Summary
Rotular o domínio extracelular de uma proteína de membrana com um fluoróforo sensível ao pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite a localização subcelular, expressão, e o tráfico de ser determinado. proteínas imagiologia SEP-rotulado com microscopia de fluorescência de reflexão total interna (TIRFM) permite a quantificação dos níveis da proteína na membrana do RE e periférico plasma.
Abstract
Entendimento tráfico de membrana proteína, reunião e expressão requer uma abordagem que diferencia entre aqueles que residem em organelas intracelulares e as localizadas na membrana plasmática. medidas tradicionais baseados em fluorescência não têm a capacidade de distinguir as proteínas da membrana que residem em diferentes organelos. metodologias de ponta transcender os métodos tradicionais por acoplamento fluoróforos sensíveis ao pH com microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM). TIRF iluminação excita a amostra até cerca de 150 nm a partir da interface de amostra de vidro, diminuindo, assim, o fundo, aumentando a relação sinal-ruído, e aumentando resolução. O volume de excitação em TIRFM abrange a membrana plasmática e organelas nas proximidades, tal como o ER periférica. Superecliptic pHluorin (SEP) é uma versão sensível ao pH da GFP. Geneticamente que codifica setembro para o domínio extracelular de uma proteína de membrana de interesse posiciona o fluoróforo sobreo lado luminal do RE e na região extracelular da célula. Setembro é fluorescente quando o pH é maior do que 6, mas permanece num estado desligado a valores de pH mais baixos. Portanto, os receptores marcados com fluorescência quando setembro residente no retículo endoplasmático (ER) ou após a inserção na membrana do plasma (PM), mas não quando confinado a uma vesícula de tráfico ou outros organelos tais como Golgi. O pH extracelular pode ser ajustado para ditar a fluorescência de receptores na membrana plasmática. A diferença na fluorescência entre as imagens TIRF a pH extracelular neutros e ácidos para a mesma célula corresponde a um número relativo de receptores na membrana plasmática. Isto permite a medição simultânea de receptores residentes intracelulares e de membrana de plasma. eventos de inserção de vesículas standard também pode ser medida quando o pH extracelular é neutra, correspondendo a uma vesícula de baixo pH o tráfico de fusão com a membrana plasmática e a transição para um estado fluorescente. este versatile técnica pode ser explorada para estudar a localização, a expressão, e o tráfico de proteínas de membrana.
Introduction
As alterações na expressão do receptor, distribuição e montagem ter sido ligado a uma grande variedade de doenças, incluindo a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, fibrose cística, e dependência de drogas 1, 2, 3, 4, 5. Por exemplo, a nicotina e outros ligandos nicotínicos influenciar o tráfico de receptores de acetilcolina nicotínicos (nAChR) que conduzem a mudanças no tráfico, expressão, e regulação positiva 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10. A nicotina aumenta o número total de nAChRs montados dentro de uma célula, aumenta tráfico para a membrana plasmática, umad altera a montagem de subunidades para favorecer uma versão de alta sensibilidade de alguns subtipos. Resolvendo alterações distintas no tráfico, montagem e expressão de receptores em um modelo de doença fornece detalhes mecanicistas cruciais que são essenciais para definir alvos de drogas. Uma abordagem ideal seria rapidamente diferenciar entre receptores intracelulares e as localizadas na membrana plasmática. Isto é particularmente difícil nos casos em que uma maior parte de uma proteína particular reside intracelularmente, tais como com os nAChRs. Uma vez que a maioria dos nAChRs são localizados no retículo endoplasmático, as medidas tradicionais não têm a resolução espaço-temporal necessário para identificar alterações de localização e de tráfico ao longo da via secretora. Tráfico receptor e estudos de expressão de nAChRs foram essencialmente realizados utilizando radioligandos de ligação 11, 12 Os ensaios de biotinilação, Western blotting 13, ou imunoprecipitação Techniq ues 12. Estes dependem da especificidade de ligação de uma molécula repórter ou a fixação das células e não têm a capacidade de distinguir entre simultaneamente membrana plasmática residente e receptores intracelulares. Portanto, estudos de montagem canal iônico e vesículas dinâmica em grande parte contou com baixo rendimento técnicas eletrofisiológicas 14.
resolução espacial e temporal superior é possível com os avanços na microscopia de fluorescência. Moléculas repórter codificados geneticamente, tais como a proteína fluorescente verde (GFP) e suas variantes, eliminar os problemas de ligação não específicos e aumentar a sensibilidade 15. Uma variante sensível ao pH da GFP, conhecido como pHluorin superecliptic (SEP), pode ser utilizada para explorar as diferenças inerentes entre os compartimentos de pH dentro de uma célula para determinar a localização 5, 7, 8,Ref "> 9, 16, 17, 18. setembro fluoresce quando o pH é maior do que 6, mas permanece num estado desligado, a pH baixo. Assim, os receptores marcados com setembro do seu lado luminal são detectados quando presente no retículo endoplasmático ( ER) ou após a inserção na membrana do plasma (PM), mas não quando confinado a uma vesícula de tráfico. a manipulação do pH extracelular em contacto com receptores na membrana plasmática, por conseguinte, altera a fluorescência e, portanto, a detecção destes receptores. Se a mesma célula é fotografada sequencialmente a ambos um pH extracelular neutra e, em seguida, um pH inferior a 6, a diferença entre as imagens é atribuída a receptores localizados na membrana plasmática. Isto permite a medição simultânea de intracelular (ER periférica) e receptores de membrana residentes de plasma 5, 7, 8 p>, 9. eventos de inserção de vesículas standard também pode ser resolvido quando o pH extracelular é neutro. Uma vez que um baixo pH tráfico de vesículas funde com a membrana plasmática, o lado luminal da vesícula é exposto à solução extracelular neutro, fazendo com que uma transição detectado como uma explosão de fluorescência 7, 18, 19, 20. Setembro permite a medição dos receptores localizados na membrana plasmática e do retículo endoplasmático periférica, e proporciona um meio para medir o tráfico de receptores entre estas regiões subcelulares 5, 7, 18.
Para alcançar maior resolução na membrana plasmática, um receptor com a SEP geneticamente codificado é fotografada por microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM). Este método é particularmenteútil se a maioria dos receptores são localizada em regiões intracelulares, uma vez que TIRFM aumenta a visibilidade da membrana do plasma. TIRFM também permite a resolução da dinâmica do tráfico de vesículas simples que transportem receptores SEP-marcados mediante inserção no PM. A reflexão interna total ocorre na interface entre materiais com diferentes índices de refracção, tal como entre uma célula e uma lamela de vidro 21, 22. Setembro fluoresce quando irradiado com 488 nm de excitação, que é orientada para alcançar reflexão interna total na interface da solução de vidro e de células. Isto produz uma onda evanescente que penetra cerca de 150 nm para a amostra, apenas fluoróforos excitantes no interior deste volume. Apenas setembro contendo receptores num ambiente de pH neutro dentro desta gama de excitação são detectados, correspondentes àqueles que residem na membrana plasmática ou retículo endoplasmático periférica. Uma vez que a detecção é limitado tO excitação por onda evanescente, a fluorescência de fundo da região intracelular é reduzida e a relação sinal-ruído é aumentada 21, 22. Além disso, uma vez que a radiação não penetra na massa da célula, fotodano é minimizado o que permite imagens de células vivas ao longo do tempo. Como resultado, acoplado com TIRFM geneticamente codificado setembro fornece a alta resolução e sensibilidade requerida para medir a localização subcelular e tráfico dinâmica de receptores da membrana ao longo da via secretora.
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Protocol
1. Cultura de Células e Transfecção
- Manter as células do rato neuroblastoma 2a (N2a) em meio de crescimento.
- Adicione 500 ml N2a meio de crescimento a partir de 200 ml de meio de Eagle da Dulbecco (DMEM) com elevado teor de glucose, 250 ml de meio de soro reduzido, 50 ml de soro fetal de bovino (FBS), e 5 mL de penicilina / estreptomicina (100x).
- Manter as células num frasco de T75 a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%.
- células divididas 1:15, quando necessário, ou em cerca de 80-90% de confluência. Isto é tipicamente 2-3 vezes por semana.
- Brasão 35 milímetros prato de vidro de fundo com poli-D-lisina.
- Em uma cabine de segurança biológica de fluxo laminar, adicionar 200 ul de 0,1 ug / ml de poli-D-lisina sobre vidro região inferior do prato estéril de 35 mm.
- Coloque um prato em 37 ° C incubadora durante 1 h.
- Cuidadosamente lavar prato com ddH2O 3-4 vezes.
- Permitir pratos para secar completamente durante mais de 1 h.
- Sterilize pratos com luz UV na cabine de segurança biológica, se necessário.
- Placa célula N2A para imagens TIRFM.
- Remover o meio de crescimento a partir de células aderentes.
- Separe as células a partir do balão por incubação com 1 ml de 1x tripsina (+ EDTA) durante 5 min a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%.
- Inactivar a tripsina por adição de 9 ml de meio de crescimento. Misture meios, tripsina e as células descoladas utilizando uma pipeta.
- Visualmente contagem de células usando um hemocitômetro e calcular o volume correto para adicionar 90.000 células a cada vidro revestido prato inferior poli-D lisina. Esta densidade é necessário para a transfecção eficiente e imagiologia TIRF célula única.
- Adicione 2 ml meio de crescimento a cada prato com fundo de vidro contendo 90.000 células.
- Incubar a placa a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5% durante 16-24 horas.
- N2a transfecção
- Obter uma construção de plasmídeo contendo um fluoróforo setembro incorporadapara a região extracelular da proteína de interesse. Técnicas de clonagem convencionais, tais como amplificação por PCR 5 pode ser usado para gerar a construção.
NOTA: setembro deve ser incorporado na região extracelular da proteína de membrana de modo a que reside no interior do lúmen do retículo endoplasmático ou tráfico de vesículas e é exposto à solução extracelular, quando na membrana plasmática. Setembro é semelhante em tamanho a GFP e estratégias de clonagem semelhantes pode ser utilizado. - Substituir o meio de crescimento em células plaqueadas com 1,5 ml de meio de soro reduzido (por exemplo, Opti-MEM), aproximadamente 30 minutos antes da adição do reagente de transfecção.
NOTA: Para estudar mudanças induzidas droga em receptores, uma concentração adequada da droga pode ser adicionado no momento da transfecção. - Adicionar 500 ng de cada plasmídeo desejado construir a 250 ul de meio de soro reduzido (tubo 1).
- Adicionar 2 mL de reagente de transfecção para um tubo separado containing 250 ul de meio de soro reduzido. Incubar tubo 2 à temperatura ambiente durante 5 min. A proporção de reagente de transfecção de plasmídeo de ADN devem ser optimizados para expressar cada proteína de interesse.
- Combine tubos 1 e 2 para fazer uma solução contendo 500 mL de reagente de transfecção e mix de plasmídeo. Incubar à temperatura ambiente durante 25 min.
- Adicionar 500 ul da mistura de transfecção para células pré-revestida para um volume total de 2 ml por placa.
- Incubar as células a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5% durante 24 h.
- Após 24 horas, retire a mistura de transfecção e lavar as células com meio de crescimento e, em seguida, adicionar 2 ml de meio de crescimento para cada prato.
NOTA: Se uma droga foi adicionada no momento da transfecção, que pode ser reposta novamente neste passo. - Incubar as células a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5% durante 24 h.
- células de imagem 48 h após a transfecção.
- Obter uma construção de plasmídeo contendo um fluoróforo setembro incorporadapara a região extracelular da proteína de interesse. Técnicas de clonagem convencionais, tais como amplificação por PCR 5 pode ser usado para gerar a construção.
2. Imagens de células vivas pela Total EmReflexão terna microscopia de fluorescência (TIRFM)
- Imagiologia configurado
- Realizar imagem com um microscópio de fluorescência invertido set-up com uma plataforma de varrimento como se mostra na Figura 1. Isto requer o alinhamento de uma fonte de laser de DPSS 488 nm, um motor passo a passo para ajustar a posição do feixe de 488 nm e uma abertura numérica elevada (1.49 NA) ou 60X 100X objectiva de imersão em óleo.
- Passar o feixe de laser através do filtro de excitação apropriada (488/10 nm passa-banda). Alinhar o feixe de laser polarizada por meio de uma fibra de modo único ligado a um lançador montado um motor de passo. No modo de epifluorescência, o feixe de excitação é centrado no meio da abertura traseira do objectivo.
- Para atingir TIRF, utilizar o motor de passo para converter o feixe de laser focado através da abertura da parte de trás da lente objectiva até que o ângulo crítico é atingido e o feixe não é transmitida através da amostra e em vez disso é totalmente reflectida do vidro-cell interface.
- Capturar imagens usando um EMCCD (512 x 512 pixels) controlada com software de imagem (por exemplo, Metamorph) com o filtro de emissão apropriado montado na via emissão (525/50 nm).
- Preparar a solução de imagem
- Preparar 200 ml solução extracelular (ECS) por mistura de NaCl 150 mM, KCl a 4 mM, 2 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2, 10 mM de HEPES e 10 mM de glucose em ddH 2 O. As soluções stock de NaCl, KCl, MgCl2, e CaCl2 pode ser preparado antecipadamente e combinado com HEPES fresco e de glucose no dia da imagiologia.
- Ajustar o pH de uma solução contendo 100 ml de ECS para pH 7,4. Ajustar os restantes 100 ml de ECS para um pH de 5,4. Lavar as células transfectadas com 2 ml de ECS (pH 7,4).
- Adicionar 2 ml de ECS (pH 7,4) para as células transfectadas antes de imagem.
- Imagens de células vivas em TIRF
- Ligue todo o sistema, incluindg 488 a laser nm, câmera, fase de tradução e programa de imagem. Focar o feixe de epifluorescência e ajustar a potência para aproximadamente 1 mW ao objetivo 60X.
- Adicione o óleo para o objectivo e coloque uma placa de células transfectadas na fase de tradução. Fixar o prato no lugar utilizando montagens de palco para garantir que ele não se move em relação à fase de modo que as células podem ser trabalhada várias vezes.
- No modo de epifluorescência, focar o microscópio e localizar as células fluorescentes, transfectadas. Células continuará focada em vários planos focais. Localize células individuais, isolados para prosseguir com TIRF.
- No programa de imagem, definir o tempo de exposição a 200 ms e otimizar a intensidade de fluorescência, definindo o ganho de EM.
- Transição do feixe de laser em TIRF ao traduzir o feixe através do objectivo de uma forma passo a passo utilizando o motor passo a passo. Como as abordagens ângulo crítico, visivelmente o feixe vai traduzir em toda a borda do prato até que converge no the ponto de reflexão interna total sobre o plano da amostra.
- Verifique se as células estão em modo de TIRF, ajustando o botão de foco. Em TIRF, apenas um plano de células pode ser focado (isto é, aproximadamente a 150 nm, a partir da interface de vidro), a produção de uma imagem bem definida com alta resolução da membrana plasmática.
- Imagiologia setembro para determinar a localização subcelular
- Localize as células saudáveis, transfectadas, único no plano de imagem.
- Adquirir uma imagem focalizada de celular em pH 7,4. Setembro marcado receptores na membrana plasmática e do retículo endoplasmático deve ser visível.
- bloquear rapidamente o feixe de laser de atingir a amostra para evitar a fotodegradação.
- Memorizar as posições de palco correspondentes a cada célula usando software de imagem de microscópio capaz de gravar vários locais XY.
- Repetir passos 20-30 2.4.1-2.4.4 para células por prato, enquanto utilizando o software para gravar a posição de cada célula.
- AfTer todas as imagens de células a pH 7,4 são recolhidos, remover manualmente a solução de pH 7,4 ECS utilizando uma pipeta. Não toque o prato, pois isso pode mover as posições de palco memorizadas.
- Adiciona-se cuidadosamente 2 ml de pH 5,4 ECS para o prato e esperar 10 min. Durante este tempo, salvar imagens adquiridas anteriormente.
- Sob um conjunto idêntico de condições utilizadas para recolher imagens a pH 7,4, mover o palco para cada posição guardada e adquirir uma imagem da mesma célula a um pH de 5,4. As células devem olhar menos definida uma vez que todos fluorescência detectada é proveniente de retículo endoplasmático confinados setembro marcado receptores. Salve as imagens de células pH 5.4.
- Eventos de inserção vesícula individuais de imagem em células vivas
- Substituir o meio de crescimento de células transfectadas com 2 ml pH 7,4 a ECS, ou com meio L-15 de Leibovitz. O pH dos meios de L-15 de Leibovitz é CO 2 independente, permitindo que a imagem ter lugar ao longo de um longo período de tempo, se necessário.
- PlacPT A placa de células transfectadas no palco de microscópio. Seguros e focar uma única célula na TIRF seguinte Passo 2.3 acima.
- Se equipado, ajustar o foco automático para que o foco não deriva ao longo do período de geração de imagens.
- Gravar uma série de 1.000 quadros, capturando continuamente imagens em um frame rate de 200 ms. Rajadas de fluorescência será visível durante este tempo, correspondendo a vesículas de baixo pH de tráfico de fusão com a membrana plasmática, expondo o SEP para o pH extracelular 7,4.
- Localizar outro única célula e repita o passo acima. Repor a focagem automática, se necessário.
Análise 3. Imagem e Processamento de Dados
- Analisando setembro de fluorescência para determinar a localização subcelular
- Abra as imagens de células usando um software de análise de imagem, tais como Metamorph ou ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). Subtrair o fundo de ambos os pH 5,4 e pH 7,4 imagens usando a configuração de bola rolando.
- Usar um limiar baseado intensidade de fluorescência de quantificar a partir de uma única célula. selecionar manualmente uma região de interesse em torno da célula na imagem do pH 7,4.
- Medir a área da célula, intensidade média, e densidade integrada usando um plugin no ImageJ ou usando o construído em função de "Medida" sob a guia Analisar.
- Repetir passos 3.1.1-3.1.3 para a mesma célula, a pH 5,4, ajustando cuidadosamente o limiar de intensidade e baseadas região de interesse da mesma maneira.
- Depois de a densidade integrada é obtido para as imagens das células, tanto a pH 7,4 e 5,4, calcular a membrana plasmática densidade integrada subtraindo-se o valor de pH de 5,4 a 7,4 do valor do pH. A diferença corresponde aos receptores número relativo sobre a membrana de plasma no interior da região de excitação TIRF.
- Como uma medida de tráfico, calcular a percentagem relativa de setembro marcado receptores localizados na membrana do plasma em comparação com os restantes receptores visíveis nas excitati TIRFem volume de dividindo a membrana plasmática densidade integrada por a densidade total integrada a pH 7,4, multiplicado por 100.
- Analisando os eventos de inserção única vesícula
- Abrir a série de 1.000 imagens TIFF usando o software de análise de imagem. Subtrair o fundo de todos os quadros usando a configuração de bola rolando.
- Ajustar o equilíbrio de cores da gravação para maximizar regiões intensas correspondentes a vesícula eventos de inserção. contar manualmente as rajadas de fluorescência com duração superior a 3 quadros (> 600 ms).
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Representative Results
Setembro incorporação num receptor permite a detecção directa de que o receptor de uma célula viva. Juntamente com TIRFM, isto permite a avaliação dos níveis de expressão relativa na membrana do plasma e a distribuição de receptores dentro dos locais subcelulares na região de excitação TIRF. eventos individuais tráfego de vesículas pode também ser resolvido.
Níveis de expressão relativa de receptores SEP-marcados no Plasma Membrane
Setembro de fluorescência após excitação é ditado pelo pH da solução circundante. Quando setembro é fundida com receptores de membrana plasmática residente, o pH extracelular pode ser manipulado para transformar esta fluorescência ligado ou desligado 5, 7, 8, 9, 17. quando the o pH da solução extracelular é um fisiológico 7,4, receptores tanto da membrana do plasma e o retículo endoplasmático no interior da região de TIRF excitação fluorescente. A solução extracelular pode então ser permutado com uma solução de outro modo idêntica de pH 5,4. Isto faz com que a membrana plasmática residente setembro de transição para um estado desligado, o que significa que todos fluorescência observada é agora a partir do retículo endoplasmático. A Figura 2 mostra um exemplo de células fotografada em ambos pH 7,4 (A) e pH 5,4 (B). O número relativo de receptores na membrana do plasma em comparação com o retículo endoplasmático periférica dentro da região de TIRF de excitação é então calculada matematicamente subtraindo a densidade integrada da fluorescência a partir de pH 5,4 a pH 7,4 que, representada na Figura 2C. Esta densidade integrada membrana plasmática calculado corresponde ao número relativo de receptores SEP-rotulados localizados na membrana de plasma e no interior da excitação TIRFvolume. Uma vez que a membrana de plasma e nas proximidades retículo endoplasmático periférica são preferencialmente sendo animado com TIRF, esta comparação distribuição subcelular é entre receptores localizados para estas regiões, e não toda a região intracelular da célula.
Distribuição subcelular de Receptores SEP-rotulados
Tráfico de receptores pode ser medido por comparação da razão entre os receptores localizados na membrana do plasma em comparação com o retículo endoplasmático. Dividindo a membrana plasmática densidade integrada por a densidade total integrada a pH 7,4, multiplicado por 100, apresenta uma percentagem relativa de receptores SEP-rotulados localizados na membrana de plasma 5, 7. Como um controlo, brefeldina A pode ser adicionado às células de perturbar o tráfico proteína intracelular. Quando brefeldina A está presente, virtualmente toda a rece detectadaptors dentro da região de TIRF excitação será confinada ao retículo endoplasmático, resultando numa% PM inferior. Além disso, mutado (Δ508-I539T) do regulador transmembranar da fibrose cística (Δ508-I539T-CFTR) pode ser usado como um controlo positivo. Na presença de VX-809 de expressão comercialmente disponível,-Δ508 I539T-CFTR na superfície da célula aumenta de 2 a 3 vezes.
Individuais Eventos Vesícula de Inserção
O setembro não apresentam fluorescência ou fotobranqueador no pH baixo de uma vesícula de transporte, mas recupera a fluorescência após a exposição a um pH extracelular de 7,4 a membrana de plasma 7, 16, 18. eventos de inserção são visualizados como uma explosão de fluorescência na membrana de plasma de pelo menos 3 quadros (600 ms), correspondendo a fusão completa da vesícula de transporte para a membrana plasmática, como mostrado na Figura 3. Antes de uma inserção (Figura 3B), sem ruptura discernível está presente. Um aumento na intensidade de fluorescência é visto como a vesícula chega transporte (Figura 3C), a difusão através da membrana (Figura 3D - 3G), até que a incorporação no fluorescência maior parte da célula (Figura 3H - 3I).
Figura 1: Representação esquemática da TIRF microscópio. Esta configuração TIRF utiliza um laser DPSS 488 nm para excitação setembro, fibra acoplada a um motor passo a passo para ajustar o ângulo crítico do feixe de excitação por tradução do feixe através da abertura traseira do objectivo. As células são fotografadas utilizando uma objectiva de imersão em óleo de NA 60X, 1,49. Emissão é detectada usando uma taxa de multiplicação de elétrons coupled device.files / ftp_upload / 55466 / 55466fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Expressão e tráfico na membrana plasmática. Uma célula que expressa N2a α3-sep nAChRs / β4-wt, a pH 7,4 (A) mostra os receptores localizados na membrana plasmática e do retículo endoplasmático. A pH 5,4 (B), receptores na membrana plasmática não fluoresce, de modo que apenas os receptores residentes retículo endoplasmático são visíveis. A diferença entre a densidade integrada a pH 7,4 e pH 5,4 (C) corresponde a receptores localizados na membrana plasmática. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Single Vesícula inserção de eventos. Uma célula que expressa N2a nAChRs α3-set / p4-p com um pH extracelular 7,4 é mostrado em (A). Imediatamente anterior a uma inserção (B), sem ruptura da fluorescência é visível. Uma vesícula tráfico carregando setembro chega (C), e receptores de SEP-rotulados difundir através da membrana plasmática (D - L), até indistinguíveis dos receptores previamente inserido (H - I). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A sensibilidade de setembro pH permite receptores que residem na membrana plasmática de ser distinguido de receptores intracelulares no retículo endoplasmático, e pode ser usado para resolver eventos de inserção de vesículas 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 receptor de transporte . Várias técnicas, incluindo a biotinilação da superfície e a ligação de ligando são amplamente utilizados para medir os níveis de proteína de superfície. Em alguns casos, Western blots também pode ser usado para distinguir entre ER e proteína residente PM. Esta técnica baseia-SEP é complementar para as medições tradicionais, proporcionar uma leitura rápida da expressão de superfície e a capacidade de quantificar mudanças na proteína localizada no RE para o PM. Desde setembro é geneticamente codificado na proteína de interesse, problemas com nonspeA ligação espe- são eliminados e a sensibilidade é aumentada. Setembro passa por excitação a 488 nm, a pH neutro, mas não é animado em condições ácidas de pH <6. Quando o pH extracelular é 7,4, a fluorescência é medida para os nAChRs que residem no retículo endoplasmático e na membrana plasmática, mas não para aqueles nas vesículas secretoras de pH inferiores ou Golgi (pH <6) 23. Durante a gravação, a ECS de pH 7,4 é trocada por uma solução de outro modo idêntico a um pH de 5,4. A diferença entre a densidade integrada nestas imagens é a membrana de plasma densidade integrada de uma célula. Dividindo esse número pela densidade integrada total dentro da região de excitação TIRF, a pH 7,4, multiplicado por 100, indica a percentagem sobre a membrana de plasma 5, 7, 8, 9. Embora esses estudos utilizaram TIRFM, ensaios semelhantes pode ser realizada utilizando epi-fluorescência.Para receptores de membrana, como nAChR onde a maioria dos receptores residem no ER, TIRM é ideal porque o volume de excitação estreita aumenta a fração de receptores visíveis residentes PM contra receptores intracelulares. Isto aumenta a sensibilidade do ensaio para mudanças na distribuição do receptor entre organelos. Para proteínas com maiores níveis de expressão na PM, estudos SEP base de epi-fluorescência são suficientes para medir as mudanças na expressão do receptor. No entanto, os eventos individuais de inserção vesícula que também são mensurados ao pH 7,4 requerem TIRFM. A explosão de fluorescência correspondente à vesícula de baixo pH o tráfico de fusão com a membrana plasmática de pH mais elevado ao mesmo tempo facilmente visto em TIRFM é tipicamente ausentes em epi-fluorescência.
Incorporando setembro com TIRF Condições da imagem latente
Setembro pode ser geneticamente incorporada no domínio extracelular de uma proteína de membrana. Devido ao tamanho e localização de setembro, é crítico para verif Y que a proteína modificada não diferem significativamente em função do tráfico ou de uma proteína do tipo selvagem. Os ensaios devem ser realizados utilizando o setembro proteína marcada para verificar que a incorporação da etiqueta não interromper a atividade. Para os canais de iões, electrofisiologia e de permeabilidade iónica medições são ideais, enquanto que para outros receptores de ligação ao ligando fluorescente e Western blotting pode ser utilizado para verificar o tráfico. As células aderentes são idealmente adequados para a transfecção com os reagentes de transfecção comerciais e imagiologia com TIRFM porque eles ligam directamente para o fundo da placa de vidro. Este acessório é necessário para assegurar TIRF excitação por onda evanescente dentro de cerca de 150 nm a partir da interface da amostra de vidro. Para conseguir imagens TIRF de alta resolução, a amostra deve permanecer plana durante o exame 21. revestimento de poli-D-lisina é benéfico na obtenção de imagens de células N2a porque fornece uma matriz anexo que minimiza os movimentos de células para manter uma superfície planalass = "xref"> 7. A densidade de plaqueamento de células tem de ser optimizada para garantir as células são isoladas sobre o prato de vidro para atingir TIRF. agrupamento celular impede a reflexão interna total, impedindo a aderência de células plana num plano óptico. Como apenas um avião está focada em TIRF, mantendo a morfologia das células adequado é crucial para a imagem latente. Isto é particularmente importante quando as soluções estão a ser trocado nos estudos SEP. Para minimizar as alterações morfológicas, imagens em pH 7,4 e pH 5,4 precisam ser recolhidos rapidamente. Além disso, o ECS (pH 5,4), eventualmente permear membranas intracelulares, alterar a estrutura e organela de fluorescência de receptores internos SEP-rotulados. Isto é facilmente evitada através da recolha de imagens em cada condição de pH dentro de alguns minutos. Os dados de pratos múltiplos na mesma sessão de imagem podem ser combinados para aumentar o número de células analisadas. Ao mudar soluções, remova cuidadosamente a solução pH 7,4 ECS com uma pipeta e adicionar pH 5,4 ECS gota a gota em tele prato. A remoção ou adição de uma solução muito rapidamente pode enfatizar as células ou mover o prato em relação às posições de fase guardados. Um sistema de perfusão de soluções de troca podem também ser utilizados, desde que a troca da solução é completa e ocorre rapidamente. concentrações de sal exacta em cada solução são necessárias para minimizar as distorções de células. Uma incubadora estágio superior podem ser incorporados para reduzir as flutuações da temperatura durante a imagem latente.
TIRF imagem
imagem TIRF reduz a fluorescência de fundo, concentrando-se em um único plano óptico. Isto aumenta a relação sinal-ruído de fluoróforos selectivamente excitantes dentro de aproximadamente 150 nm a partir da interface da amostra de vidro 21, 22. Dentro desta região, a resolução é grandemente aumentada, particularmente na membrana do plasma. Isto é necessário se a maioria dos receptores estão localizados intracelularmente. Se uma fracção elevada de receptores de membrana élocalizada na membrana plasmática, esta abordagem baseada setembro pode ser utilizado para determinar a localização subcelular de epifluorescência. No entanto, se uma pequena percentagem de receptores totais são de tráfico para a membrana de plasma, como acontece com os nAChRs, TIRFM é necessário para quantificar as alterações na fluorescência dependente do pH na membrana plasmática. Além disso, TIRFM permite a resolução de eventos individuais tráfego de vesículas e da distribuição de receptores dentro da via secretora. Uma configuração básica TIRF emprega um laser de 488 nm para DPSS setembro de excitação, fibra acoplada a um motor passo a passo para ajustar o ângulo crítico do feixe de excitação. Para atingir TIR, o feixe é traduzido lateralmente através da abertura traseira do objectivo, até um ângulo crítico é atingido. As células são fotografadas utilizando um ou 60X 100X, 1,49 NA objectiva de imersão em óleo. Uma abertura numérica mais elevada do que o índice de refracção da amostra (> 1,38 para as células) é necessária para atingir o ângulo crítico necessário para TIRF. A NA objetivo 1,45 seria suficiente, mas 1,49NA é mais prático ao manipular o ângulo de excitação. Emissão é detectada usando um dispositivo acoplado carga de multiplicação de elétrons (EMCCD) com uma série de 8 milímetros com 512 x 512 pixels. Utilizando uma objectiva de 60X, várias células isoladas pode ser capturado dentro de um campo de visão.
Uma das principais desvantagens para fluorescência com base estudos de expressão de proteína é de 15 a fotodegradação. Esta excitação induzida decomposição dos resultados fluoróforo numa diminuição irreversível na intensidade de fluorescência ao longo do tempo. Por esta razão, uma imagem com qualidade depende de um equilíbrio delicado entre a intensidade do feixe de excitação e on-chip ganho utilizado dentro do EMCCD. A intensidade de excitação tem de ser elevada o suficiente para excitar um fluoróforo para a detecção, mas não tão alta como para a molécula de photobleach rapidamente. o ganho da câmara pode ser usado para multiplicar o sinal de detecção, em oposição ao aumento da intensidade de excitação, mas isto também aumenta no fundotensity. Além disso, é preciso ter cuidado ao escolher as configurações de ganho EM, para evitar a saturação das imagens. Em entre medições, bloqueando o feixe de excitação antes de atingir a amostra minimiza fotobranqueamento. Isto é necessário quando a recolher imagens de células em um ECS de pH 7,4 para comparar com pH 5.4. Fotobranqueamento que ocorre entre as duas imagens é indistinguível de uma falta de fluorescência devido à alteração do pH, de modo que este efeito tem de ser minimizado. Cuidados devem ser tomados para usar baixa potência do laser e para expor o celular apenas para a duração necessária para capturar as imagens necessárias. Para cada experiência, uma série de células pode ser medida a pH 7, sob condições idênticas de imagem como um controlo. Utilizar sem intervalo e expondo durante um período correspondente ao tempo de exposição necessário para a realização do ensaio proporciona um controlo para determinar a extensão da fotodegradação. Se fotobranqueamento é maior do que 10% da intensidade original, uma curva de correcção pode ser utilizado a partir do rato fotobranqueamento observadae através da recolha de um traço do tempo de intensidade de fluorescência. Para eventos de inserção vesículas individuais, receptores SEP-rotulados de tráfico de vesículas não está animado até que a fusão com a membrana plasmática, seja porque o pH determina um estado desligado ou que estão fora da região de TIRF de excitação. Portanto, setembro etiquetado receptores não photobleach até a inserção, o que permite maior potência de excitação a ser utilizado, a fim de detectar moléculas individuais SEP.
Em conclusão, esta técnica pode ser utilizada com uma variedade de tipos de células aderentes. Setembro pode ser incorporado em praticamente qualquer proteína de membrana, desde que a função da proteína e propriedades de tráfico são mantidas. TIRF aumenta a resolução na membrana plasmática. Setembro permite a diferenciação de proteínas marcadas localizados na membrana plasmática de aqueles dentro do retículo endoplasmático periférica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm2 | VWR | 82050-856 | |
| 35 mm glass bottom Petri dishes, sterile | Cell E&G | GBD00002-200 | |
| Poly-D-lysine | vwr | 215017510 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Fisher Scientific | 11-965-084 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco / Fisher Scientific | 31-985-088 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered) | Gibco / Fisher Scientific | 16-000-044 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Fisher Scientific | 12604-021 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | VWR | 45000-652 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco / Fisher Scientific | 21083027 | Optional |
| Lipofectamine | Fisher Scientific | 11668030 | Gently mix; Do not vortex |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-10 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Objective immersion oil | Olympus | Type F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Microscope | Olympus | IX81 | |
| Camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 60X, 1.49 NA oil immersion objective | Olympus | APON 60XOTIRF | |
| Motorized stage | Prior | IXPROXY | |
| Motorized actuator (stepper motor) | Thorlabs | ZST213 | |
| MetaMorph (or other imaging program) | Metamorph | ||
| 488 nm laser | Market Tech | ||
| Single mode fiber | Thorlabs | SM450 | |
| Mirrors | Thorlabs | BB1-E01 | |
| Dichroic 488 nm LP | Semrock | Di02-R488-25x36 | |
| Bandpass filter, 488 nm | Semrock | LL01-488-12.5 | |
| Bandpass filter, 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 |
References
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