Summary
Mærkning det ekstracellulære domæne af et membranprotein med en pH-følsom fluorophor, superecliptic pHluorin (SEP), giver mulighed for subcellulære lokalisering, udtryk, og menneskehandel, der skal fastlægges. Imaging SEP mærkede proteiner med total indre refleksion fluorescensmikroskopi (TIRFM) gør kvantificeringen af proteinniveauer i det perifere ER og plasmamembranen.
Abstract
Forståelse membranprotein menneskehandel, montage og udtryk kræver en tilgang, der skelner mellem dem, der bor i intracellulære organeller og dem lokaliseret på plasmamembranen. Traditionelle fluorescens-baserede målinger mangler evnen til at skelne membranproteiner bosiddende i forskellige organeller. Cutting edge metoder transcendere traditionelle metoder ved at koble pH-følsomme fluoroforer med total intern refleksion fluorescensmikroskopi (TIRFM). TIRF belysning exciterer prøven op til ca. 150 nm fra glasset-prøve-grænsefladen, således formindsker baggrund, hvilket øger signal-til-støj-forhold, og forbedret opløsning. Excitation volumen i TIRFM omfatter plasmamembranen og nærliggende organeller såsom den perifere ER. Superecliptic pHluorin (SEP) er en pH-følsom version af GFP. Genetisk koder september i det ekstracellulære domæne af en membran protein af interesse positionerer fluorofor påden luminale side af ER og i den ekstracellulære region af cellen. SEP fluorescerende, når pH er større end 6, men forbliver i en slukket tilstand ved lavere pH-værdier. Derfor receptorer tagget SEP fluorescerer det indgår i det endoplasmatiske reticulum (ER) eller ved indsætning i plasmamembranen (PM), men ikke når begrænset til en trafficking vesikel eller andre organeller, såsom Golgi. Den ekstracellulære pH kan justeres til at diktere fluorescensen af receptorer på plasmamembranen. Forskellen i fluorescens mellem TIRF billeder ved neutral og sur ekstracellulære pH-værdi for den samme celle svarer til en relativ antal receptorer på plasmamembranen. Dette muliggør en samtidig måling af intracellulære og plasmamembran-residente receptorer. Enkelt vesikel insertionstilfælde kan også måles, når den ekstracellulære pH er neutral, hvilket svarer til en lav pH trafficking vesikel fusionere med plasmamembranen og ved at overgå til en fluorescerende tilstand. Denne versatile teknik kan udnyttes til at studere lokalisering, udtryk, og handel med membranproteiner.
Introduction
Ændringer i receptorekspression, distribution, og samling er forbundet til en lang række sygdomme, herunder Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, cystisk fibrose og narkotikamisbrug 1, 2, 3, 4, 5. For eksempel nikotin og andre nicotiniske ligander påvirke handel med nikotinacetylcholinreceptorer (nAChRs), der fører til ændringer i handel, ekspression, og opregulering 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Nikotin øger det totale antal af samlede nAChR'er i en celle, øger handel mod plasmamembranen, end ændrer samling af underenheder til at favorisere en høj følsomhed version af nogle undertyper. Løsning tydelige ændringer i menneskehandel, montage og udtryk af receptorer i en sygdom model giver afgørende mekanistiske detaljer, der er vigtigt at definere drug targets. En ideel fremgangsmåde ville hurtigt skelne mellem intracellulære receptorer og dem lokaliseret på plasmamembranen. Dette er en særlig udfordring i de tilfælde, hvor et flertal af et bestemt protein bosat intracellulært, såsom med nAChR'er. Da hovedparten af nAChR'er er lokaliseret til det endoplasmatiske reticulum, traditionelle målinger mangler den spatio-temporale opløsning nødvendigt at lokalisere lokaliserings- og trafficking ændringer langs den sekretoriske pathway. Receptor menneskehandel og udtryk studier af nAChR'er er primært udført ved hjælp af radioligandbinding 11, biotinyleringsbetingelserne analyser 12, western blotting 13, eller immunopræcipitering Techniq dier 12. Disse afhænger af bindingsspecificiteten af et reportermolekyle eller fiksering af celler og mangler evnen til samtidigt skelne mellem plasmamembranen hjemmehørende og intracellulære receptorer. Derfor har undersøgelser af ion-kanal montage og vesikel dynamik stort set påberåbt lav gennemløb elektrofysiologiske teknikker 14.
Superior rumlig og tidsmæssig opløsning er muligt med fremskridt inden for fluorescens mikroskopi. Genetisk indkodede reportermolekyler, såsom grønt fluorescerende protein (GFP) og dens varianter, fjerne uspecifik binding spørgsmål og øge følsomheden 15. En pH-følsom variant af GFP, kendt som superecliptic pHluorin (SEP), kan anvendes til at udnytte iboende pH forskelle mellem rum i en celle for at bestemme lokalisering 5, 7, 8,ref "> 9, 16, 17, 18. september fluorescerer, når pH er højere end 6, men forbliver i en slukket tilstand ved lavere pH. Derfor er receptorer tagget SEP på deres luminale side detekteres, når til stede i det endoplasmatiske reticulum ( ER) eller ved insertion i plasmamembranen (PM), men ikke når begrænset til en trafficking vesikel. Manipulation af den ekstracellulære pH i kontakt med receptorer på plasmamembranen følgelig ændrer fluorescens og derfor påvisning af disse receptorer. Hvis den samme celle sekventielt afbildet ved både en neutral ekstracellulært pH og derefter en pH-værdi under 6, er forskellen mellem billederne tilskrives receptorer placeret på plasmamembranen. Dette muliggør en samtidig måling af intracellulær (perifer eR) og plasmamembranen residente receptorer 5, 7, 8 p>, 9. Enkelt vesikel indsættelse begivenheder kan også løses, når den ekstracellulære pH er neutral. Når en lav pH trafficking beholderen fusionerer med plasmamembranen, er den luminale side af vesiklen udsat for neutral ekstracellulære opløsning, hvilket medfører en overgang detekteres som en byge af fluorescens 7, 18, 19, 20. September muliggør måling af receptorer lokaliseret til plasmamembranen og perifer endoplasmatiske reticulum, og tilvejebringer et middel til at måle handel med receptorer mellem disse subcellulære områder 5, 7, 18.
For at opnå højere opløsning på plasmamembranen, er en receptor SEP genetisk kodet afbildet af total intern refleksion fluorescens mikroskopi (TIRFM). Denne fremgangsmåde er isærnyttigt, hvis flertallet af receptorer er lokaliseret til intracellulære regioner, da TIRFM øger synligheden af plasmamembranen. TIRFM giver også løsningen af menneskehandel dynamik enkelte vesikler bærer SEP mærkede receptorer ved indsættelse i PM. Intern refleksion samlede forekommer ved grænsefladen af materialer med forskellige brydningsindekser, såsom mellem en celle og et glas dækglas 21, 22. September fluorescerer, når de bestråles med 488 nm excitation, der er orienteret til at opnå total intern refleksion ved grænsefladen af glasset og celle opløsning. Dette giver en kortvarig bølge, der trænger ca. 150 nm i prøven, kun spændende fluoroforer inden for dette volumen. Kun september indeholder receptorer i en neutral pH miljø inden for dette område af excitation opdages, svarer til dem, der bor på plasmamembranen eller perifere endoplasmatiske reticulum. Fra detektering er begrænset to excitation af den kortvarige bølge, baggrund fluorescens fra intracellulære område reduceres, og signal-støjforhold forøges 21, 22. Eftersom stråling trænger ikke hovedparten af cellen, er fotobeskadigelse minimeret som tillader levende celler i løbet af tiden. Som et resultat, TIRFM kombineret med genetisk kodet september giver den høje opløsning og følsomhed for at måle subcellulære lokalisering og trafficking dynamik membranreceptorer langs den sekretoriske pathway.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Culture og transfektion
- Bevar mus neuroblastom 2a (N2A) celler i vækstmedier.
- Gør 500 ml N2A vækstmedier fra 200 ml Dulbeccos Eagle medium (DMEM) med højt glucoseindhold, 250 ml reduceret serum media, 50 ml føtalt bovint serum (FBS) og 5 ml penicillin / streptomycin (100x).
- Opretholde celler i en T75-kolbe ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator.
- Split celler 1:15 når det er nødvendigt, eller på ca. 80-90% sammenflydning. Dette er typisk 2-3 gange om ugen.
- Coat 35 mm glasbund skål med poly-D-lysin.
- I en laminar strømning biosikkerhed kabinet, der tilsættes 200 pi 0,1 pg / ml poly-D-lysin på glas bundområde sterilt 35 mm skål.
- Placer skålen i en 37 ° C inkubator i 1 time.
- Skyl forsigtigt fad med Hedeselskabet 2 O 3-4 gange.
- Tillad retter til helt tørre i mere end 1 time.
- Sterilize retter med UV-lys i biosikkerhed kabinettet, hvis det er nødvendigt.
- Plate N2A celler til TIRFM billeddannelse.
- Fjern vækstmedier fra adhærente celler.
- Frigøre celler fra kolben ved inkubation med 1 ml 1x trypsin (+ EDTA) i 5 minutter ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator.
- Inaktivere trypsin ved tilsætning 9 ml vækstmedier. Bland medier, trypsin og fritliggende celler ved hjælp af en pipette.
- tæller visuelt celler under anvendelse af et hæmocytometer og beregne den korrekte mængde for at tilføje 90.000 celler til hver poly-D-lysin belagt glas bund skålen. Denne tæthed er påkrævet for effektiv transfektion og enkelt celle TIRF billeddannelse.
- Tilsæt 2 ml vækstmedier til hver glasbund skål indeholdende 90.000 celler.
- Inkubér fadet ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator i 16-24 timer.
- N2A transfektion
- Opnåelse af et plasmid konstruktion indeholdende en september fluorophor inkorporereti det ekstracellulære område af proteinet af interesse. Standard kloningsteknikker, såsom PCR-amplifikation 5 kan anvendes til at generere konstruktionen.
BEMÆRK: Sep bør inkorporeres i den ekstracellulære region af membranproteinet så den er placeret inden i lumenet af det endoplasmatiske reticulum eller trafficking vesikler og udsættes for ekstracellulær opløsning når på plasmamembranen. SEP svarer i størrelse til kan anvendes GFP og lignende kloningsstrategier. - Erstat vækstmedierne på udpladede celler med 1,5 ml reduceret serum medier (f.eks, Opti-MEM), ca 30 min før tilsætning af transfektionsreagens.
BEMÆRK: For at studere medicin inducerede ændringer i receptorer, kan en passende koncentration af lægemiddel tilsættes på tidspunktet for transfektion. - Tilføj 500 ng af hver ønsket plasmidkonstruktion til 250 pi reduceret serum media (rør 1).
- Tilsæt 2 pi af transfektion reagens til et separat rør containing 250 pi af reducerede serum medier. Inkuber røret 2 ved stuetemperatur i 5 min. Forholdet mellem transfektionsreagens til plasmid DNA bør optimeres til at udtrykke hvert protein af interesse.
- Kombiner rør 1 og 2 for at gøre en opløsning indeholdende 500 pi transfektionsreagens og plasmid mix. Der inkuberes ved stuetemperatur i 25 min.
- Tilsæt 500 pi transfektion mix at pre-belagte celler til et samlet volumen på 2 ml pr skål.
- Cellerne inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator i 24 timer.
- Efter 24 timer, fjerne transfektion mix og skyl cellerne med vækstmedier og derefter tilsættes 2 ml vækstmedie til hver skål.
BEMÆRK: Hvis et lægemiddel blev tilsat på tidspunktet for transfektion kan det genopfyldes igen på dette trin. - Cellerne inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator i 24 timer.
- Billedceller 48 timer efter transfektion.
- Opnåelse af et plasmid konstruktion indeholdende en september fluorophor inkorporereti det ekstracellulære område af proteinet af interesse. Standard kloningsteknikker, såsom PCR-amplifikation 5 kan anvendes til at generere konstruktionen.
2. Levende Cell Imaging af Total Inekstern Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM)
- Imaging oprettet
- Udfør billeddannelse med en omvendt fluorescensmikroskop set-up med en scanning stadium som vist i figur 1. Dette kræver tilpasning af en 488 nm DPSS laserkilde, at en stepmotor justere 488 nm stråle position, og en høj numerisk apertur (1,49 NA) 60X eller 100X oliebestandighedsobjektets.
- Passerer laserstrålen gennem passende excitationsfilter (bandpass 488/10 nm). Juster polariserede laserstråle gennem en enkelt fiber tilstand forbundet til en løfteraket monteret på en stepmotor. I epifluorescens modus excitationsstrålen centreret i midten af ryggen åbning af målet.
- At opnå TIRF bruge stepmotor til at oversætte den fokuserede laserstråle tværs over ryggen åbning af objektivlinsen indtil den kritiske vinkel er nået, og strålen ikke længere transmitteres gennem prøven og stedet totalt reflekteret fra glas-cell interface.
- Tag billeder med en EMCCD (512 x 512 pixels) kontrolleret med imaging software (f.eks Metamorph) med den passende emission filter monteret i emission vejen (525/50 nm).
- Forbered imaging løsning
- Forbered 200 ml ekstracellulær opløsning (ECS) ved blanding af 150 mM NaCl, 4 mM KCI, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM HEPES og 10 mM glucose i Hedeselskabet 2 O. Stamopløsninger af NaCl, KCI, MgCl2, og CaCl2 kan være forberedt på forhånd og kombineret med friske HEPES og glukose på dagen for billeddannelse.
- Justere pH af en opløsning indeholdende 100 ml ECS til pH 7,4. Juster de resterende 100 ml ECS til en pH på 5,4. Skyl de transficerede celler med 2 ml ECS (pH 7,4).
- Tilsæt 2 ml ECS (pH 7,4) til de transficerede celler før billeddannelse.
- Levende cell imaging i TIRF
- Tænd for hele systemet, including 488 nm laser, kamera, oversættelse etape, og billedbehandling program. Fokuser epifluorescens stråle og justere magt til ca. 1 mW på 60X mål.
- Tilsæt olie til målet og placere en skål af transfekterede celler på oversættelsen scenen. Fastgør skålen på plads ved hjælp af fase mounts at sikre, at det ikke bevæger sig i forhold til scenen, så cellerne kan afbildes flere gange.
- I epifluorescens tilstand, fokus mikroskopet og find de fluorescerende, transfekterede celler. Celler vil fortsat fokusere på flere indsatsområder fly. Find enkelt, isolerede celler til at fortsætte med TIRF.
- I billedbehandlingsprogram, indstille eksponeringen tid til 200 ms og optimere fluorescens intensitet ved at indstille EM gevinst.
- Overgangen laserstrålen i TIRF ved at oversætte strålen på tværs af målet på en trinvis måde ved anvendelse stepmotoren. Som den kritiske vinkel tilgange, vil strålen synligt oversætte tværs af kanten af skålen, indtil det konvergerer på the punkt i total intern refleksion på prøven flyet.
- Kontroller, at cellerne er i TIRF tilstand ved at justere grebet fokus. I TIRF, kan kun et plan af celler være fokuseret (dvs. ca. 150 nm fra glas-interface), der producerer en meget defineret billede med høj opløsning på plasmamembranen.
- Imaging SEP til bestemme subcellulære lokalisering
- Find sunde, transfekterede, enkelte celler i billedplanet.
- Anskaf et fokuseret billede af celle ved pH 7,4. September mærkede receptorer på plasmamembranen og endoplasmatisk reticulum skal være synlig.
- Hurtigt blokere laserstrålen i at nå prøven for at forhindre fotoblegning.
- Huske scenen positioner svarende til hver celle ved hjælp af mikroskop imaging software kan optage flere xy steder.
- Gentag trin 2.4.1-2.4.4 i 20-30 celler pr skål med brug af softwaren til at registrere positionen af hver celle.
- After alle celle billeder ved pH 7,4 opsamles, udtages manuelt pH 7,4 ECS løsning med en pipette. Rør ikke ved fadet, da dette kunne flytte de lagrede fase positioner.
- tilsættes forsigtigt 2 ml pH 5,4 ECS til fadet og vente 10 min. I løbet af denne tid, gemme tidligere erhvervede billeder.
- Under identiske sæt af betingelser, der anvendes til at indsamle billeder ved pH 7,4, flytte scenen til hver gemte position og erhverve et billede af den samme celle ved pH 5,4. Cellerne skal se mindre defineret, da alle registreres fluorescens stammer fra endoplasmatisk reticulum begrænset september mærkede receptorer. Gem pH 5.4 celle billeder.
- Imaging enkelt vesikel indsættelse begivenheder i levende celler
- Erstat vækstmedier af transficerede celler med 2 ml pH 7,4 ECS eller med Leibovitz L-15 medie. PH af Leibovitz L-15 medium er CO 2 uafhængige, så billeddannelse finder sted over en lang periode, hvis det er nødvendigt.
- place fadet af transficerede celler på scenen af mikroskopet. Sikker og fokusere en enkelt celle i TIRF efter Trin 2.3 ovenfor.
- Hvis udstyret, skal du indstille autofokus så fokus ikke glider over den periode, billeddannelse.
- Optag en serie af 1.000 frames, kontinuerligt optager billeder på en ramme på 200 ms. Byger af fluorescens vil være synlig i denne periode, svarende til en lav pH trafficking vesikler fusing med plasmamembranen, udsætter SEP til det ekstracellulære pH 7,4.
- Find en anden enkelt celle og gentag ovenstående trin. Nulstil autofokus om nødvendigt.
3. Billedanalyse og Data Processing
- Analysere september fluorescens til at bestemme subcellulære lokalisering
- Åbn celle billeder ved hjælp af et billede analyse software såsom Metamorph eller ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). Træk baggrunden fra både pH 5,4 og pH 7,4 billeder ved hjælp af rullende bolden indstilling.
- Brug en intensitet baseret tærskel at kvantificere fluorescens fra en enkelt celle. Vælg manuelt et område af interesse omkring celle i pH 7,4 billedet.
- Mål celle område, betyder intensitet, og integreret tæthed ved hjælp af en plugin i ImageJ eller bruge den indbyggede "Measure" funktion under fanen Analyser.
- Gentag trin 3.1.1-3.1.3 for samme celle ved pH 5,4, omhyggelig indstilling af intensiteten baseret tærskel og området af interesse på den samme måde.
- Efter den integrerede tæthed opnås for celle billeder på både pH 7,4 og 5,4, beregne plasmamembranen integrerede tæthed ved at trække pH 5,4 værdien fra pH 7,4 værdi. Forskellen svarer til det relative antal receptorer på plasmamembranen i TIRF excitation region.
- Som et mål for menneskehandel, beregne den relative procentdel SEP mærkede receptorer placeret på plasmamembranen i forhold til de resterende receptorer synlige i TIRF excitatipå volumen ved at dividere plasmamembranen integrerede tæthed af den samlede integrerede tæthed ved pH 7,4, multipliceret med 100.
- Analyse enkelt vesikel insertionstilfælde
- Åbn serie af 1.000 tiff billeder ved hjælp af billedanalyse software. Træk baggrunden fra alle rammer ved hjælp af rullende bolden indstilling.
- Justerer farvebalancen af optagelsen for at maksimere intense regioner svarende til vesikel indsættelse begivenheder. Manuelt tælle byger af fluorescens varede længere end 3 rammer (> 600 ms).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
September inkorporering i en receptor tillader direkte påvisning af denne receptor i en levende celle. Kombineret med TIRFM, dette tillader evalueringen af de relative ekspressionsniveauer på plasmamembranen og fordelingen af receptorer inden for de subcellulære steder i regionen TIRF excitation. Enkelt vesikel menneskehandel begivenheder kan også løses.
Relative ekspressionsniveauer SEP-mærkede receptorer på plasmamembranen
September fluorescens efter excitation er dikteret af pH af den omgivende opløsning. Når SEP fusioneres med plasmamembranen residente receptorer, kan den ekstracellulære pH manipuleres til at slå denne fluorescens til eller fra 5, 7, 8, 9, 17. Når the pH af den ekstracellulære opløsning er en fysiologisk 7,4, receptorer fra både plasmamembranen og det endoplasmatiske reticulum i samme region som TIRF excitation fluorescerer. Den ekstracellulære opløsning kan derefter udskiftes med et i øvrigt identisk opløsning med pH 5,4. Dette bevirker, at plasmamembranen bosiddende SEP til overgangen til en slukket tilstand, hvilket betyder alle observerede fluorescens er nu fra det endoplasmatiske reticulum. Figur 2 viser et eksempel på celler afbildet ved både pH 7,4 (A) og pH 5,4 (B). Det relative antal receptorer på plasmamembranen forhold til den perifere endoplasmatisk reticulum inden for regionen af TIRF excitation beregnes derefter matematisk ved at trække den integrerede tæthed af fluorescensen ved pH 5,4 fra ved pH 7,4, vist i figur 2C. Denne beregnede plasmamembranen integreret tæthed svarer til det relative antal SEP-mærkede receptorer placeret på plasmamembranen og i TIRF excitationbind. Da plasmamembranen og nærliggende perifere endoplasmatisk reticulum er ved at blive fortrinsvis ophidset med TIRF, denne subcellulære fordeling sammenligning er mellem receptorer lokaliseret til disse regioner, og ikke hele intracellulære område af cellen.
Subcellulær Distribution SEP-mærkede receptorer
Handel med receptorer kan måles ved at sammenligne forholdet mellem receptorer på plasmamembranen i forhold til det endoplasmatiske reticulum. Opdeling plasmamembranen integrerede tæthed af den samlede integrerede tæthed ved pH 7,4, multipliceret med 100, giver en relativ procentdel SEP-mærkede receptorer placeret på plasmamembranen 5, 7. Som en kontrol, brefeldin A kan sættes til celler for at forstyrre intracellulært protein trafficking. Når brefeldin A er til stede, stort set alle de detekterede receptors inden for regionen af TIRF excitation vil være begrænset til det endoplasmatiske reticulum, hvilket resulterer i en lavere% PM. Derudover kan muteret (Δ508-I539T) cystisk fibrose transmembranregulator (Δ508-I539T-CFTR) anvendes som en positiv kontrol. I nærvær af kommercielt tilgængelige VX-809, Δ508-I539T-CFTR-ekspression på celleoverfladen, stiger 2 til 3 gange.
Single vesikel Insertion Begivenheder
September ikke fluorescerer eller photobleach i den lave pH i en transport vesikel, men genvinder fluorescens ved udsættelse for et ekstracellulært pH 7,4 ved plasmamembranen 7, 16, 18. Insertionstilfælde visualiseres som et udbrud af fluorescens ved plasmamembranen varer mindst 3 rammer (600 ms), svarende til fuld fusion af transporten vesikel i plasmamembranen, som vist i figur 3. Før en insertion (figur 3B), ikke mærkbar burst er til stede. En stigning i fluorescensintensitet ses som transport vesikel ankommer (figur 3C), diffunderer hen over membranen (figur 3D - 3G), indtil inkorporering i hovedparten fluorescensen af cellen (figur 3H - 3I).
Figur 1: Skematisk af TIRF Microscope. Denne TIRF setup anvender en 488 nm DPSS laser til september excitation, fiber koblet til en stepmotor til at justere den kritiske vinkel af excitationsstrålen ved at oversætte strålen tværs over ryggen åbning af målet. Celler afbildes under anvendelse af en 60X, 1,49 NA oliebestandighedsobjektets. Emission detekteres ved anvendelse af en elektron-multiplikation charge coupled device.filer / ftp_upload / 55.466 / 55466fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Expression og handel på plasmamembranen. En N2A celle, der udtrykker α3-Sep / β4-wt nAChRs ved pH 7,4 (A) viser receptorer placeret på plasmamembranen og endoplasmatiske reticulum. Ved pH 5,4 (B), har receptorer på plasmamembranen ikke fluorescerer, så kun de endoplasmatisk reticulum residente receptorer er synlige. Forskellen mellem integrerede tæthed ved pH 7,4 og pH 5,4 (C) svarer til receptorer lokaliseret til plasmamembranen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Single vesikel Indsættelse Event. En N2A celle, der udtrykker α3 Sep / p4-wt nAChRs med et ekstracellulært pH 7,4 er vist i (A). Umiddelbart forud en insertion (B), ingen burst af fluorescens er synlig. En handel vesikel bærer september ankommer (C) og SEP-mærkede receptorer diffundere over plasmamembranen (D - G), indtil skelnes fra tidligere indsatte receptorer (H - I). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PH følsomhed SEP muliggør receptorer bosiddende på plasmamembranen skal adskilles fra intracellulære receptorer i det endoplasmatiske reticulum, og det kan bruges til at løse insertionstilfælde af receptor-bærende vesikler 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 . Adskillige teknikker, herunder overflade biotinylering og ligandbinding er almindeligt anvendt til at måle proteinoverfladen niveauer. I nogle tilfælde kan western blots også anvendes til at skelne mellem ER og PM resident protein. Dette SEP baseret teknik er komplementær til traditionelle målinger, hvilket giver en hurtig udlæsning af overfladeekspression og evnen til at kvantificere ændringer i protein lokaliseret på ER til PM. Siden sep er genetisk kodet i proteinet af interesse, problemer med nonspecifikke binding fjernes, og følsomheden øges. September undergår 488 nm excitation ved neutral pH, men er ikke spændt under sure betingelser for pH <6. Når den ekstracellulære pH er 7,4, er fluorescens målt for nAChR'er bopæl i det endoplasmatiske reticulum og på plasmamembranen, men ikke for dem i de lavere pH-sekretoriske vesikler eller Golgi (pH <6) 23. Under billedbehandling, er ECS af pH 7,4 ombyttet med et i øvrigt identisk opløsning ved pH 5,4. Forskellen mellem den integrerede tæthed i disse billeder er plasmamembranen integrerede tæthed af en celle. Dividere dette tal med den samlede integrerede tæthed inden for regionen af TIRF excitation, ved pH 7,4, multipliceret med 100, giver den procentdel på plasmamembranen 5, 7, 8, 9. Mens disse undersøgelser anvendte TIRFM, kan udføres tilsvarende analyser ved hjælp epi-fluorescens.For membranreceptorer som nAChR hvor et flertal af receptorer bor i ER, TIRM er ideel, fordi den smalle excitation volumen øger den del af synlige PM bosiddende receptorer versus intracellulære receptorer. Dette øger følsomheden af analysen til forskydninger i receptor fordelingen mellem organeller. For proteiner med højere ekspressionsniveauer på PM, epi-fluorescens baseret SEP undersøgelser er tilstrækkelige til at måle ændringer i receptorekspression. Men enkelt vesikel indsættelse begivenheder som også målt ved pH 7,4 kræver TIRFM. Burst af fluorescens svarende til den lave pH trafficking vesikel fusionere med den højere pH plasmamembranen mens let ses i TIRFM typisk ikke skelnes i epi-fluorescens.
Omfattende SEP TIRF Imaging Betingelser
September kan være genetisk inkorporeret i det ekstracellulære domæne af et membranprotein. På grund af størrelsen og placeringen af SEP er det vigtigt at verif y at det modificerede protein ikke signifikant forskellig i handelen eller funktion fra et vildtype-protein. Analyser skal udføres ved hjælp SEP mærkede protein for at kontrollere, at inkorporering af etiketten ikke forstyrre aktivitet. For ionkanaler, elektrofysiologi og ionpermeabilitet målinger er ideelle, mens der for andre receptorer fluorescerende ligandbinding og western blotting kan anvendes til at verificere trafficking. Vedhæftende celler er velegnet til transfektion med kommercielle transfektionsreagenser og billeddannelse med TIRFM fordi de tillægger direkte til glasbund fad. Denne vedhæftede fil er nødvendig for at sikre TIRF excitation af den kortvarige bølge inden for omkring 150 nm fra glasset-prøven interface. For at opnå høj opløsning TIRF billeder, prøven skal forblive fladt under billedbehandling 21. Poly-D-lysin belægning er nyttigt, når billeddannelse N2A celler, fordi det giver en vedhæftet fil matrix, minimerer celle bevægelser for at opretholde en flad overfladelass = "xref"> 7. Klædningen celledensitet skal optimeres for at sikre celler isoleres på glasset skålen at opnå TIRF. Celle clustering hæmmer total intern refleksion ved at forhindre flad cellevedhæftning i et enkelt optisk plan. Da kun ét plan er fokuseret i TIRF, er afgørende for billeddannelse opretholde korrekt cellemorfologi. Dette er især vigtigt, når løsninger bliver udvekslet i SEP studier. For at minimere morfologiske ændringer, motiver ved pH 7,4 og pH 5,4 nødvendigt at indsamle hurtigt. Desuden vil ECS (pH 5,4) til sidst gennemtrænge intracellulære membraner, ændring organel struktur og fluorescens af interne SEP mærkede receptorer. Dette kan let undgås ved at indsamle billeder under hver pH tilstand i løbet af få minutter. Data fra flere retter i samme imaging session kan kombineres for at øge antallet af analyserede celler. Når du skifter løsninger, forsigtigt fjerne pH 7,4 ECS løsning med en pipette og tilsæt pH 5,4 ECS dråbevis i than parabol. Fjerne eller tilføje opløsning for hurtigt kan stresse cellerne eller flytte skålen med hensyn til de gemte stage positioner. En perfusion system til udveksling af løsninger kan også anvendes, så længe opløsningen udveksling er komplet og forekommer hurtigt. Nøjagtige saltkoncentrationer i hvert løsning er forpligtet til at minimere celle forvridninger. Et stadium top inkubator kan inkorporeres at reducere svingninger i temperatur under billeddannelse.
TIRF Imaging
TIRF billedbehandling reducerer baggrundsfluorescens ved at fokusere på en enkelt optisk plan. Dette øger signal-støj-forhold ved selektivt spændende fluoroforer inden for ca. 150 nm fra glasset-prøve-grænsefladen 21, 22. Inden for denne region, er opløsning stærkt forøget, især ved plasmamembranen. Dette er nødvendigt, hvis et flertal af receptorer er lokaliseret intracellulært. Hvis en høj brøkdel af membranreceptorer erplaceret på plasmamembranen, kan denne september tilgang anvendes til at bestemme subcellulær lokalisering i epifluorescens. Men hvis en lille procentdel af de samlede receptorer smugles til plasmamembranen, som med nAChRs, TIRFM er nødvendigt at kvantificere pH-afhængig ændringer i fluorescens ved plasmamembranen. Også TIRFM tillader opløsningen af enkelte vesikel menneskehandel begivenheder og distribution af receptorer i den sekretoriske pathway. En grundlæggende TIRF setup anvender en 488 nm DPSS laser til september excitation, fiber koblet til en stepmotor til at justere den kritiske vinkel af excitationsstrålen. For at opnå TIR, er strålen oversat lateralt tværs over ryggen åbning af målsætningen indtil en kritisk vinkel er nået. Celler afbildes under anvendelse af en 60X eller 100X, 1,49 NA oliebestandighedsobjektets. En numerisk apertur højere end brydningsindekset af prøven (> 1,38 for celler) kræves for at nå den kritiske vinkel kræves til TIRF. En 1,45 NA mål ville være nok, men 1,49NA er mere praktisk, når manipulere vinklen på excitation. Emission detekteres ved anvendelse af en elektron-multiplikation charge coupled device (EMCCD) med en 8 mm array af 512 x 512 pixels. Ved hjælp af en 60X objektiv, kan flere isolerede celler indfanges inden en synsfelt.
En af de store ulemper at fluorescens baserede undersøgelser af proteinekspression fotoblegning 15. Denne excitation induceret nedbrydning af fluoroforen resulterer i en irreversibel nedgang i fluorescens intensitet over tid. Derfor vellykket billeddannelse bygger på en fin balance mellem intensiteten af strålen af excitation og on-chip forstærkning anvendes inden for EMCCD. Den excitationsintensitet skal være høj nok til at excitere en fluorofor til påvisning, men ikke så høj, at photobleach molekylet hurtigt. Kamera forstærkning kan anvendes til at multiplicere signalet til påvisning, i modsætning til at øge excitation intensitet, men dette øger også baggrund itensitet. Desuden skal der udvises forsigtighed ved valg af forstærkerindstillinger EM, for at undgå mætning af billederne. I mellem målingerne, blokering excitationsstrålen før den når prøven minimerer fotoblegning. Dette er påkrævet i forbindelse med indsamling celle billeder på en ECS af pH 7,4 til at sammenligne til pH 5,4. Fotoblegning sted mellem de to billeder ikke kan skelnes fra en mangel på fluorescens som følge af pH-ændring, således at denne effekt skal minimeres. Der bør udvises forsigtighed for at bruge lav laser strøm og at eksponere cellen kun tidsrum, for at fange de nødvendige billeder. For hvert eksperiment, kan et sæt af celler måles ved pH 7 under identiske billeddannende betingelser som en kontrol. Uden anvendelse interval og udsætte en varighed matcher eksponeringstid er nødvendig til udførelse af assay tilvejebringer en kontrol for at bestemme omfanget af fotoblegning. Hvis fotoblegning er større end 10% af den oprindelige intensitet, kan en korrektion kurve anvendes fra den observerede fotoblegning rottee ved at indsamle en tid spor af fluorescensintensitet. For enlige vesikel indsættelse begivenheder SEP-mærkede receptorer i menneskehandel vesikler er ikke begejstret indtil fusion med plasmamembranen, enten fordi pH dikterer en slukket tilstand, eller de er uden for TIRF region excitation. Derfor SEP mærkede receptorer ikke photobleach indtil indsættelse, tillader højere magnetiseringseffekt der skal anvendes for at detektere enkelt SEP-molekyler.
Som konklusion kan denne teknik anvendes med en række forskellige adhærente celletyper. September kan inkorporeres i næsten enhver membranprotein, så længe proteinfunktion og trafikegenskaber bevares. TIRF forbedrer opløsningen i plasmamembranen. September tillader differentiering af mærkede proteiner placeret på plasmamembranen fra dem, der i det perifere endoplasmatiske reticulum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm2 | VWR | 82050-856 | |
| 35 mm glass bottom Petri dishes, sterile | Cell E&G | GBD00002-200 | |
| Poly-D-lysine | vwr | 215017510 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Fisher Scientific | 11-965-084 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco / Fisher Scientific | 31-985-088 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered) | Gibco / Fisher Scientific | 16-000-044 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Fisher Scientific | 12604-021 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | VWR | 45000-652 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco / Fisher Scientific | 21083027 | Optional |
| Lipofectamine | Fisher Scientific | 11668030 | Gently mix; Do not vortex |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-10 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Objective immersion oil | Olympus | Type F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Microscope | Olympus | IX81 | |
| Camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 60X, 1.49 NA oil immersion objective | Olympus | APON 60XOTIRF | |
| Motorized stage | Prior | IXPROXY | |
| Motorized actuator (stepper motor) | Thorlabs | ZST213 | |
| MetaMorph (or other imaging program) | Metamorph | ||
| 488 nm laser | Market Tech | ||
| Single mode fiber | Thorlabs | SM450 | |
| Mirrors | Thorlabs | BB1-E01 | |
| Dichroic 488 nm LP | Semrock | Di02-R488-25x36 | |
| Bandpass filter, 488 nm | Semrock | LL01-488-12.5 | |
| Bandpass filter, 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 |
References
- Lester, H. A., et al. Nicotine is a selective pharmacological chaperone of acetylcholine receptor number and stoichiometry. Implications for drug discovery. AAPS J. 11 (1), 167-177 (2009).
- Henderson, B. J., Lester, H. A.
- Banerjee, C., et al. Cellular expression of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor protein in the temporal cortex in Alzheimer's and Parkinson's disease--a stereological approach. Neurobiol Dis. 7 (6 Pt B), 666-672 (2000).
- Ikonomovic, M. D., Wecker, L., Abrahamson, E. E., et al. Cortical α7 nicotinic acetylcholine receptor and β-amyloid levels in early alzheimer disease. Arch Neurol. 66 (5), 646-651 (2009).
- Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
- Kuryatov, A., Luo, J., Cooper, J., Lindstrom, J. Nicotine acts as a pharmacological chaperone to up-regulate human a4b2 acetylcholine receptors. Mol Pharmacol. 68 (6), 1839-1851 (2005).
- Fox, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. The nicotine metabolite, cotinine, alters the assembly and trafficking of a subset of nicotinic acetylcholine receptors. J Biol Chem. 290 (40), 24403-24412 (2015).
- Henderson, B. J., et al. Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors. J Gen Physiol. 143 (1), 51-66 (2014).
- Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
- Ameen, N., Silvis, M., Bradbury, N. Endocytic trafficking of CFTR in health and disease. J. Cyst. Fibros. 6 (1), 1-14 (2007).
- Pauly, J. R., Marks, M. J., Robinson, S. F., van de Kamp, J. L., Collins, A. C. Chronic nicotine and mecamylamine treatment increase brain nicotinic receptor binding without changing alpha 4 or beta 2 mRNA levels. J Pharmacol Exp Ther. 278 (1), 361-369 (1996).
- Govind, A. P., Walsh, H., Green, W. N. Nicotine-induced upregulation of native neuronal nicotinic receptors is caused by multiple mechanisms. J Neurosci. 32 (6), 2227-2238 (2012).
- Mazzo, F., et al. Nicotine-modulated subunit stoichiometry affects stability and trafficking of alpha3beta4 nicotinic receptor. J Neurosci. 33 (30), 12316-12328 (2013).
- Moroni, M., Zwart, R., Sher, E., Cassels, B. K., Bermudez, I. α4β2 nicotinic receptors with high and low acetylcholine sensitivity: pharmacology, stoichiometry, and sensitivity to long-term exposure to nicotine. Mol Pharmacol. 70 (2), 755-768 (2006).
- Tsien, R. Y.
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Fox-Loe, A. M., Dwoskin, L. P., Richards, C. I. Neuromethods: Nicotinic Acetylcholine Receptor Technologies. Ming, L. 117, Humana Press. (2016).
- Khiroug, S. S., et al. Dynamic visualization of membrane-inserted fraction of pHluorin-tagged channels using repetitive acidification technique. BMC Neurosci. 10 (141), (2009).
- Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 11080-11085 (2010).
- Yudowski, G. A., et al. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J Neurosci. 27 (41), 11112-11121 (2007).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
- Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods Cell Biol. 89, 169-221 (2008).
- Paroutis, P., Touret, N., Grinstein, S. The pH of the secretory pathway: measurement, determinants, and regulation. Physiol (Bethesda). 19, 207-215 (2004).
