisi sunulmuştur sonra Ayrıca, MCTS değerlendirilmesi için basit, yarı otomatik ve evrensel olarak uygulanabilir yazılım aracı ile ilgili detaylar sunuyor.
Introduction
tümörlerde kanser hücreleri fizyolojik hücre dışı matris ve etkileşim hücreleri ile çevrili bir kompleks 3 boyutlu (3D) bir yapı içerisinde düzenlenir. Yaklaşık dokularda bütün hücreler 3 boyutlu bir ortamda bulunan tümör özellikleri taklit nitro tümör modellerinde daha fazla fizyolojik olarak uygun olan ihtiyaç çok 3D kültür teknikleri, 1, 2, 3 geliştirilmesi ile sonuçlanmıştır. Bu modeller artık 3D 2 terapötik metastazı ve hücre yanıtına tümör mikro rolü çalışmak için temel araştırma araçları haline gelmektedir. Ayrıca, 2-boyutlu (2B) hücre kültürleri 4 ile karşılaştırıldığında, 3 boyutlu modeller hücre içi sinyal yollar etkileyen tümör stromanın etkileşimleri, daha iyi anlaşılması için izin verir.
kanser hücre hatlarının çok hücreli tümör sferoidler (MCTSes) sık sık 3D cep c kullanılanin vivo tümörlerin göreli yakınlığı nedeniyle ulture modelleri. Kullanılan çeşitli teknikler dışında, agaroz ile kaplanmış plakalar MCTS nesil sıvı katlamalı tekniği (lot) talebi optimizasyonu ve hedef doğrulama 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 için büyük ilgi görmüştür. Bu LOT 6, 7 kullanılarak MCTS kültürlerde bileşik kütüphaneler pilot ekranları çalıştırmak için başarılı başardık son çalışmalar bellidir. Ancak, orta buharlaşma kaynaklı düzensiz kaybına MCTS morfolojisi ve büyüme iyi-to-kuyu değişkenlik mikrotitre levhaları kullanılarak LOT (milletvekilleri) eşlik ortak engelli bulunmaktadır. Sonuç olarak, üniform olmayan MCTSes oluşumu önemini ve alaka ödünFarmakolojik Testler 8, 12, 13 veri. birimleri dağıtma otomatik sıvı kullanırken uyarlık konularına ek olarak, LOT-tabanlı yüksek verimli deneyleri etkileyen başka pratik bir sorun milletvekilleri kaplama agaroz ile. Besleme ünitesi agaroz jelleşmenin önlenmesi için ısıtıldı tutulabilir, ancak tevzi kaset ve boru tıkanma robotik sistemler 6 için potansiyel bir husustur.
Bu zorlukların bazılarının üstesinden gelmek için, biz son zamanlarda MCTS kültürü 8 LOT birkaç değişiklik geliştirmişlerdir. Bu modifikasyonlar özellikle yaygın yüksek verimli tarama laboratuvarlarında bulunan araçları kullanarak milletvekilleri gelen düzensiz orta kaybını önlemek için olası yolları dayanmaktadır. 3 arasında muntazam boyutlu ve tekrarlanabilir MCTSes üretilmesi için modifiye edilmiş çok bir ayrıntılı işlem84-kuyu plakaları (İP) sunulmuştur. Eser özellikle, enine kesit alanının ölçümü için net bir şekilde tanımlanmış bir sınır yoktur, kısmen parçalanmış, ilaçla işleme tabi tutulmuş MCTSes olarak, MCTS boyutunun değerlendirilmesi için bir yarı-otomatik rutin sunulur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Agaroz kaplı plakalar hazırlanması 1.
- düşük erime noktalı agaroz 0.75 g tartılır ve serumsuz ml McCoy'un 5A ortamı (ya da fenol kırmızısı olmadan) 100 ekleyin. Bir mikrodalga çözüm ısıtın ve tamamen agaroz çözmek için her 1-2 dakikada bir girdap. sterilize çözüm Otoklav.
- yaklaşık 70 ° C'ye kadar agaroz otoklava soğutun ve bir laminer akış kutusu, vakumla süzülerek 500 mL, 0.22 um'lik bir filtre üst yoluyla filtre. bir kerede tüm çözüm kullanarak değilse küçük hacimlere% 0.75 filtrelenmiş agaroz çözeltisi (FAS) alikotu. soğuk oda ya da 4 hafta boyunca 4 ° C'de buzdolabında Bu hazır kullanım agaroz çözelti aseptik saklayın.
- bir akış kutusu steril fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS) ile daha sonra% 70 etanol (EtOH) ile, bir Combi reaktifi dağıtıcı ve birinci kaset plastikli veya metal uçlu dağıtma kaseti ile küçük bir tüp takın.
- Kullanımdan önce, FAS I depolanmış bir kısım ısı n mikrodalga bunu eritmek için. Başbakan Agaroz çözüm ve ceket 384 gözlü, doku kültürü (TC) ile dağıtım kaset FAS 15 uL mikropleytin "özel" ile tedavi edilen. plaka agaroz hücrelerin ekim önce 15-20 dakika soğumasını bekleyin. Soğuk bir odada ya da 4 ° C'de ve doğrudan ışıktan bir polietilen torbaya sarılmış aseptik agaroz kaplı plakalar, saklayın.
Not: Stok solüsyonu agaroz konsantrasyonunda bir değişikliği önlemek için% 0.75 FAS tekrarlanan ısıtma kaçının. Yukarıda sözü edilen koşullar altında depolandığında Agaroz kaplı plakalar 2 haftaya kadar saklanabilir. FAS plakalarının kaplanması esnasında ısıtma gerektirmez. - kaset ipuçları ve tüplerde kalan agaroz kaldırmak için 70-80 ° C steril su ile macun ile dağıtım kaset temizleyin.
2. Hücre Kültürü ve MCTS oluşumu
- Kültür, insan kolorektal karsinoma HCT116 hücreleri, daha önce tarif edildiği gibilass = "xref"> 8.
- agaroz kaplı, 384 gözlü, soğuk depolama mikro TC ile muamele edilmiş ve istenen sayıda çıkarın ve 15 dakika süre ile oda sıcaklığında (RT) kadar dengeye getirin.
- % 70 EtOH ve steril PBS ile bir standart tüp dağıtım kaseti emişli hücre tohumlama için Kombi reaktif dağıtıcı hazırlayın. Gerekli mcL tohumlama hacmi ve dağıtıcı manuel ayar düğmelerini kullanarak ortama dağıtım hızını ayarlayın.
Not: tüm hücre ekim işlemi, steril koşullar altında, bir laminar akış kutusunda gerçekleştirilmektedir. - bir rekombinant hücre ayrışma enzim kullanılarak doku kültürü şişesi yapışkan hücreleri ayırmak. Tam büyüme ortamında 50 ul oyuk başına 2.5 x 10 4 hücre / mL'lik bir yoğunlukta, tohum hücreleri ile steril bir beherde bir hücre süspansiyonu stok yapmak. Birden fazla 384 WP tohum zaman, kabın dibine yerleşmesini önlemek için, bir manyetik karıştırıcı kullanılarak hücrelerin karıştırın.
- izin vermekPlakalar oda sıcaklığında 30 dakika dinlendirilir ve daha sonra 4 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj.
- Bu arada, bir buharlaştırma düşürücü çevresel kapak alır ve onu kısa kenarlara steril H 8 mL 2, O ya da% 5 dimetil sülfoksit (DMSO) ile doldurun 5 ml pipet (Şekil 1A) ile (sol ve sağ). İlk olarak, yavaş yavaş yukarı ve aşağı pipet süpürülerek sol taraftaki çukur içine sıvı dolum 4 mL dağıtmak. Sağ taraftaki çukur ile bu adımı yineleyin.
NOT: Sıvı kapağının merkezinde birleştirme ve gaz değişimi (Şekil 1A) için bir boşluk bırakmaz yan olukları eklenen emin olun. Kapağın dış ve daha sonra 384 gözlü TC levhaları dış kuyu içine H H2O sızma 2 O sonuçlar aşırı miktarda eklenmesi. - (Şekil 2A, steril H2O ile 384 gözlü TC levhaları sıvı haznesini ve sıvı dolgulu çevresel kapak düzenli levha kapaklar yerine).
- % 95 nem,% 5 CO2 ve% 20 O2 ile 37 ° C, döner bir inkübatörde tabak yerleştirin ve hücreler, 4 gün boyunca MCTSes halinde toplamak için izin verir. aniden düşmesini nem seviyesini önlemek için sonraki günlerde çok uzun süre inkübatör kapıyı açmaktan kaçının.
Bir Robotik Sistemi Kullanılarak 3. Orta Değişim
- MCTS oluşumundan sonra 4. günde, otomatik bir mikro yıkama dağıtıcı kullanılarak göz başına önceden ısıtılmış ortam 30 uL ekleyin. MCTSes ek olarak 3 gün boyunca büyümeye izin verin. onlar deney için istediğiniz boyutu ulaşmak kadar, düzenli olarak her 3 günde bir orta yerine.
- Her bir ortamdaki bir tanımlanan hacmi aspire ampirik yıkama manifoldunun Z -height ayarlayın. Aspire 30 kuyu başına orta ul taze, önceden ısıtılmış orta 30 uL ile değiştirin.
NOT: yıkama manifoldu aşağı hareket hangi dağıtım hızı ve hız ayarlamaen düşük oranda kuyuların içine kuyularda türbülans en aza indirmek için.
MCTS 4. Yüksek içerik Görüntüleme ve Yarı-otomatik Görüntü Analizi
- Resim 4X hava objektif kullanarak bir yüksek içeriği otomatik görüntüleme sisteminde MCTS (NA 16).
- Numarası ve aralık z -stacks ve oyuk başına bütün bir MCTS yakalamak için deney için istediğiniz gibi piksel binning ayarlayın 11 ms maruz kalma süresi ve 4 x 4'e binning ayarlayın.
- programlama dilinde yazılmış bir in-house yordamını kullanarak ", benioku" bölümünde açıklandığı gibi, resim kademeli olarak işleyin.
NOT: .m kodu ve .txt benioku dosyaları ek kod dosyaları (Şekil 1B) olarak mevcuttur. Rutin tedbirler 2D görüntüleri MCTS alanı, majör ve minör eksenler, çevre ve sağlamlık.
Şekil 1:Çevresel kapak hazırlanması ve yarı otomatik rutin bir akış şemasıdır. Doğru (sol) ve fazla miktarda sıvı dolgu (sağ) bir miktarda (burada,% 5 DMSO) ile dolu bir buharlaştırma düşürücü çevresel kapağın (A) görüntü. ok sıvı eklemek için kısa kenar çukur gösterir. Yıldız işareti DMSO doğru hacminin eklenmesinden sonra kapağın ortasında boşluk gösterir. (B) yarı otomatik görüntü analizi rutin yer alan adımları gösteren bir iş akışı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Özellikle periferik kuyulardan orta düzensiz kaybı, küçük kültür hacimleri ile milletvekilleri sık karşılaşılan bir sorundur. Bu tür iyi kontrol sıcaklık / nemlendirme sistemleri ve buharlaştırma azaltıcı MP'lerin ve plaka kapaklı kuluçka esas olarak geliştirilmiş kültür koşulları, kuyu 8 boyunca ortam önemli kaybını azaltır. nispi bir buharlaşma ölçmek için, Orange G (RG) eşit hacimleri her bir kuyucuğa ilave edildi ve 3 gün boyunca RG absorbans değişikliği, standart ve döner kuluçka düzenli ve çevresel kapak ile plakalar kaydedildi. Plaka kuyuları plaka (Şekil 2A) kenarından uzaklıklarına göre 6 gruba ayrılmıştır. Grupları 1-4, standart bir inkübatör (Şekil 2B) normal kapaklı plakalarda zaman OG absorbans önemli bir değişiklik olmamıştır. OG absorbans bir varyasyonu dan da olmasına rağmengrup çevre kapak / döner inkübatör kombinasyonu (Şekil 2C) altında plakalarda 1 kuyu, varyasyon katsayıları (CV) standart inkübatör (Şekil 2B) düzenli kapaklı plakaların kıyasla çok daha düşüktür.
Orta buharlaşma kaynaklı düzensiz kaybı MCTS boyut ve milletvekilleri 8 tahlil okuma iyi-to-kuyu değişkenliği potansiyel nedenlerinden biridir. Ancak, çevre kapak döner / inkübatör kombinasyonu ile 384 gözlü TC levhaları kuyu 6 grup (Şekil 2E) boyunca tek MCTSes oluşumu ile sonuçlandı. Bunun aksine, normal kapak / standardı inkübatör kombinasyonu ile plakalarda MCTSes büyüklüğü ve sağlamlığı (Şekil 3F) önemli ölçüde farklılık gösterir. Sağlamlık MCTS küresellik bir ölçüsüdür ve MCTS parçalanma derecesini verir. 2B bölgenin sağlamlık co piksel oranıdırFaiz (ROI) bölgesi ve nvex gövde ROI dışbükey gövde alanına göre ROI alanı bölünmesi ile tespit edilir. Daire ve elips bölgeleri 1 bir sağlamlık vardır ve MCTS Ayırıcılar olarak, sağlamlık azalır. Alanda meydana gelen farklılık önce Das et al bildirilmiştir. (2016) 8. birim MCTSes büyük ve küçük eksenleri arasında hesaplandı.
Şekil 2: artmış MCTS tekrarlanabilirlik minimal buharlaşma sonucu Tabaklar. (A) plaka haritası 6 gruba kuyuların bölünmesini göstermek için sunulmuştur. (B ve C), normal kapak (B), standart bir inkübatör içinde kültürlendi plakalarda gruplar 1-4 kuyulardan OG nispi absorbans bir zamana bağlı belirgin farklılıklar vardır ve grup 1 biz gelenbir döner inkübatör (C) çevresel kapaklı plakalarda LLS. Gün 3-5 OG absorbansları gün 0. (D) normalize grubun OG absorbans özgeçmişlerini gün 3-5 1 kuyu iki plaka kapağı / inkübatör kombinasyonları için gösterilmiştir Ortalamalı vardır. CV 3 bağımsız deneyin ortalamalarıdır. Çevresel kapak / döner inkübatör kombinasyonu ile plakalar oluşan (E) MCTSes kuyuların 6 grup arasında anlamlı farklılık yoktu. (B) Bununla birlikte, standart bir inkübatör normal kapak plakaları farklı boyutlarda MCTSes kurdu. Veriler, grup başına n> 60 MCTSes için gösterilmiştir. Kutuları ve kutudiyagramlar kutuları içinde yatay çubuklar sırasıyla, 25 th ve 75 inci yüzdelik ve medyan temsil etmektedir. Bıyıkları 5 inci ve 95 inci yüzdelik temsil eder ve aykırı kutudiyagramlar hizalanmış siyah noktalar ile gösterilir. Kruskal-Wallis analizi p-değerleri EAC aşağıda sunulmuşturh boxplot. Veri plakası kapağı / inkübatör kombinasyonu en az 3 bağımsız deneyden alınmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
rutin potansiyel uygulanabilirliğini belirlemek için, 7 günlük bir MCTSes 3 farklı konsantrasyonda paklitaksel (PTX), vinkristin (VCR), oksaliplatin (OXA), doksorubisin (DOX) ve 5-Fluorourasil'in (5-FU) ile muamele edildi 4 gün ısıtılarak hazırlandı. ilaçlar Üniversite Hastanesi Olomouc, Palacky Üniversitesi'nden elde edildi. MCTS görüntüler daha sonra analiz edildi ve alan, majör ve minör eksenler, çevre ve tedavi MCTSes sağlamlığı kontrolleri (CTL'ler) ile karşılaştırıldı. Büyük ve küçük eksenleri geometrik hacim hesaplamak için kullanılmıştır. Ilaç tedavisi (Şekil 3) daha sonra, bir konsantrasyona bağımlı MCTS alanında bir azalma ve hacim oluştu. 0.001 ug / mL V rağmenCR ve 0.4 ug / mL DOX ve 5-FU, hacmi önemli ölçüde yalnızca 0.001 ug / mL VCR ile yükseldiği edildi MCTS alanında artış ile sonuçlanmıştır. MCTS çevre sadece tamamen MCTS boyutu etkilenen PTX, DOX ve 5-FU, yüksek konsantrasyonlarda anlamlı olarak farklı idi. PTX ve 0.25 ug / ml ve 0.06 ug / ml ve DOX ve 100 ug / ml, 5-FU, VCR MCTSes (Şekil 3) arasında tam bir-ile-parsiyel parçalanmasını gösteren sağlamlık önemli bir azalma ile sonuçlanmıştır.
Şekil 3: yarı otomatik rutin tarafından MCTSes ilaç etkilerinin ölçüsü. CTL ve ilaç ile muamele edilmiş MCTSes (A) Çıkan sunulmaktadır. Ölçek çubuğu 10 mikron =. ug / mL konsantrasyonlar her bir görüntü için verilmiştir. (B) çubuk grafikleri PTX, VCR, oksa, Dox doza bağımlı bir etki gösterir ve ilgili 5-FUKonum ve tedavinin 4 gün sonra 7 günlük bir MCTSes hacmi. MCTS çevreler anlamlı 0.25 ug / mL PTX ve 100 ug / ml DOX ve 5-FU, aşağıdaki azaltıldı. MCTSes tam-to-kısmi bir parçalanmaya yol ilaç konsantrasyonları anlamlı CTL göre MCTS sağlamlık azalttı. Veri 3 bağımsız plakaları en az 5 MCTSes ortalama ± SD bulunmaktadır. * p <0.001, # p <0.01, φ p <0.05 CTL karşı ilaçla tedavi, Dunnett çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Filtreli Agaroz ile 384 Kuyu TC Plakaları Kaplama
LOT standart bir uygulama kaplamak için agaroz ve / veya dağıtma birimi gerekir plakaları, agaroz 6 jelleşmenin önlenmesi için ısıtıldı tutulması için% 1-1.5, düşük-erime noktalı agarozda kullanmaktır. çapı 0.2 ila 0.4 mm arasında değişen küçük bir boru delikler sıvı dağıtma kasetleri kullanılarak birden fazla tabak hazırlarken agaroz jel potansiyel bir sorun değildir. Bu dağıtma sırasında ek ısıtma gerektirir dağıtma kasetleri tıkanma olası sorunu aşmak için,% 0.75 FAS kullanılmıştır. Bu arada, aynı zamanda% 0.75 FAS hızla 1-1.5 filtrelenmemiş%, hatta% 0.75, agaroz çözeltisi gibi jel etmez gözlenmiştir. % 0.75 FAS kullanarak, dağıtma kaseti tıkamadan kaplamak için bütün bir 384 gözlü TC levhaları az 35 s alır. kaset artık a çıkarmak için ısıtılmış su ile macun ile sonunda temizlenebilirKaset kullanımda değilken ipuçları engel olabilir garose.
Düzenli Plaka Kapaklı ve Kuluçka üzerinde Çevre Kapak ve Rotary İnkübatör
Orta buharlaşma kaynaklı düzensiz kaybının önemli ölçüde tekdüze MCTS formasyonu tekrarlanabilirlik etkiler ve dolayısıyla deneyleri 14 sonucunu uzlaşır. Şaşırtıcı bir şekilde, çevresel kapak döner / inkübatör kombinasyonu altında 384 oyuklu TC plakalarına grubu 1 kuyu OG absorbans (Şekil 2C) istatistiksel olarak önemli bir değişiklik gözlenmemiştir. Bununla birlikte, bir grup 1 kuyularda RG absorbans bir düşük CV çevresel kapak döner bir inkübatörde 384 oyuklu TC plakalarına dış kuyu buharlaşma MCTS büyüme (Şekil 2D) etkileyecek kadar fazla olduğunu gösterir. Bu da, çevre kapak döner / inkübatör kombinasyonu ile plakalarda grup 1 kuyu oluşan eşit büyüklükte MCTSes bellidir. Ayrıca, kayıp azalırorta çevresel kapaklarının 8 ile döner inkübatör kültürlü 384 gözlü TC levhaları ilaç deneylerinde iyi-to-kuyu değişkenliği engeller.
Sunulan yöntem de birkaç kanser ve kanserli olmayan hücre çizgileri 8 eşit olarak MCTSes oluşması ile sonuçlanır. Tüm hücreler, doğal bir yapışmayan bir yüzeye MCTSes halinde bir araya değildir Bununla birlikte, pek çok, bu yöntem, homojen MCTS formasyonunun tekrarlanabilirliği açısından test edilmeyen diğer hücre çizgileri için uygun olmayabilir. Buna ek olarak, odak MCTS formasyonunun tekrarlanabilirliği geliştirmek için buharlaştırma azaltıcı MP'lerin ve plaka kapak ile kombinasyon halinde gelişmiş teknoloji kuluçka kullanımı etkili olmuştur. Başka ucuz ve kolay bir çözüm buharlaşmayı önlemek, ancak bantlar veya membranlar, sızdırmazlık sağlayan embriyo dereceli mineral yağ ve nefes kullanımı olabilir MCTS formasyonunun tekrarlanabilirliği artırmak için, normal gaz değişimi 15. Agaroz yüksek içerik görüntüleme için bir engel olabilir dip, plaka için ekstra kalınlık ekler rağmen, iletilen ışık görüntülemede bir agaroz alt tarafından oluşturulan alan derinliği MCTS büyüklüğü kesinlefltirilebilmesi engel ve ilaç tedavisinden sonra şekil değildir. Bu nedenle, sunulan yöntem MCTS kültürünün LOT içinde uyarlık karşılaştığı sorunlar araştırmacıların potansiyel ilgi olacaktır.
Yarı-otomatik Görüntü Analizi Rutin
Birçok olmasına rağmen / yarı otomatik MCTS görüntü analizi için uygun otomatik yazılım, tam-to-Kısmen parçalara ayrılmış MCTSes sonra, ilaç tedavisi boyutlarda ölçüm hataları 16, 17 eğilimlidir. Sunulan rutin İlk aşamada, en odaklı görüntü otomatik olarak büyük 0.999 nereye ile bir görüntünün degrade norm hesaplama ve seçerek z -stack görüntüleri kümesinden seçilirNTILE. Bu en fazla sağlam ve gürültü duyarsız ölçüsüdür.
Sonra, koyu sınırları kırpılır ve işlenmiş görüntüleri Portable Network Graphics formatında orijinal çözünürlükte kaydedilir. Bu işlem yaklaşık 100 MB, bütün bir 384 TC-işlenmiş plaka görüntüleme gelen, 2,5 GB toplam boyutunu küçültür. Daha sonra, MCTS merkezi kullanıcı tanımlı yarıçaplı dairesel filtre ile bir kıvrım ile bulunur (Şekil 4A, biz 20 piksel kullanın). Filtrelenmiş görüntü net yerel minimum merkezi (Şekil 4A) konumunu sağlar. eş-halkacıktan bu merkezi taşıma her kabukta ortalama gri tonlama değeri, E, kabuk yarıçapının bir fonksiyonu olarak hesaplanır, R. Bundan sonra, fonksiyon M sayısal türevinin ilk (büyük) en, (R) bulunan (Şekil 4B). Bu maksimum noktası M OPT optimum eşik olarak alınır ve görüntü s olanBu düzeyde eşikleme ile egmented.
MCTS görüntünün büyük merkezi segment olarak tanımlanır. Genellikle ilaç tedavisi (Şekil 4C ve 4D) sonucu parçalanan yerlerinden MCTS çekirdeğini ayırmak mümkün olduğundan bu işlem genellikle standart eşikleme tekniği daha iyi çalışır. Ayrıca, burada benimsenen yaklaşım MCTS küresellik örtülü kullanır. Aktif kontür dayalı basit eşikleme rutinleri, ya da algoritmalar, küresel nesne bulunan olmaktır, a priori bilgi istismar yok. MCTS açıkça tespit ve tarif edildiğinde, maksimum M OPT açık ve tektir. Rutin daha sonra, alan, büyük ve küçük eksenleri, çevre ve hazır elips sağlamlık olarak MCTS özelliklerini ölçer ve parçalı görüntünün önizlemesini kaydeder. maksimum ve / veya birden fazla yerel maksimum varsa, bir ön, açık değilseÖnerilen segmentasyon görüntüle düzeltme klasörüne kaydedilir.
Sondan bir önceki adımda, rutin manuel aşağı eşik yukarı ya da hareketli ve maske olası gereksiz kısımlarını kesmek için bir ilgi çokgen bölge seçerek önerilen segmentasyon ayarlamak için düzeltme klasör aracılığıyla kullanıcı yürür. Yukarıda açıklandığı gibi, bu manuel düzeltme yapıldıktan sonra, rutin önlemler ve MCTS özelliklerini kaydeder.
Şekil 4: görüntü bölütleme prosedürünün İllüstrasyon. (A) MCTS merkezi yeşil yıldız ile işaretlenmiştir. halka bir örnek kırmızı çekilmektedir. Her kabukta medyan gri tonlama değeri (B) kabuk yarıçapı (mavi çizgi) bir fonksiyonu olarak çizilmiştir. Bu eğrinin sayısal türevi (kırmızı çizgi) hesaplanır. İlk önemli maSayısal türev ximum (siyah yıldız) bulunur. (C) MCTS çekirdeğine görüntünün neden doğru segmentasyon ve dağılmakta MCTS parçaları ile arka plan. (D) Otsu yöntemi ile elde edilen yanlış segmentasyon. 4x objektif; Ölçek çubuğu = 500 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Eğitim, Gençlik ve Spor (LO1304) Çek Bakanlığı ve Çek Cumhuriyeti Teknolojik Ajansı (TE01020028) hibe tarafından desteklenmiştir. Yazarlar çevresel kapak fotoğraf çekerken Dr. Lakshman Varanasi teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Low-melting |
| McCOY's 5A Medium | Sigma-Aldrich | M8403 | |
| “rapid” Filtermax filter | TPP | 99505 | 0.22 μm, 500 mL |
| Multidrop™ Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | |
| Small Tube Dispensing cassette | Thermo Fisher Scientific | 24073295 | Metal tip |
| 384-well TC plate | PerkinElmer | 6057308 | Plate type- CellCarrier |
| Standard Tube Dispensing Cassette | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | |
| MicroClime Environmental Lid | Labcyte | LLS-0310 | |
| DMSO | Sigma | D4540 | |
| Rotary Incubator (SteriStore ) | HighRes Biosolutions | 23641 | Serial No.: D00384 |
| Microplate Washer Dispenser | BioTek | Unspecified | Model: EL406 |
| High-Content Imaging System (CellVoyager ) | Yokogawa Electric Corporation | Unspecified | Model: CV7000 |
| Orange G | New England Biolabs | B7022S | |
| TrypLE™ Express recombinant cell dissociation reagent | Thermo Fisher Scientific | 12604021 | Phenol red free |
References
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
- Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening. Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. , 69-70 (2014).
- Fischbach, C., Kong, H. J., Hsiong, S. X., Evangelista, M. B., Yuen, W., Mooney, D. J. Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).
- Lao, Z., et al. Improved Methods to Generate Spheroid Cultures from Tumor Cells, Tumor Cells & Fibroblasts or Tumor-Fragments: Microenvironment, Microvesicles and MiRNA. PLoS ONE. 10 (7), e0133895 (2015).
- Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Exp. Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).
- Li, Q., et al. 3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen. J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).
- Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation. J. Biomol. Screen. , (2016).
- Celli, J. P., et al. An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models. Sci. Rep. 17 (4), 3751 (2014).
- Solomon, M. A., Lemera, J., D'Souza, G. G. M. Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics. J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).
- Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).
- Walzl, A., et al. A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity. Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).
- Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays. Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci. Rep. 6, 19103 (2016).
- Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes. Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).
- Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures. Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).
- Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically. J. Vis. Exp. (89), e51639 (2014).
