Summary
Merking av ekstracellulære domenet til en membran protein med en pH-sensitive fluorofor, superecliptic pHluorin (SEP), kan subcellulære lokalisering, uttrykk og menneskehandel skal fastsettes. Imaging september-merkede proteiner med total indre refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM) muliggjør kvantifisering av proteinnivåer i den perifere ER og plasmamembran.
Abstract
Forståelse membran protein menneskehandel, montering og uttrykk krever en tilnærming som skiller mellom de som er bosatt i intracellulære organeller og de lokalisert på plasmamembranen. Tradisjonelle fluorescens-baserte målinger mangler evnen til å skille membranproteiner som befinner seg i forskjellige organeller. Cutting edge metoder overskride tradisjonelle metoder ved kobling pH-følsomme fluorophores med total intern refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM). TIRF belysning eksiterer prøven opp til ca. 150 nm fra glass-prøven grensesnitt, og dermed redusere bakgrunn, øke signal til støyforholdet, og forbedrer oppløsningen. Eksitasjon volum i TIRFM omfatter plasmamembranen og nærliggende organeller som perifere ER. Superecliptic pHluorin (SEP) er en pH følsom versjon av GFP. Genetisk som koder september inn i det ekstracellulære domene av et membranprotein av interesse posisjonerer fluoroforen videreden luminale siden av ER og i det ekstracellulære område av cellen. September er fluoriserende når pH-verdien er større enn 6, men forblir i en av-tilstand ved lavere pH-verdier. Derfor reseptorer merket med september fluorescerer når bor i det endoplasmatiske retikulum (ER), eller ved innføring i plasmamembranen (PM), men ikke når begrenset til en handel vesikkel eller andre organeller som Golgi. Det ekstracellulære pH-verdien kan justeres til å diktere den fluorescens av reseptorer på plasmamembranen. Forskjellen i fluorescens mellom TIRF bilder ved nøytral og sur pH ekstracellulære for den samme celle tilsvarer et relativt antall av reseptorer på plasmamembranen. Dette tillater en samtidig måling av intracellulære og plasmamembranreseptorer hørende. Enkelt vesikkel innsetting arrangementer kan også bli målt når det ekstracellulære pH-verdien er nøytral, noe som tilsvarer en lav pH-verdi handel vesikkel smelte sammen med plasmamembranen og overgangen til en fluorescerende tilstand. dette versatile teknikken kan utnyttes til å studere lokalisering, uttrykk, og smugling av membranproteiner.
Introduction
Endringer i reseptorekspresjon, distribusjon, og sammenstillingen er koblet til en lang rekke sykdommer, inkludert Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, cystisk fibrose, og narkotikaavhengighet 1, 2, 3, 4, 5. For eksempel, nikotin og andre nikotin ligander påvirker handel med nikotiniske acetylkolinreseptorer (nAChR) som fører til forandringer i handelen, uttrykk, og oppregulering 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Nikotin øker det totale antall sammenstilte nAChR-er i en celle, øker handel over plasmamembranen, end endrer montering av subenheter å favorisere en høy følsomhet versjon av noen subtyper. Løse tydelige endringer i menneskehandel, montering og uttrykk av reseptorer i en sykdomsmodell gir viktige mekanistiske detaljer som er avgjørende for å definere narkotika mål. En ideell metode vil raskt skille mellom intracellulære reseptorer og de som er lokalisert på plasmamembranen. Dette er spesielt utfordrende i tilfeller der et flertall av et bestemt protein ligger intracellulært, slik som med nAChR. Siden de fleste av nAChR-er lokalisert til det endoplasmatiske retikulum, tradisjonelle mål mangler rom-tid-oppløsningen som er nødvendig for å fastslå lokalisering og trafikk endrer seg langs den sekretoriske vei. Receptor menneskehandel og uttrykk studier av nAChR har primært blitt utført ved bruk av radioligand bindende 11, Biotinylation analyser 12, western blotting 13, eller immunpresipitering Techniq UES 12. Disse er avhengig av bindingen spesifisiteten til et reportermolekyl eller fiksering av celler, og mangler evnen til samtidig å skille mellom plasmamembranen hørende og intracellulære reseptorer. Derfor studier av ionekanal montering og vesikkel dynamikk har i stor grad støttet seg på lav-throughput elektrofysiologiske teknikker 14.
Superior romlig og tidsmessig oppløsning er mulig med fremskritt i fluorescens mikroskopi. Genetisk kodede reportermolekyler, for eksempel grønt fluorescerende protein (GFP) og dens varianter, eliminere ikke-spesifikke bindingsproblemer og øke følsomheten 15. En pH-følsom variant av GFP, kjent som superecliptic pHluorin (SEP), kan anvendes for å utnytte iboende pH-forskjeller mellom kamrene i en celle for å bestemme lokalisering 5, 7, 8,ref "> 9, 16, 17, 18. september fluorescerer når pH er høyere enn 6, men forblir i en av-tilstand ved lavere pH-verdi. Derfor blir reseptorer merket med september på sine luminale side påvises når de er tilstede i det endoplasmatiske retikulum ( ER) eller etter innføring i plasmamembranen (PM), men ikke når begrenset til en handel vesikkel. manipulering av det ekstracellulære pH-verdi i kontakt med reseptorer på plasmamembranen følgelig endrer fluorescens og derfor påvisning av disse reseptorene. Hvis den samme cellen vil sekvensielt bli avbildet ved både en nøytral ekstracellulære pH-verdi og deretter en pH-verdi lavere enn 6, blir forskjellen mellom bildene tilskrives reseptorer lokalisert på plasmamembranen. Dette tillater en samtidig måling av intracellulært (perifer eR) og plasmamembran hørende reseptorer 5, 7, 8 p>, 9. Enkelt vesikkel innsetting hendelser kan også løses når ekstracellulære pH er nøytral. Når en lav pH-handel vesikkel sikringer med plasmamembranen, er luminal side av vesikkel utsettes for den nøytrale ekstracellulær løsning, å bevirke en overgang detekteres som et utbrudd av fluorescens 7, 18, 19, 20. September muliggjør måling av reseptorer lokalisert i plasmamembranen og perifer endoplasmatiske retikulum, og tilveiebringer et middel for å måle handel av reseptorer mellom disse subcellulære områdene 5, 7, 18.
For å oppnå høyere oppløsning på plasmamembranen, er en reseptor med september genetisk kodet avbildes ved total indre refleksjon florescence mikroskopi (TIRFM). Denne fremgangsmåte er særlignyttig hvis flertallet av reseptorer lokalisert til intracellulære regioner, siden TIRFM øker synligheten av plasmamembranen. TIRFM gjør det også mulig oppløsning på trafficking dynamikken i enkelt vesikler bærer september merkede reseptorer ved innsetting i PM. Total intern refleksjon opptrer ved grenseflaten mellom materialer med forskjellige brytningsindekser, for eksempel mellom en celle og en glassdeksel glid 21, 22. September fluorescerer når de bestråles med 488 nm eksitasjon, som er orientert for å oppnå total indre refleksjon ved grenseflaten mellom glass og celleløsning. Dette gir en for transiente bølger som trenger inn i ca 150 nm i prøven, bare begge fluoroforer innenfor dette volum. Bare september inneholdende reseptorer på en nøytral pH-miljø innenfor dette område av eksiteringen detekteres, tilsvarende de som befinner seg på plasmamembranen eller perifere endoplasmatiske retikulum. Siden oppdagelsen er begrenset to eksitasjon av den transiente bølger, bakgrunnsfluorescensen fra den intracellulære region er redusert, og signal-støyforholdet økes 21, 22. I tillegg, siden strålingen ikke trenge inn i hoveddelen av cellen, blir minimalisert photodamage som tillater levende celle avbildning i løpet av tiden. Som et resultat, TIRFM kombinert med genetisk kodet september gir høy oppløsning og følsomhet som kreves for å måle subcellulære lokalisering og handel dynamikken til membranreseptorer langs den sekretoriske vei.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Culture og Transfeksjon
- Opprettholde mus neuroblastom 2a (N2a) celler i vekstmedier.
- Gjør 500 ml N2a vekstmedier fra 200 ml Dulbeccos Eagle medium (DMEM) med høy glukose, 250 ml redusert serum media, 50 ml føtalt bovint serum (FBS), og 5 ml penicillin / streptomycin (100x).
- Opprettholde celler i en T75-kolbe ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- Split celler 1:15 når det er nødvendig, eller på ca. 80-90% konfluens. Dette er vanligvis 2-3 ganger i uken.
- Coat 35 mm glassbunn fatet med poly-D-lysin.
- I en laminær strømning biosikkerhet skap, tilsett 200 ul 0,1 ug / ml poly-D-lysin på glass bunnområdet av sterilt 35 mm skål.
- Plasser rett i en 37 ° C inkubator i 1 time.
- Skyll nøye tallerken med DDH 2 O 3-4 ganger.
- La oppvasken til helt tørr i mer enn en time.
- sterilize retter med UV-lys i biosikkerhet kabinettet hvis nødvendig.
- Plate N2A celler for TIRFM bildebehandling.
- Fjern vekstmedier fra heftende celler.
- Løsne cellene fra kolben ved inkubering med 1 ml 1x trypsin (+ EDTA) i 5 minutter ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- Inaktivere trypsin ved å legge til 9 ml vekstmedier. Bland media, trypsin og frittliggende celler ved hjelp av en pipette.
- Visuelt telle celler ved hjelp av en hemocytometer og beregne riktig volum for å legge 90.000 celler til hver poly-D-lysin belagt glassbunn fatet. Denne tetthet er nødvendig for effektiv transfeksjon og enkelt celle TIRF avbildning.
- Tilsett 2 ml vekstmedier til hver glassbunn fatet inneholdt 90.000 celler.
- Inkuber fatet ved 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator for 16-24 timer.
- N2a transfeksjon
- Skaff en plasmid konstruksjon inneholdende en september fluorophore innarbeidetinn i det ekstracellulære område av proteinet av interesse. Standard kloningsteknikker slik som PCR-amplifisering 5 kan benyttes til å generere konstruksjonen.
MERK: september skal innlemmes i den ekstracellulære region av membranprotein, slik at den befinner seg inne i hulrommet av det endoplasmatiske retikulum eller trafikk vesikler og er utsatt for ekstracellulær løsning når på plasmamembranen. September er lik i størrelse til GFP og lignende kloningsstrategier kan anvendes. - Sett på vekstmediet på belagt celler med 1,5 ml redusert serummedium (f.eks Opti-MEM), ca 30 min før tilsetning av transfeksjon reagens.
MERK: For å studere medikamentinduserte forandringer i reseptorer, kan en passende konsentrasjon av legemiddel tilsettes på tidspunktet for transfeksjon. - Legg 500 ng av hver ønsket plasmid konstruere til 250 mL redusert serum media (tube 1).
- Tilsett 2 pl av transfeksjon reagens til et separat rør containing 250 pl av reduserte serum medier. Inkuber røret 2 ved romtemperatur i 5 min. Forholdet mellom reagens-transfeksjon med plasmid-DNA bør optimaliseres for å uttrykke hvert protein av interesse.
- Kombiner rør 1 og 2 for å lage en løsning som inneholder 500 mL av transfeksjon reagens og plasmid mix. Inkuber ved romtemperatur i 25 min.
- Tilsett 500 mL transfeksjon blanding til pre-belagte celler for et totalvolum på 2 ml pr tallerken.
- Inkuber cellene ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator i 24 timer.
- Etter 24 timer fjerne transfeksjon mix og skyll cellene med vekstmedier og deretter legge til 2 ml vekstmedier til hver tallerken.
MERK: Hvis et medikament ble tilsatt ved tidspunktet for transfeksjon, kan det etterfylles på nytt ved dette trinnet. - Inkuber cellene ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator i 24 timer.
- Bilde cellene 48 timer etter transfeksjon.
- Skaff en plasmid konstruksjon inneholdende en september fluorophore innarbeidetinn i det ekstracellulære område av proteinet av interesse. Standard kloningsteknikker slik som PCR-amplifisering 5 kan benyttes til å generere konstruksjonen.
2. Levende Cell Imaging av Total iintern Refleksjon Fluorescensmikroskopi (TIRFM)
- Imaging satt opp
- Utføre avbildning med et invertert mikroskop fluorescens satt opp med et scanning-trinn, som vist i figur 1. Dette krever innretting av et 488 nm DPSS laserkilde, til en trinnmotor justere 488 nm bjelke stilling, og en høy numerisk apertur (NA 1,49) 60X eller 100X oljeneddyppingsobjektivet.
- Pass laserstrålen gjennom passende eksitasjonsfilteret (båndpass 488/10 nm). Juster den polariserte laserstrålen gjennom en enkelmodusfiber som er koblet til en utskytnings montert til en trinnmotor. I epifluorescens modus er eksitasjon bjelken sentrert i midten av baksiden aperturen til objektivet.
- For å oppnå TIRF, bruk trinnmotoren for å oversette den fokuserte laserstrålen over baksiden apertur for objektivlinsen til den kritiske vinkel er nådd, og strålen er ikke lenger overført gjennom prøven og i stedet helt reflektert fra glass-cell grensesnitt.
- Knips bilder med en EMCCD (512 x 512 piksler) styres med bildebehandlingsprogrammer (f.eks Metamorph) med den aktuelle utslipp filter montert i utslipps pathway (525/50 nm).
- Klargjør tenkelig løsning
- Fremstille 200 ml ekstracellulær løsning (ECS) ved blanding av 150 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM HEPES og 10 mM glukose i DDH 2 O. Stamløsninger av NaCl, KCl, MgCl2, og CaCl2 kan fremstilles på forhånd og kombineres med frisk HEPES og glukose på dagen for avbildning.
- Justering av pH i en oppløsning inneholdende 100 ml ECS til pH 7,4. Juster de resterende 100 ml ECS til en pH-verdi på 5,4. Skyll de transfekterte cellene med 2 ml ECS (pH 7,4).
- Tilsett 2 ml ECS (pH 7,4) til de transfekterte celler før avbildning.
- Live-celle bildebehandling i TIRF
- Slå på hele systemet, including 488 nm laser, kamera, oversettelse scenen, og bildeprogram. Fokuser epifluorescence strålen og justere kraften til ca 1 mW ved 60X objektiv.
- Tilsett olje til målet og plassere en tallerken av transfekterte celler på oversettelsen scenen. Fest fatet på plass ved hjelp av scenefester for å sikre at det ikke beveger seg i forhold til scenen slik at cellene kan avbildes flere ganger.
- I epifluorescence modus, fokus mikroskop og finne fluorescerende, transfekterte celler. Celler vil forbli fokusert over flere fokusplan. Finn single, isolerte celler for å fortsette TIRF.
- I bildeprogrammet, sett eksponeringstiden til 200 msek og optimalisere fluorescens intensitet ved å sette EM gevinst.
- Overgang laserstrålen inn i TIRF ved å oversette strålen tvers over målet på en trinnvis måte ved hjelp av trinnmotoren. Ettersom den kritiske vinkelen nærmer seg, vil strålen synlig sette tvers over kanten av fatet til den konvergerer på the poenget med total intern refleksjon på prøven flyet.
- Kontroller at cellene er i TIRF modus ved å justere fokus knott. I TIRF, kan bare ett plan av celler skal fokuseres (dvs. ca 150 nm fra glass-grensesnitt), og produserer en meget definert bilde med høy oppløsning av plasmamembranen.
- Imaging september for å avgjøre subcellulære lokalisering
- Finn sunne, transfekterte, enkeltceller i bildeplanet.
- Erverve et fokusert bilde av cellen ved pH 7,4. September merket reseptorer på plasmamembranen og endoplasmatiske retikulum skal være synlig.
- Raskt blokkere laserstrålen fra å nå prøven for å forhindre fotobleking.
- Pugg sceneplassering tilsvarer hver celle ved hjelp av mikroskop bildebehandling i stand til å ta opp flere xy steder.
- Gjenta trinn 2.4.1-2.4.4 for 20-30 celler per tallerken mens du bruker programvaren til å registrere posisjonen til hver celle.
- After alle celle bildene ved pH 7,4 ble oppsamlet, manuelt fjerne pH 7,4 ECS oppløsning ved anvendelse av en pipette. Ikke ta på parabolen så dette kunne flytte innøvde sceneplassering.
- Nøye tilsett 2 ml pH 5,4 ECS til parabolen og vente 10 min. I løpet av denne tiden, lagre tidligere ervervede bilder.
- Under identisk sett med betingelser som brukes for å samle inn bilder ved pH 7,4, beveger fasen til hvert lagret posisjon og skaffe et bilde av den samme celle ved pH 5,4. Cellene bør se mindre definert siden alt oppdaget fluorescens har opprinnelse fra endoplasmatisk retikulum begrenset september merket reseptorer. Redd pH 5,4 celle bilder.
- Imaging enkelt vesikkel innsetting hendelser i levende celler
- Erstatt vekstmedier av transfekterte celler med 2 ml pH 7,4 ECS, eller med Leibovitz L-15 media. PH i Leibovitz L-15 media er CO to uavhengig, slik avbildning for å skje over en lang tidsperiode hvis det er nødvendig.
- Place parabolen av transfekterte celler på scenen av mikroskopet. Fest og fokus et eneste celle i TIRF følgende trinn 2.3 ovenfor.
- Hvis utstyrt, stille autofokus slik at fokus ikke drive over en periode på bildebehandling.
- Spill inn en serie med 1000 bilder, kontinuerlig ta bilder med en bildefrekvens på 200 msek. Utbrudd av fluorescens vil være synlig i løpet av denne tiden, tilsvarende lave pH menneskehandel vesikler smeltet med plasmamembranen, utsette september til ekstracellulære pH 7,4.
- Finn et annet enkelt celle og gjentar trinnet ovenfor. Tilbake autofokus om nødvendig.
3. Bildeanalyse og databehandling
- Analysere september fluorescens for å fastslå subcellulære lokalisering
- Åpne celle bilder med en bildeanalyse programvare som Metamorph eller ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). Trekk bakgrunn fra både pH 5,4 og pH 7,4 bilder med et rullende ball innstillingen.
- Bruke en intensitet basert terskel for å kvantifisere fluorescensen fra en enkelt celle. manuelt velge et område av interesse rundt cellen i pH 7,4 bildet.
- Mål celleområdet, mener intensitet, og integrert tetthet ved hjelp av en plugin i ImageJ eller ved hjelp av den innebygde "Mål" funksjonen under kategorien Analyser.
- Gjenta trinnene 3.1.1-3.1.3 for den samme celle ved pH 5,4, omhyggelig justering av intensiteten basert terskel og regionen av interesse på samme måte.
- Etter at den integrerte tetthet blir oppnådd for celle bilder ved både pH 7,4 og 5,4, beregne plasmamembranen integrert densitet ved å subtrahere pH 5,4 verdien fra pH 7,4 verdi. Forskjellen tilsvarer det relative antall reseptorer på plasmamembranen inne i TIRF eksitasjon regionen.
- Som et mål på trafikk, å beregne den relative prosentandelen av september merkede reseptorer lokalisert på plasmamembranen i forhold til den synlige i TIRF excitati resterende reseptorerpå volum ved å dividere plasmamembranen integrert densitet av den totale integrerte tetthet ved pH 7,4, multiplisert med 100.
- Analysere enkelt vesikkel innsetting hendelser
- Åpne serie 1000 tiff bilder med bildeanalyse programvare. Trekk bakgrunn fra alle rammer ved å rulle ballen innstillingen.
- Juster fargebalansen av opptaket for å maksimere intense regioner som tilsvarer vesikkel innsetting hendelser. telle utbrudd av fluorescens som varer lenger enn 3 rammer (> 600 msek) manuelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
September innlemmelse i en reseptor tillater direkte påvisning av at reseptoren i en levende celle. Sammen med TIRFM, gjør dette at evalueringen av de relative ekspresjonsnivåer på plasmamembranen og fordelingen av reseptorer i de subcellulære steder i området av TIRF eksitasjon. hendelser Enkeltrom vesikkel menneskehandel kan også løses.
Relative Expression Nivåer av september-merket reseptorer på plasmamembranen
September fluorescens ved eksitasjon bestemmes av pH-verdien av den omkringliggende løsningen. Når september er smeltet sammen med plasmamembranen hørende reseptorer, kan det ekstracellulære pH-verdien kan bli manipulert for å slå denne fluorescens eller på 5, 7, 8, 9, 17. når the pH av det ekstracellulære oppløsning er en fysiologisk 7,4, reseptorer fra både plasmamembranen og det endoplasmatiske retikulum i samme område som TIRF eksitasjon fluorescerer. Det ekstracellulære oppløsning kan deretter byttes ut med en ellers identisk oppløsning av pH 5,4. Dette fører til at plasmamembranen bosatt september en overgang til en av-tilstand, noe som betyr at alle observerte fluorescens er nå fra det endoplasmatiske retikulum. Figur 2 viser et eksempel på celler avbildes ved både pH 7,4 (A) og pH 5,4 (B). Det relative antall av reseptorer på plasmamembranen i forhold til den perifere endoplasmatiske retikulum i samme område som TIRF magnetisering blir så beregnet matematisk ved å subtrahere den integrerte tettheten av fluorescens ved pH 5,4 fra at ved pH 7,4, vist i figur 2C. Denne beregnede plasmamembran integrert densitet lik den relative antall september-merkede reseptorer lokalisert på plasmamembranen, og inne i TIRF eksitasjonvolum. Siden plasmamembranen og nærliggende perifere endoplasmatiske retikulum blir fortrinnsvis spent med TIRF, er dette subcellulære fordeling sammenligning mellom reseptorer lokalisert til disse områder, og ikke hele intracellulære region av cellen.
Subcellulære Fordeling av september-merkede reseptorer
Omsetning av reseptorer kan måles ved å sammenlikne forholdet mellom reseptorer lokalisert på plasmamembranen i forhold til det endoplasmatiske retikulum. Oppdeling plasmamembranen integrert densitet av den totale integrerte tetthet ved pH 7,4, multiplisert med 100, gir en relativ prosentandel av SEP-merkede reseptorer lokalisert på plasmamembranen 5, 7. Som en kontroll, Brefeldin A kan tilsettes til cellene for å forstyrre intracellulært protein handel. Når Brefeldin A er til stede, praktisk talt alt av det detekterte receptors innen regionen av TIRF eksitasjon vil være begrenset til det endoplasmatiske retikulum, noe som resulterer i en lavere% PM. Dessuten kan muterte (Δ508-I539T) cystisk fibrose transmembranregulator (Δ508-I539T-CFTR) anvendes som en positiv kontroll. I nærvær av kommersielt tilgjengelige VX-809, Δ508-I539T-CFTR ekspresjon på celleoverflaten økes 2 til 3 ganger.
Enkelt Vesikkel innsetting Hendelser
September ikke fluorescerer eller photobleach i den lave pH av en transport vesikkel, men gjenvinner fluorescens ved eksponering til en ekstracellulær pH-verdi på 7,4 ved plasmamembranen 7, 16, 18. Innsetting hendelser er visualisert som et utbrudd av fluorescens ved plasmamembranen som varer i minst 3 rammer (600 ms), som svarer til fullstendig sammensmelting av transport vesikkel inn i plasmamembranen som vist i figur 3. Før en innsettings (figur 3B), er ingen merkbar burst til stede. En økning i fluorescens-intensitet blir sett på som transport vesikkel ankommer (figur 3C), som diffunderer gjennom membranen (figur 3D - 3G), inntil inkorporering i massen fluorescensen av cellen (figur 3 H - 3I).
Figur 1: Skjematisk av TIRF mikroskop. Dette TIRF oppsett anvender en 488 nm laser for DPSS september eksitasjon, fiber koblet til en trinnmotor for å justere den kritiske vinkelen på eksitasjon strålen ved å oversette strålen over ryggen aperturen til objektivet. Cellene avbildes med en 60X, 1,49 NA oljeneddyppingsobjektivet. Utslipps detekteres ved hjelp av en elektron multiplisere ladningskoblet anordning.filer / ftp_upload / 55466 / 55466fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Uttrykk og menneskehandel på plasmamembranen. En celle som uttrykker N2a α3-Sep / β4-wt nAChR-er ved pH 7,4 (A) viser reseptorer lokalisert på plasmamembranen og endoplasmatiske retikulum. Ved pH 5,4 (B), har reseptorer på plasmamembranen ikke fluorescerer, slik at bare det endoplasmatiske retikulum resident reseptorer er synlige. Forskjellen mellom integrerte tetthet ved pH 7,4 og pH 5,4 (C) korresponderer til reseptorer lokalisert på plasmamembranen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Single Vesikkel Insertion Event. En celle som uttrykker N2a α3-sep / ß4-wt nAChR-er med en ekstracellulær pH 7,4 er vist i (A). Umiddelbart før en innsetting (B), ingen utbrudd av fluorescens er synlig. En handel vesikkel bære september ankommer (C), og september-merkede reseptorer diffundere over plasmamembranen (D - G), til å skille fra tidligere innsatte reseptorer (H - I). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PH-følsomhet av september muliggjør reseptorer som befinner seg på plasmamembranen til å skilles fra intracellulære reseptorer i det endoplasmatiske retikulum, og den kan brukes til å løse innsetting hendelsene i reseptor-bærende vesikler 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 . Flere teknikker inkludert overflate biotinylering og ligandbinding er mye brukt til å måle protein overflatenivå. I noen tilfeller kan western blot også brukes for å skille mellom ER og PM hørende protein. Dette september basert teknikk er komplementær til tradisjonelle mål, noe som gir en rask avlesning av overflateekspresjon og evnen til å måle endringer i protein lokalisert på ER til PM. Siden september er genetisk kodet i proteinet av interesse, problemer med nonspefikke binding er eliminert og følsomhet økes. September undergår 488 nm eksitasjon ved nøytral pH, men er ikke spent under sure betingelser for pH <6. Når den ekstracellulære pH-verdien er 7,4, blir fluorescens målt for nAChR-er bosatt i det endoplasmatiske retikulum og på plasmamembranen, men ikke for de i de lavere pH-sekretoriske vesikler eller Golgi (pH <6) 23. Under avbildning blir ECS av pH 7,4 byttet ut med en ellers identisk løsning ved pH 5,4. Forskjellen mellom den integrerte tettheten i disse bildene er plasmamembranen integrert tettheten i en celle. Dividere dette tallet med den totale integrerte tetthet i samme område som TIRF eksitasjon, ved pH 7,4, multiplisert med 100, gir den prosentvise på plasmamembranen 5, 7, 8, 9. Selv om disse studiene ble det brukt TIRFM kan tilsvarende analysen utføres ved hjelp av epi-fluorescens.For membranreseptorer som nAChR hvor et flertall av reseptorer bor på akuttmottaket, er TIRM ideelt fordi den smale eksitasjon volumet øker brøkdel av synlige PM bosatt reseptorer versus intracellulære reseptorer. Dette øker sensitiviteten til analysen av endringer i reseptor-fordeling mellom organeller. For proteiner med høyere ekspresjonsnivåer på PM, epi-fluorescens-baserte SEP studier er tilstrekkelige til å måle endringer i reseptor-ekspresjon. Men enkelt vesikkel innsetting hendelser som også målt ved pH 7,4 kreve TIRFM. Utbrudd av fluorescens som korresponderer med lav pH trafficking vesikkel fusjonere med høyere pH plasmamembranen mens lett sees i TIRFM er vanligvis ikke discernable i epi-fluorescens.
Innlemming september med TIRF Imaging betingelser
September genetisk kan innlemmes i det ekstracellulære domene av et membranprotein. På grunn av størrelsen og plasseringen av september, er det avgjørende å VERIF y at den modifiserte proteinet ikke er signifikant forskjellig i handel eller funksjon fra et villtype protein. Analyser bør utføres ved hjelp av september merket protein for å bekrefte at inkorporering av merket ikke forstyrre aktiviteten. For ionekanaler, elektrofysiologiske og ion permeabilitet målinger er ideelle, mens for andre reseptorer fluorescerende ligandbinding og western blotting kan brukes til å verifisere menneskehandel. Festede celler er ideell for transfeksjon med kommersielle transfeksjon reagenser og bildebehandling med TIRFM fordi de fester seg direkte til glassbunn fatet. Dette feste er nødvendig for å sikre TIRF eksitasjon av den flyktige bølge i løpet av ca 150 nm fra glass-prøven grensesnitt. For å oppnå høy oppløsning TIRF bilder, må prøven å forbli flat under avbildning 21. Poly-D-lysin belegg er fordelaktig ved avbildning N2A-celler, fordi det gir et vedlegg matrise som minimerer celle bevegelser for å opprettholde et flatt underlaglass = "xref"> 7. Pletteringscelletettheten må være optimalisert for å sikre at celler isoleres på glasset fatet for å oppnå TIRF. Celle clustering hindrer total indre refleksjon ved å hindre flat celle tilslutning i en enkelt optisk plan. Siden bare ett plan er fokusert i TIRF, opprettholde riktig celle morfologi er avgjørende for bildebehandling. Dette er spesielt viktig når løsninger blir utvekslet i SEP studiene. For å minimere morfologiske endringer, bilder ved pH 7,4 og pH 5,4 må hentes raskt. I tillegg vil den ECS (pH 5,4) til slutt trenge gjennom intracellulære membraner, forandre organeller struktur og fluorescens av interne september-merkede reseptorer. Dette er lett unngås ved å samle bilder under hver pH-tilstand i løpet av få minutter. Data fra flere retter i samme avbildning sesjon kan kombineres for å øke antall celler som ble analysert. Når du skifter løsninger, forsiktig fjerne pH 7,4 ECS løsning med en pipette og tilsett pH 5,4 ECS dråpevis til than parabolen. Fjerne eller legge til løsning for raskt kan stress i cellene eller flytt rett med hensyn til de lagrede sceneplassering. Et perfusjon system for å utveksle løsninger kan også anvendes, så lenge som løsningen utvekslingen er fullstendig og skjer raskt. Eksakte saltkonsentrasjoner i hver løsning er nødvendig for å redusere celle forvrengninger. En scene toppen inkubator kan innarbeides for å redusere svingninger i temperatur under bildebehandling.
TIRF Imaging
TIRF avbildning reduserer bakgrunns fluorescens ved å fokusere på en enkelt optisk plan. Dette øker signal-til-støy-forholdet ved selektivt begge fluoroforer innenfor omtrent 150 nm fra glass-prøven grensesnitt 21, 22. I denne regionen, er oppløsningen øker kraftig, spesielt i plasmamembranen. Dette er nødvendig dersom et flertall av reseptorer er lokalisert intracellulært. Hvis en høy andel av membranreseptorer erlokalisert på plasmamembranen, kan dette september tilnærming bli anvendt for å bestemme subcellulære lokalisering i epifluorescens. Imidlertid, hvis en liten prosentandel av totale reseptorer er trafikkert til plasmamembranen, som med nAChR-er, er TIRFM nødvendig for å kvantifisere pH-endringer uselvstendige i fluorescens ved plasmamembranen. Dessuten lar TIRFM oppløsningen av enkelt vesikkel menneskehandel hendelser og distribusjon av reseptorer i den sekretoriske vei. En grunnleggende TIRF oppsett anvender en 488 nm laser for DPSS september eksitasjon, fiber koblet til en trinnmotor for å justere den kritiske vinkelen til eksitasjon bjelken. For å oppnå TIR, blir strålen oversatte sideveis tvers over baksiden apertur for objektiv inntil en kritisk vinkel er nådd. Cellene avbildes med en 60X eller 100X, 1,49 NA oljeneddyppingsobjektivet. En numerisk apertur høyere enn brytningsindeksen for prøven (> 1,38 for celler) er nødvendig for å nå den kritiske vinkelen som er nødvendig for TIRF. En 1,45 NA mål ville være nok, men 1,49NA er mer praktisk når manipulere vinkel på eksitasjon. Utslipps detekteres ved hjelp av en elektron multiplisere ladningskoblet anordning (EMCCD) med en 8 mm matrise på 512 x 512 piksler. Ved hjelp av et 60X objektiv, kan flere isolerte celler fanges innenfor en synsfelt.
En av de store ulempene til fluorescens basert studier av protein uttrykk photobleaching 15. Dette eksitasjon induserte nedbrytning av fluoroforen resulterer i en irreversibel nedgang i fluorescens-intensitet over tid. Av denne grunn, avhengig vellykket avbildning på en delikat balanse mellom intensiteten av strålen av eksitasjon og on-chip forsterkning brukes innenfor EMCCD. Eksitasjon intensitet må være høy nok til å eksitere en fluorofor for deteksjon, men ikke så høy at photobleach molekylet hurtig. Kameraet forsterkning kan anvendes for å multiplisere signalet for påvisning, i motsetning til å øke eksitasjon intensitet, men dette øker også bakgrunntensity. I tillegg må man være forsiktig når du velger den forsterkning EM, for å unngå metning av bildene. I mellom målinger, å blokkere magnetisering strålen før den når prøven minimerer fotobleking. Dette er nødvendig når du samler celle bilder på en ECS av pH 7,4 for å sammenligne med pH 5,4. Bleking oppstår mellom de to bildene ikke kan skilles fra en mangel av fluorescens på grunn av pH-forandring, slik at denne effekten trenger å bli minimalisert. Forsiktighet bør tas for å bruke lav laser makt og for å avsløre cellen bare for varigheten er nødvendig for å fange opp de nødvendige bildene. For hvert eksperiment, kan et sett med celler måles ved pH 7 under identiske bildedannende betingelser som en kontroll. Ved hjelp av ikke intervall og utsettes for en varighet som samsvarer med eksponeringstiden som er nødvendig for utførelse av analysen tilveiebringer en kontroll for å bestemme graden av fotobleking. Hvis fotobleking er større enn 10% av den opprinnelige intensitet, kan en korreksjonskurve brukes fra den observerte fotobleking rottee ved å samle en gang spor av fluorescens intensitet. For enkelt vesikkel innsetting hendelser, september-merket reseptorer i menneskehandel vesikler ikke er spent før fusjon med plasmamembranen, enten fordi pH tilsier en off tilstand eller de er utenfor TIRF regionen eksitasjon. Derfor september merkede reseptorer vil ikke photobleach før innsettingen, slik at høyere magnetiseringseffekt som skal anvendes for å detektere enkle SEP molekyler.
Som konklusjon, kan denne teknikken bli anvendt sammen med en rekke av adherente celletyper. September kan inkorporeres i praktisk talt enhver membranprotein, så lenge proteinfunksjon og trafikkegenskaper opprettholdes. TIRF forbedrer oppløsningen på plasmamembranen. September tillater differensiering av merkede proteiner lokalisert på plasmamembranen fra de innenfor den perifere endoplasmatiske retikulum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm2 | VWR | 82050-856 | |
| 35 mm glass bottom Petri dishes, sterile | Cell E&G | GBD00002-200 | |
| Poly-D-lysine | vwr | 215017510 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Fisher Scientific | 11-965-084 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco / Fisher Scientific | 31-985-088 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered) | Gibco / Fisher Scientific | 16-000-044 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Fisher Scientific | 12604-021 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | VWR | 45000-652 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco / Fisher Scientific | 21083027 | Optional |
| Lipofectamine | Fisher Scientific | 11668030 | Gently mix; Do not vortex |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-10 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Objective immersion oil | Olympus | Type F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Microscope | Olympus | IX81 | |
| Camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 60X, 1.49 NA oil immersion objective | Olympus | APON 60XOTIRF | |
| Motorized stage | Prior | IXPROXY | |
| Motorized actuator (stepper motor) | Thorlabs | ZST213 | |
| MetaMorph (or other imaging program) | Metamorph | ||
| 488 nm laser | Market Tech | ||
| Single mode fiber | Thorlabs | SM450 | |
| Mirrors | Thorlabs | BB1-E01 | |
| Dichroic 488 nm LP | Semrock | Di02-R488-25x36 | |
| Bandpass filter, 488 nm | Semrock | LL01-488-12.5 | |
| Bandpass filter, 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 |
References
- Lester, H. A., et al. Nicotine is a selective pharmacological chaperone of acetylcholine receptor number and stoichiometry. Implications for drug discovery. AAPS J. 11 (1), 167-177 (2009).
- Henderson, B. J., Lester, H. A.
- Banerjee, C., et al. Cellular expression of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor protein in the temporal cortex in Alzheimer's and Parkinson's disease--a stereological approach. Neurobiol Dis. 7 (6 Pt B), 666-672 (2000).
- Ikonomovic, M. D., Wecker, L., Abrahamson, E. E., et al. Cortical α7 nicotinic acetylcholine receptor and β-amyloid levels in early alzheimer disease. Arch Neurol. 66 (5), 646-651 (2009).
- Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
- Kuryatov, A., Luo, J., Cooper, J., Lindstrom, J. Nicotine acts as a pharmacological chaperone to up-regulate human a4b2 acetylcholine receptors. Mol Pharmacol. 68 (6), 1839-1851 (2005).
- Fox, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. The nicotine metabolite, cotinine, alters the assembly and trafficking of a subset of nicotinic acetylcholine receptors. J Biol Chem. 290 (40), 24403-24412 (2015).
- Henderson, B. J., et al. Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors. J Gen Physiol. 143 (1), 51-66 (2014).
- Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
- Ameen, N., Silvis, M., Bradbury, N. Endocytic trafficking of CFTR in health and disease. J. Cyst. Fibros. 6 (1), 1-14 (2007).
- Pauly, J. R., Marks, M. J., Robinson, S. F., van de Kamp, J. L., Collins, A. C. Chronic nicotine and mecamylamine treatment increase brain nicotinic receptor binding without changing alpha 4 or beta 2 mRNA levels. J Pharmacol Exp Ther. 278 (1), 361-369 (1996).
- Govind, A. P., Walsh, H., Green, W. N. Nicotine-induced upregulation of native neuronal nicotinic receptors is caused by multiple mechanisms. J Neurosci. 32 (6), 2227-2238 (2012).
- Mazzo, F., et al. Nicotine-modulated subunit stoichiometry affects stability and trafficking of alpha3beta4 nicotinic receptor. J Neurosci. 33 (30), 12316-12328 (2013).
- Moroni, M., Zwart, R., Sher, E., Cassels, B. K., Bermudez, I. α4β2 nicotinic receptors with high and low acetylcholine sensitivity: pharmacology, stoichiometry, and sensitivity to long-term exposure to nicotine. Mol Pharmacol. 70 (2), 755-768 (2006).
- Tsien, R. Y.
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Fox-Loe, A. M., Dwoskin, L. P., Richards, C. I. Neuromethods: Nicotinic Acetylcholine Receptor Technologies. Ming, L. 117, Humana Press. (2016).
- Khiroug, S. S., et al. Dynamic visualization of membrane-inserted fraction of pHluorin-tagged channels using repetitive acidification technique. BMC Neurosci. 10 (141), (2009).
- Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 11080-11085 (2010).
- Yudowski, G. A., et al. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J Neurosci. 27 (41), 11112-11121 (2007).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
- Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods Cell Biol. 89, 169-221 (2008).
- Paroutis, P., Touret, N., Grinstein, S. The pH of the secretory pathway: measurement, determinants, and regulation. Physiol (Bethesda). 19, 207-215 (2004).
