Summary
pH'ya duyarlı bir florofor ile bir membran proteinin hücre dışı alanını Etiketleme, superecliptic pHluorin (SEP), hücre içi lokalizasyonu, sentezleme ve trafik saptanmasına olanak sağlamaktadır. Görüntüleme toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) proteinleri Eylül-etiketli periferal ER ve plazma membranı protein seviyelerinin ölçümü sağlar.
Abstract
Anlamak membran proteini kaçakçılığı, montaj ve ifade hücre içi organellerin kalanların ve plazma membran üzerinde lokalize olanlar arasında farklılık bir yaklaşım gerektirir. Geleneksel floresan bazlı ölçümler farklı organellere ikamet eden zar proteinleri ayırt yeteneği yoksundur. Kesici kenar metodolojileri toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) ile pH-duyarlı fluorophores bağlanmasıyla geleneksel yöntemlerle aşmak. TIRF aydınlatma, böylece arka plan azalan sinyal gürültü oranını artırmak ve çözünürlük arttırıcı, cam numunesi arayüzünden 150 nm'ye kadar örnek uyarılmaktadır. TIRFM içinde uyarma hacmi gibi periferik ER olarak plazma zarı ve yakındaki organelleri kapsar. Superecliptic pHluorin (SEP) GFP pH'ya duyarlı bir versiyonudur. Genetik olarak ilgi konusu bir membran proteini hücre dışı etki alanına SEP kodlayan fluorofor ile ilgili pozisyonlarıER ve hücre dışı bölgesinde lümen taraf. Eylül pH, 6 daha büyük olduğu zaman, floresan, ancak daha düşük pH değerlerinde kapalı durumda kalır. Bu nedenle, (PM) plazma membranında endoplazmik retikulum (ER) 'de ya da sokulması üzerine bulunan ancak bir trafik vezikül veya Golgi gibi diğer organellere sınırlı değilken Eylül floresan ile etiketlenmiş reseptörleri. ekstrasellüler pH, plazma zarı üzerinde reseptörlerin floresan dikte ayarlanabilir. Aynı hücre için nötr ve asidik hücre dışı pH TIRF görüntüleri arasında floresan farkı, plazma zarı üzerinde reseptör göreli sayısına karşılık gelir. Bu hücre içi ve plazma zarı ikamet reseptörlerinin bir ölçümünü sağlar. ekstrasellüler pH plazma membranı ile füzyonu bir floresan haline geçiş, düşük pH trafik vezikül tekabül eden nötr olduğunda tek vezikül yerleştirme etkinlikleri de ölçülebilir. bu versatilE tekniği membran proteinlerinin lokalizasyonu, ifade ve ticaretini incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Reseptör ifadesi, dağıtım, ve montaj değişiklikler Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, kistik fibroz, ve madde bağımlılığı, 1, 2, 3, 4, 5 dahil olmak üzere hastalıkların geniş bir yelpazede bağlı olmuştur. Örneğin, nikotin ve nikotinik ligandlar kaçakçılığı, ifadesi ve yukarı doğru düzenleme, 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 değişikliklere yol nikotinik asetilkolin reseptörleri (nAChR'ler) kaçakçılığı etkilemektedir. Nikotin, bir hücre içinde bir araya nAChR'lerin sayısı artar, plazma zarının kaçakçılığı artırand bazı alt tiplerinin yüksek hassasiyet sürümünü lehine alt birimlerinin montajını değiştirir. bir hastalık modelinde kaçakçılığı, montaj ve reseptörlerin ifadesinde belirgin değişiklikler çözümleniyor ilaç hedefleri tanımlamak için gerekli olan çok önemli mekanistik ayrıntıları sağlar. Ideal bir yaklaşım hızla hücre içi reseptörler ve plazma membran üzerinde lokalize olanlar arasında ayrım olur. Bu, belirli bir proteinin bir çoğunluğu bu nAChR'lerle gibi, hücre bulunduğu durumlarda, özellikle zordur. nAChR'lerin çoğunluğu endoplazmik retikulum lokalize olduğundan, geleneksel ölçümler salgı yolu boyunca lokalizasyonu ve kaçakçılık değişikliklerini saptamak için gerekli uzay-zamansal çözünürlüğe yoksundur. NAChR'lerin Reseptör kaçakçılığı ve anlatım çalışmaları öncelikle 11 Radyogland bağ, biyotinilasyon deneyleri 12, batı lekeleme 13 veya immünopresipitasyon techniq kullanılarak yapılmıştır ues 12. Bu hücreler, bir raportör molekülü veya tespitin bağlama spesifikliği bağlıdır ve aynı zamanda plazma zarı yerleşik ve hücre içi reseptörler ayırt kabiliyetinden yoksundur. Bu nedenle, iyon kanal montaj ve vezikül dinamikleri çalışmalar büyük ölçüde düşük verimlilik elektrofizyolojik teknikler 14 yararlanmıştır.
Üstün mekansal ve zamansal çözünürlükte floresan mikroskobu gelişmeler ile mümkündür. , Yeşil flüoresan protein (GFP) ve türevleri gibi genetik olarak kodlanmış raportör moleküller, spesifik olmayan bağlama sorunları ortadan kaldırmak ve hassasiyeti 15 artar. Superecliptic pHluorin (SEP) olarak bilinen GFP bir pH duyarlı varyantı, yeri 5, 7, 8 belirlemek için, hücre içinde bölmeler arasında doğal pH farklılıkları yararlanmak için kullanılabilecekref "> 9, 16, 17, 18. Eylül pH 6 daha yüksek olduğunda fluoresces, ancak daha düşük pH değerlerinde bir kapalı durumda kalır. Bu nedenle, lümen tarafında SEP ile etiketlenmiş reseptörleri endoplazmik retikulumda mevcut olduğunda tespit edilir ( bir trafik kesecik sınırlı ER) veya plazma zarı (PM) içine sokulması üzerine, ancak., plazma zarı üzerinde reseptörleri ile temas ekstrasellüler pH manipülasyonu sonuç olarak floresans ve bu reseptörlerin nedenle algılama değiştirir. aynı hücre halinde ardışık olarak nötr ekstrasellüler pH ile 6 daha düşük daha sonra bir pH hem de görüntülenmiş olan, görüntü arasındaki fark, plazma membranı üzerinde bulunan reseptörlere bağlanabilir. Bu, aynı anda hücre içi ölçümünü (periferik ER) ve plazma membran yerleşik reseptörleri 5 karşılaştırın 7, 8 p> 9. hücre dışı pH nötr olduğunda tek vezikül ekleme olaylar da çözülebilir. Düşük pH trafik vezikül plazma membranı ile kaynaştıran sonra, vesikül luminal tarafında floresan 7, 18, 19, 20 bir patlama olarak algılanabilir bir geçiş neden nötr hücre dışı çözeltiye maruz bırakılır. Eylül plazma membranı ve periferik endoplazmik retikulum lokalize reseptörlerin ölçüm sağlar ve bu hücre içi bölgelerde 5, 7, 18 arasında reseptörlerinin kaçakçılığı ölçmek için bir araç sağlar.
plazma membranında yüksek çözünürlük elde etmek için, genetik olarak kodlanmış SEP ile reseptör toplam iç yansıma florasan mikroskobu (TIRFM) tarafından görüntülü. Bu yöntem, özellikle biryararlı reseptörlerin çoğunluğu TIRFM plazma zarı görünürlüğünü arttırır, çünkü hücre içi bölgelere lokalize ise. TIRFM da PM içine sokulması üzerine Eylül-etiketli reseptörleri taşıyan tek veziküllerin kaçakçılığı dinamiklerinin çözünürlüğü sağlar. Toplam iç yansıma bir hücre ve bir cam kapak-slip 21, 22 arasında olduğu gibi, farklı kırılma indislerine sahip malzeme ara yüzeyinde meydana gelir. Cam ve hücre çözümü arayüzünde toplam iç yansıma elde aydınlatmaktadır 488 nm uyarma, ışınlanmış zaman Eylül fluoresces. Bu örnek, bu hacmin içinde sadece heyecanlı fluorophores içine yaklaşık 150 nm nüfuz bir evanescent dalga üretir. ikaz bu aralık içinde nötr pH ortamında reseptörleri içeren sadece Eylül plazma membranı veya periferik endoplazmik retikulum üzerinde bulunan kişilerce karşılık gelen tespit edilir. algılama sınırlı t olduğundanhücre içi bölge kaybolan dalga eşiğe göre O uyarım azalır ve sinyal gürültü oranı, 22 21 arttırılır. Buna ek olarak, hücre toplu nüfuz etmez ışıma, fotohasar zaman içinde canlı hücre görüntüleme sağlayan en aza indirilir. Bunun bir sonucu olarak, TIRFM Eylül salgı yolu boyunca membran reseptörlerinin hücre içi lokalizasyonu ve trafik dinamikleri ölçmek için gerekli olan yüksek çözünürlük ve hassasiyet sağlayan genetik olarak kodlanmış ile birlikte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre Kültürü ve transfeksiyonu
- Büyüme ortamı fare nöroblastom 2a (N2a) hücreleri korumak.
- Yüksek glikoz 200 mi Dulbecco'nun Eagle ortamında (DMEM) 500 mi N2a büyüme ortamı yapmak, 250 mi, serum ortamı, 50 ml cenin sığır serumu (FBS), düşük ve 5 ml penisilin / streptomisin (100 X).
- % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de bir T75 şişesi içinde hücreleri korumak.
- Bölünmüş hücreler 01:15 gerektiğinde, ya da yaklaşık% 80-90 confluency. Bu genellikle haftada 2-3 kez olduğunu.
- Coat 35 mm cam poli-D-lizin ile alt çanak.
- Laminer akış biyo-güvenlik kabini, steril 35 mm çanak cam alt bölgesi üzerine 0.1 ug / ml poli-D-lisin 200 ul ekle.
- 1 saat boyunca 37 ° C kuluçka makinesi içinde çanak yerleştirin.
- Dikkatle GKD 2 O 3-4 kez yemek durulayın.
- Birden fazla 1 saat boyunca yemekler tamamen kurumasını bekleyin.
- SterilGerekirse biyogüvenlik kabini UV ışık kullanarak yemekleri ize.
- TIRFM görüntüleme için N2a hücreler plaka.
- yapışık hücrelere büyüme ortamı çıkarın.
- % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 5 dakika süreyle 1 ml 1 x tripsin (+ EDTA) ile inkübe edilerek şişe bundan sonrakinden hücrelerin ayrılmaları.
- 9 ml büyüme ortamı ekleyerek tripsin inaktive. Bir pipet kullanarak medya, tripsin ve müstakil hücreleri karıştırın.
- Görme hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısı ve her bir poli-D-lizin kaplı cam alt çanak 90.000 hücre eklemek için doğru hacmi hesaplamak. Bu yoğunluk etkin transfeksiyon ve tek bir hücre TIRF görüntüleme için gereklidir.
- 90.000 hücreleri içeren her cam alt çanak 2 ml büyüme ortamı ekleyin.
- 16-24 saat süreyle% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin çanak.
- N2A transfeksiyon
- dahil bir Eylül fluorofor içeren bir plazmid yapı eldeilgili proteinin hücre-dışı bölümü içine. Bu PCR amplifikasyonu 5 gibi standart klonlama teknikleri yapı oluşturmak için de kullanılabilir.
NOT: endoplazmik retikulum veya trafik veziküllerin lümeni içinde bulunduğu ve plazma membranı üzerinde hücre dışı çözeltisine maruz kaldığı Eylül membran proteini hücre dışı bölgesinin dahil edilmesi gerekir. GFP ve benzeri klonlama stratejileri kullanılabilir SEP boyutu benzer. - 1.5 mi düşük serum ortamında kaplama hücreleri üzerinde büyüme ortamı yerine (örneğin, Opti-MEM), yaklaşık 30 dakika transfeksiyon reaktifi ilave edilmeden önce.
NOT: reseptörleri ilacın yol açtığı değişiklikleri incelemek için, ilacın, uygun bir konsantrasyonu, transfeksiyon zamanı eklenebilir. - 250 ul düşük serum ortamı oluşturmak her istenilen plazmid 500 ng ekleyin (tüp 1).
- Ayrı bir tüp c transfeksiyon reaktifi 2 ul ekleindirgenmiş serum ortamı içeren gruptur 250 ul. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında boru 2 inkübe edin. DNA plazmid transfeksiyon reaktifi oranı her bir ilgi proteini ifade etmek üzere optimize edilmelidir.
- transfeksiyon reaktifi ve plasmid karışımı, 500 ul içeren bir solüsyonun hazırlanması için tüpler 1 ve 2 bir araya getirin. 25 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- tabak başına 2 ml'lik toplam hacmi 500 ul transfeksiyon karışımı önceden kaplama hücreleri ekleyin.
- 24 saat boyunca bir% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe hücreleri.
- 24 saat sonra, transfeksiyon karışımı çıkarın ve büyüme ortamı ile hücrelerin yıkayın ve daha sonra her bir tabak için büyüme ortamının 2 ml ekleyin.
NOT: Bir ilaç transfeksiyon zamanı ilave edildi, bu, bu aşamada daha doldurulan olabilir. - 24 saat boyunca bir% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe hücreleri.
- Görüntü hücreleri transfeksiyondan 48 saat sonra.
- dahil bir Eylül fluorofor içeren bir plazmid yapı eldeilgili proteinin hücre-dışı bölümü içine. Bu PCR amplifikasyonu 5 gibi standart klonlama teknikleri yapı oluşturmak için de kullanılabilir.
Toplam In tarafından 2. Canlı Hücre Görüntülememodu, harici Yansıma Floresan Mikroskobu (TIRFM)
- Görüntüleme kurmak
- Şekil 1 'de gösterildiği gibi bir tarama aşaması ile ters flüoresan mikroskop kurulumu ile görüntüleme gerçekleştirin. Bu 488 nm DPSS lazer kaynağının hizalanmasını gerektirir bir kademeli motor 488 nm ışın pozisyonu ve yüksek sayısal aralığı (1.49 NA) 60X ya 100X yağ daldırma objektif ayarlayın.
- Uygun uyarma filtresi (bant geçiş 488/10 nm) aracılığıyla lazer ışını geçirin. Bir step motora monte edilmiş bir başlatıcısı bağlı bir tek modlu fiber üzerinden polarize lazer ışını aynı hizaya getirin. Epifloresans modunda, uyarma ışın hedefi arka diyafram ortasında merkezli.
- kritik açı ulaşıldığında ve kiriş artık numune boyunca iletilir ve yerine tamamen cam cel yansıyan kadar TIRF elde etmek için, objektif lens arka diyafram boyunca odaklanmış bir lazer ışını çevirmek için step motor kullanmakl arayüzü.
- Uygun emisyon filtresi ile görüntüleme yazılımı (örneğin Metamorph) ile kontrol edilen bir EMCCD (512 x 512 piksel) kullanarak Yakalama görüntüleri emisyon yolunda monte (525/50 nm).
- Görüntüleme çözüm hazırlayın
- GKD 150 mM NaCI, 4 mM KCI, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM HEPES ve 10 mM glükoz karıştırılarak 200 mi hücre dışı çözelti (EİS) hazırlanması 2 O stok çözeltileri NaCI, KCI, MgCI2, ve CaCl2 önceden hazırlanmış ve görüntüleme gününde taze HEPES ve glikoz ile kombine edilebilir.
- pH 7,4-100 mi ECS ihtiva eden bir çözeltinin pH'ının ayarlanması. 5.4 arasında bir pH değerine ECS kalan 100 ml ayarlayın. ECS 2 ml (pH 7.4) ile transfekte hücrelerin durulayın.
- görüntüleme önce transfekte hücrelere ECS 2 ml (pH 7.4) eklenir.
- TIRF Canlı hücre görüntüleme
- includin tüm sistemi açıng 488 nm lazer, kamera, çeviri sahne ve görüntüleme programı. Epifloresans ışını Odak ve 60X objektif yaklaşık 1 mW güç ayarlayın.
- amaç yağ ekleyin ve çeviri sahnede transfekte hücrelerin bir tabak koyun. Hücreler birden çok kez görüntülenmiş olabilir bu yüzden sahneye göre hareket etmiyor sağlamak için sahne bağlar kullanarak yerine çanak sabitleyin.
- Epifloresans modunda, mikroskop odak ve floresan, transfekte hücreler bulun. Hücreler çeşitli odak düzlemleri boyunca odaklanmaya devam edecektir. TIRF ile devam etmek tek izole hücreler bulun.
- görüntüleme programı, 200 milisaniye maruz kalma zamanını ayarlamak ve EM kazanç ayarlayarak floresan yoğunluğu optimize.
- step motor kullanılarak kademeli bir şekilde objektif karşısında ışını çevirerek TIRF içine lazer ışınını Geçiş. o th yakınsar kadar kritik açı yaklaşırken, kiriş gözle görülür yemeğin kenarı boyunca tercüme edecektirÖrnek uçakta toplam iç yansıma e noktası.
- Hücreler odak düğmesini ayarlayarak TIRF modunda olduğundan emin olun. TIRF, hücrelerin sadece bir düzlemde, plazma membranının yüksek çözünürlüğe sahip bir çok tanımlanmış bir görüntü üreten (cam arayüzünden, yani yaklaşık olarak 150 nm) odaklanabilir.
- Hücre içi lokalizasyonu belirlemek için görüntüleme Eylül
- Görüntüleme düzlemde sağlıklı, transfekte tek hücreleri bulun.
- pH 7.4 hücrenin odaklanmış bir görüntü kazanır. Eylül görünür olmalıdır plazma zarı ve endoplazmik retikulum üzerinde reseptörleri etiketli.
- Hızlı photobleaching önlemek için örnek ulaşmasını lazer ışınını bloke eder.
- Birden fazla xy yeri kayıt yeteneğine mikroskop görüntüleme yazılımı kullanarak her hücreye karşılık gelen sahne pozisyonları ezberleyin.
- yazılımı kullanırken çanak başına 20-30 hücreleri için adımları tekrarlayın 2.4.1-2.4.4 her hücrenin konumunu kaydetmek için.
- AfpH 7.4'te tüm hücre görüntüleri toplanan ter, elle pipet kullanarak pH 7.4 ECS çözüm kaldırmak. Bu ezberlemiş sahne pozisyonları hareket olabilir gibi çanak dokunmayın.
- Dikkatle çanak pH 5.4 ECS 2 ml ekleyin ve 10 dakika bekleyin. Bu süre zarfında, önceden edinilmiş görüntüleri kaydetmek.
- PH 7.4 görüntüleri toplamak kaydedilen her pozisyona sahne taşımak ve pH 5.4 de aynı hücrede bir görüntü elde etmek için kullanılan koşullar aynı set altında. algılanan tüm floresan reseptörleri etiketli Eylül sınırlı endoplazmik retikulum kaynaklı beri Hücreler daha az tanımlanmış bakmak gerekir. pH 5.4 hücre görüntüleri kaydedin.
- Canlı hücrelerde Görüntüleme tek vezikül ekleme olaylar
- 2 mi, pH 7.4 ECS ile transfekte edilmiş hücrelerin büyüme ortamı yerine veya Leibovitz L-15 ortamı ile. Leibovitz L-15 ortam maddesinin pH değeri, gerekirse görüntüleme uzun bir süre boyunca meydana sağlayan CO2 bağımsızdır.
- Placmikroskop sahnede transfekte hücrelerin çanak e. Güvenli ve yukarıdaki Adım 2.3 aşağıdaki TIRF tek bir hücreyi odaklanır.
- Varsa odak görüntüleme süresi boyunca kayması değil böylece, otofokus ayarlayın.
- Sürekli 200 msn bir kare hızında fotoğraf çekimi, 1.000 kare bir dizi kaydedin. floresan patlamaları dışı pH 7.4 SEP açığa plazma zarı ile kaynaştırarak düşük pH kaçakçılığı veziküller karşılık, bu süre içinde görünür olacaktır.
- başka bir tek hücreyi bulup yukarıdaki adımı tekrarlayın. Gerekirse otofokus sıfırlayın.
3. Görüntü Analizi ve Veri İşleme
- Eylül floresan analiz hücre içi lokalizasyonu belirlemek için
- Bu Metamorph ya ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/) gibi bir görüntü analizi yazılımı kullanılarak hücre görüntüleri açın. yuvarlanan top ayarını kullanarak hem pH 5.4 ve pH 7.4 görüntüleri arka plan çıkarın.
- tek bir hücreden floresan ölçmek için bir yoğunluk threshold kullanın. El ile pH 7.4 görüntüdeki hücrenin çevresinde ilgi bir bölge seçin.
- , Hücre alanını ölçün yoğunluğu ortalama ve entegre yoğunluk ImageJ bir eklenti kullanarak veya Analiz sekmesi altında "Tedbir" fonksiyonu yerleşik kullanarak.
- dikkatle aynı şekilde ilgi yoğunluğu tabanlı eşiği ve bölgeyi ayarlama, pH 5.4 aynı hücre için adımlar 3.1.1-3.1.3 tekrarlayın.
- Entegre yoğunluğu hem pH 7.4 ve 5.4 hücre görüntüler için elde edildikten sonra, pH 7.4 değeri, pH 5.4 değeri çıkarılarak plazma zarı entegre yoğunluğunu hesaplar. Fark TIRF uyarma bölgede plazma zarı üzerinde göreli sayı reseptörlerine karşılık gelir.
- İnsan ticareti bir tedbir olarak, SEP göreceli yüzdesi TIRF excitati görünür kalan reseptörlerine kıyasla plazma zarı üzerinde bulunan reseptörler etiketli hesaplamak100 ile çarpılarak pH 7.4'de toplam entegre yoğunluğu ile yoğunluğu entegre plazma zarı, bölerek birimde.
- Tek vezikül ekleme olayları analiz
- görüntü analiz yazılımı kullanılarak 1.000 tiff görüntü serisi açın. yuvarlanan top ayarını kullanarak tüm kareleri arka planı çıkarma.
- Ekleme olayları mesaneye gelen yoğun bölgeleri maksimize etmek kaydın renk dengesini ayarlar. El ile daha uzun 3 kare (> 600 msn) süren floresan patlamaları saymak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir reseptör olarak Eylül dahil canlı bir hücreye reseptörün doğrudan tespit edilmesine olanak sağlar. TIRFM ile birleştiğinde, bu plazma zarı ve TIRF uyarma bölgede hücre içi yerlerinizdeki reseptörlerin dağılımı üzerindeki bağıl ifade seviyelerinin değerlendirilmesini sağlar. Tek vezikül kaçakçılığı olayları da çözülebilir.
Plazma Zarında Eylül-etiketli Reseptör göreli İfade Düzeyleri
uyarıldığında Eylül floresans çevre solüsyonun pH'ına göre belirlenir. Eylül plazma membranı yerleşik reseptörleri ile kaynaşık olduğu zaman, hücre dışı pH, ya da 5, 7, 8, 9, 17 kapalı bu floresan açmak için manipüle edilebilir. tHHücre dışı çözeltinin e pH'ı fizyolojik 7.4, plazma membran ve TIRF uyarım floresan bölgesi içinde endoplazmik retikulum hem reseptörleri. hücre dışı çözelti daha sonra pH 5.4 bir başka benzer çözeltisi ile değiş tokuş edilebilir. Bu, tüm gözlenen floresan endoplazmik retikulum artık anlamı, Eylül kapalı duruma geçiş plazma zarı ikamet neden olur. Şekil 2, her iki pH 7.4 (A) ve pH değeri 5.4 (B) 'de görüntülenmiştir hücrelerin bir örneği göstermektedir. TIRF uyarma bölgedeki çevresel endoplazmik retikulum ile karşılaştırıldığında plazma zarının üzerinde yer alan reseptörlere göreli sayı daha sonra Şekil 2C temsil pH 7.4, o gelen pH 5.4 floresan entegre yoğunluğunu çıkarılarak matematiksel olarak hesaplanır. Bu hesaplanan plazma zarı entegre yoğunluklu plazma membran üzerinde bulunan Eylül-etiketli reseptörlerinin göreceli sayıda ve TIRF uyarma içinde gelirhacmi. plazma zarı ve yakındaki periferik endoplazmik retikulum TIRF ile tercihen heyecanlı olmak olduğundan, bu hücre içi dağıtım karşılaştırma bu bölgelere lokalize reseptörler arasında ve hücre değil, tüm hücre içi bölgesi.
Eylül-etiketli Reseptör hücre içi Dağılımı
reseptörlerinin Trafik endoplazmik retikulum kıyasla plazma membranında bulunan reseptörler arasındaki oranı karşılaştırılarak ölçülebilir. 100 ile çarpılarak pH 7.4'de toplam entegre yoğunluğu ile yoğunluğu entegre plazma zarı, Bölme, plazma membranı 5 7 üzerinde bulunan Eylül-etiketli reseptörlerinin bir göreli yüzdesini vermektedir. Bir kontrol olarak, bir hücre içi protein trafiğini bozmaya hücrelere ilave edilebilir Brefeldin. Brefeldin yaparken bir neredeyse tespit rece tüm mevcutTIRF uyarma bölgesi içinde ptors daha düşük bir% PM elde endoplazmik retikuluma sınırlı olacaktır. Buna ek olarak, mutasyona uğramış (Δ508-I539T) sistik fibroz transmembranı regülatör (Δ508-I539T-CFTR) bir pozitif kontrol olarak kullanılabilir. 2 ila 3 katlık bir hücre yüzey kısma ilişkin ticari olarak temin edilebilen, VX-809, Δ508-I539T-CFTR ifade mevcudiyetinde.
Tek Vezikül Yerleştirme Etkinlikleri
Eylül floresan veya bir nakil vezikül düşük pH ışıkla ağartıcı, ancak plazma zar 7, 16, 18 7.4 hücre dışı bir pH'a maruz kaldığında fluoresans kavuşur etmez. Sokma olgularının, plazma membranı içine taşınmasına vezikül tam kadar füzyona karşılık gelen, en az 3 çerçeve (600 milisaniye) kalıcı plazma membranında floresan bir patlama olarak görselleştirilebilir Şekil 3'te gösterildiği gibi. Bir sokma (Şekil 3B) önce fark edilebilir kayması mevcut olduğunda. Hücre (- 3H Şekil 3H) toplu floresan içine dahil kadar, - (3G Şekil 3D) taşıma vezikül zarından difüzyon, (Şekil 3C) geldiğinde floresan yoğunluğunda bir artış görülmektedir.
Şekil 1: TIRF Mikroskop şematik. Bu TIRF kurulum Eylül uyarma, hedefin arka diyafram boyunca ışını çevirerek uyarma demetinin kritik açısını ayarlamak için bir adım motoru bağlanmış elyaf için 488 nm DPSS lazer kullanır. Hücreler 60X, 1.49 NA immersiyon yağı hedefi kullanarak görüntülü. Emisyon cihaz bağlanmış elektron-çarparak şarj kullanılarak tespit edilir.dosyaları / ftp_upload / 55466 / 55466fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Plazma Membran Expression ve Ticareti. PH 7.4 (A) α3-Sep / β4-wt nAChRs eksprese bir N2a hücresi plazma zarının ve endoplazmik retikulum yer reseptörleri gösterir. PH 5.4 (B) 'de, plazma zarı üzerinde reseptörler böylece sadece endoplazmik retikulum yerleşik reseptörleri görebilir, floresan değildir. PH 7.4 ve pH 5.4 (C), entegre yoğunluk farkı, plazma zarında lokalize olmuş alıcılara karşılık gelir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Tek veziküllü Yerleştirme Olay. Hücre dışı bir pH 7.4 ile α3-Sep / β4-wt nAChRs eksprese bir N2a hücresi (A) 'da gösterilmektedir. Hemen bir ekleme (B) önceki, floresan hiçbir patlama görülebilir. SEP taşıyan insan ticareti vezikül (C) geldiğinde, ve Eylül-etiketli reseptörleri plazma zarından diffüz (D - G) daha önce eklenen reseptörleri farksız kadar (H - I). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SEP pH duyarlılığı, plazma zarı üzerinde bulunan reseptörler endoplazmik retikulum hücre içi reseptörler ayırt edilmesini sağlar ve sokma olayları çözmek için kullanılabilen reseptör taşıyan veziküller 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 . Yüzey biyotinilasyon ve ligand dahil olmak üzere çeşitli teknikler yaygın protein yüzey düzeylerini ölçmek için kullanılır bağlayıcı. Bazı durumlarda, Western blotlar da ER ve PM yerleşik protein ayırt etmek için kullanılabilir. Bu Eylül tabanlı teknik yüzey ifadesinin hızlı okuma ve PM ER lokalize protein vardiya ölçmek için yeteneği sağlayan, geleneksel ölçümlere tamamlayıcıdır. SEP bu yana genetik, ilgilenilen protein nonspe ile sorunları kodlanmışreli ortadan kalkar bağlanması ve duyarlılık artar. Eylül nötr pH'ta 488 nm eksitasyon maruz kalır, fakat pH <6, asidik koşullar altında heyecan değildir. Ekstrasellüler pH 7.4 olduğu zaman, flüoresan, endoplazmik retikulum ve plazma membranı üzerinde bulunan nAChR'ler için ölçülmüştür, ama düşük olmayan pH salgı vezikülleri veya Golgi olanlar için (pH <6) 23. görüntüleme sırasında, pH 7.4 ECS pH 5.4 bir diğer açılardan aynı olan çözelti ile değiştirilir. Bu görüntülerin entegre yoğunluk farkı, bir hücrenin plazma zarı entegre yoğunluğudur. 100 ile çarpılarak, pH 7.4, en TIRF uyarma bölgesi içinde toplam entegre yoğunluk edilen sayının, plazma membranında 5, 7, 8, 9 yüzdesini vermektedir. Bu çalışmalar, TIRFM kullanırken, içindeki deneyler epi-floresan kullanılarak gerçekleştirilebilir.dar uyarma hacmi hücre içi reseptörlere karşı görünür PM ikamet reseptörlerinin kısmını artar, çünkü reseptörlerinin bir çoğunluğu ER ikamet nAChR'nin gibi membran reseptörleri için TIRM idealdir. Bu organeller arasındaki reseptör dağılımı kaymalar testin hassasiyetini artırır. PM daha yüksek ifade düzeyleri ile proteinler için, epi-floresan tabanlı Eylül çalışmalar reseptör ifade değişikliklerini ölçmek için yeterlidir. Ancak, aynı zamanda pH 7.4'te ölçülen tek vezikül ekleme olayları TIRFM gerektirir. kolayca tipik epi-floresan içinde ayırt edilmez TIRFM görülen ise yüksek pH plazma zarı ile kaynaştırarak düşük pH kaçakçılığı vezikül tekabül floresan patlaması.
TIRF Görüntüleme Koşullarına SEP birleştirilerek
Eylül genetik bir membran proteininin hücre dışı etki alanına dahil edilebilir. Nedeniyle SEP'in boyutu ve konumu, bu verif için önemlidir değiştirilmiş protein önemli ölçüde yabani tip proteinden trafiklemesi ya da fonksiyonunda farklılık Y. Deneyler, Eylül aktivitesi bozmayacak mi etiketin bu birleşme doğrulamak için protein etiketli kullanılarak yapılmalıdır. Diğer reseptörler için floresan ligan bağlama ve Western lekeleme yolu kaçakçılığı doğrulamak için kullanılabilir ise iyon kanalları için, elektrofizyoloji ve iyon geçirgenliği ölçümleri, idealdir. Onlar cam alt çanak doğrudan bağlanan çünkü yapışan hücreler ideal TIRFM ticari transfeksiyon reaktifleri ile transfeksiyon ve görüntüleme için uygundur. Bu ek cam numunesi arayüzü ila yaklaşık 150 nm olan çabuk kaybolan dalga tarafından TIRF uyarılması için gereklidir. Yüksek çözünürlüklü TIRF görüntüler elde etmek, örnek görüntüleme 21 sırasında düz kalması gerekiyor. Bu düz bir yüzey sağlamak için, hücre hareketleri en aza indirir bir bağlantı matrisi için N2a hücreleri görüntülerken poli-D-lisin kaplama faydalıdırlass = "xref"> 7. Kaplama hücre yoğunluğu hücreleri TIRF elde etmek için cam tabak üzerinde izole edilir sağlamak için optimize edilmesi gerekmektedir. Hücre kümeleme tek bir optik düzlemde düz hücre yapışmasını önleyerek toplam iç yansıma engellemektedir. tek bir düzlem TIRF odaklanmıştır için, uygun bir hücre morfolojisini muhafaza görüntüleme için çok önemlidir. çözümler Eylül çalışmalarında alışverişinde ediliyor, bu özellikle önemlidir. morfolojik değişiklikler en aza indirmek için, pH 7.4 ve pH 5.4 de görüntülerin hızlı bir şekilde toplanması gerekmektedir. Buna ek olarak, ECS (pH 5.4) sonunda organel yapısı ve iç Eylül-etiketli reseptörlerinin floresan değiştirerek, hücre içi membranlar nüfuz edecektir. Bu kolay bir kaç dakika içinde her bir pH koşulları altında görüntü toplama önlenir. Aynı görüntüleme oturumu birden yemekler verileri analiz hücrelerin sayısını arttırmak için bir araya getirilebilir. çözümler değiştirirken dikkatli ECS t içine damla damla pH değeri 5.4 bir pipet ile pH 7.4 ECS çözüm kaldırmak ve eklemekO çanak. Çıkarma veya hücreleri stres veya kayıtlı sahne konumlarına göre çanak taşıyabilirsiniz çok çabuk çözüm sözlerine ekledi. değişimi çözümlere bir perfüzyon sistemi çözelti değişimi tamamlandıktan ve hızlı bir şekilde meydana geldiği sürece, kullanılabilir. Her bir çözelti içinde tam bir tuzu konsantrasyonlarının hücre bozulmaları en aza indirmek için gereklidir. Bir sahne üst inkübatör görüntüleme sırasında sıcaklık dalgalanmaları azaltmak için dahil edilebilir.
TIRF Görüntüleme
TIRF görüntüleme tek bir optik düzlem üzerinde odaklanarak arka floresan azaltır. Bu cam Örnek arayüzü 21, 22 yaklaşık 150 nm olan seçici verici florofor ile sinyal gürültü oranını arttırır. Bu bölge içinde, çözünürlük büyük ölçüde, özellikle plazma membranında, artar. reseptörlerinin çoğu hücre içinde bulunurlar, bu gereklidir. membran reseptörlerinin yüksek bir pay iseplazma membran üzerinde bulunan, bu Eylül dayalı yaklaşım Epifloresans içinde hücre içi lokalizasyonu belirlemek için kullanılabilir. Toplam reseptörlerinin küçük bir yüzdesi, plazma zarına trafiğe Ancak, nAChR'lerin olduğu gibi, TIRFM plazma membranında floresan pH değişikliklerinin ölçmek için gereklidir. Ayrıca, TIRFM tek vezikül kaçakçılığı olayları ve salgı yoluna içindeki reseptörlerin dağılımı çözünürlüğü sağlar. Temel TIRF kurulum Eylül uyarma, uyarma kiriş kritik açısını ayarlamak için bir adım motoru bağlanmış elyaf için 488 nm DPSS lazer kullanır. kritik açı ulaşana kadar TIR elde etmek için, ışın hedefi arka diyafram boyunca yanal çevrilmiştir. Hücreler 60x veya 100X, 1.49 NA immersiyon yağı hedefi kullanarak görüntülü. örnek (hücreler için> 1.38) kırılma endeksine göre daha yüksek bir sayısal açıklık TIRF için kritik açı ulaşmak için gereklidir. A 1.45 NA objektif yeterli, ama 1.49 oluruyarma açısını işlenirken NA daha pratiktir. Emisyon 512 x 512 piksel 8 mm'lik bir dizisi ile bir elektron-çarparak şarj akuplaj düzenli (EMCCD) kullanılarak tespit edilir. 60X objektif kullanarak, birden çok yalıtılmış hücreler görüş bir alan içinde yakalanabilir.
Protein ekspresyonu dayalı çalışmaları floresan önemli dezavantajlarından biri 15 ışıkla ağartma edilir. Bu, oradaki uyarılma zaman, flüoresans yoğunluğunda bir geri dönüşü olmayan bir azalma florofor sonuçları ayrışmasını neden olmuştur. Bu nedenle, başarılı bir görüntüleme EMCCD içinde kullanılan uyarım ve bütünleşik kazanç ışınının yoğunluğu arasında hassas bir dengeye dayanmaktadır. uyarım yoğunluğu hızlı molekül photobleach olarak saptanması için bir flüorofor uyarmak üzere yeterince yüksek, ancak çok yüksek olmadığı olması gerekir. Kamera kazanımını artırmak uyarım yoğunluğuna karşı, saptama için sinyal çarpma için kullanılabilir, ancak bu aynı zamanda arka artırırtensit. Görüntülerin doygunluğunu önlemek için, EM kazanç ayarlarını seçerken Buna ek olarak, dikkat edilmelidir. numune photobleaching en aza indirir ulaşmadan ölçümler arasında ise, uyarma ışını engelleme. pH 5.4 karşılaştırmak için pH 7.4 bir ECS hücre görüntüleri toplarken bu gereklidir. iki görüntü arasında meydana gelen ışıkla ağartma bağlı pH değişikliği floresan eksikliğinden ayırt edilemez, yani bu etki en aza indirilmesi gerekmektedir. Bakım düşük lazer güç kullanmak ve sadece gerekli görüntüleri yakalamak için gerekli süre hücreyi ortaya çıkarmak için alınmalıdır. Her deney için, bir hücre grubu, bir kontrol olarak aynı görüntüleme koşulları altında pH 7'de ölçülebilir. Hiçbir aralığı kullanarak ve tayinin gerçekleştirilmesi için gerekli olan pozlama süresi eşleşen bir süre için maruz photobleaching kapsamını belirlemek için bir kontrol sağlar. ışıkla ağartma orjinal yoğunluğunun% 10'dan fazla ise, düzeltme eğrisi görülmektedir ışıkla ağartma sıçandan kullanılabilirfloresan yoğunluğu bir zaman izini toplayarak, e. Tek vezikül ekleme etkinlikleri için pH kapalı bir devlet belirler ya, çünkü veziküllerin kaçakçılığı reseptörleri plazma zarı ile füzyon kadar heyecanlı değil Eylül etiketli ya da uyarma TIRF bölge dışında bulunmaktadır. Bu nedenle, Eylül reseptörleri yüksek uyarma gücü tek Eylül molekülleri tespit etmek için kullanılmasına izin, ekleme kadar photobleach olmaz etiketlenmiş.
Sonuç olarak, bu teknik, yapışık hücre tiplerinde kullanılabilir. Eylül protein işlevi ve trafik özellikleri korunur sürece, hemen hemen herhangi bir zar proteini içine dahil edilebilir. TIRF plazma membranında çözünürlüğü artırır. Eylül periferik endoplazmik retikulum içinde olanlardan plazma membranı üzerinde bulunan etiketli proteinlerin farklılaşmasını sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm2 | VWR | 82050-856 | |
| 35 mm glass bottom Petri dishes, sterile | Cell E&G | GBD00002-200 | |
| Poly-D-lysine | vwr | 215017510 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Fisher Scientific | 11-965-084 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco / Fisher Scientific | 31-985-088 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered) | Gibco / Fisher Scientific | 16-000-044 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Fisher Scientific | 12604-021 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | VWR | 45000-652 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco / Fisher Scientific | 21083027 | Optional |
| Lipofectamine | Fisher Scientific | 11668030 | Gently mix; Do not vortex |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-10 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Objective immersion oil | Olympus | Type F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Microscope | Olympus | IX81 | |
| Camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 60X, 1.49 NA oil immersion objective | Olympus | APON 60XOTIRF | |
| Motorized stage | Prior | IXPROXY | |
| Motorized actuator (stepper motor) | Thorlabs | ZST213 | |
| MetaMorph (or other imaging program) | Metamorph | ||
| 488 nm laser | Market Tech | ||
| Single mode fiber | Thorlabs | SM450 | |
| Mirrors | Thorlabs | BB1-E01 | |
| Dichroic 488 nm LP | Semrock | Di02-R488-25x36 | |
| Bandpass filter, 488 nm | Semrock | LL01-488-12.5 | |
| Bandpass filter, 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 |
References
- Lester, H. A., et al. Nicotine is a selective pharmacological chaperone of acetylcholine receptor number and stoichiometry. Implications for drug discovery. AAPS J. 11 (1), 167-177 (2009).
- Henderson, B. J., Lester, H. A.
- Banerjee, C., et al. Cellular expression of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor protein in the temporal cortex in Alzheimer's and Parkinson's disease--a stereological approach. Neurobiol Dis. 7 (6 Pt B), 666-672 (2000).
- Ikonomovic, M. D., Wecker, L., Abrahamson, E. E., et al. Cortical α7 nicotinic acetylcholine receptor and β-amyloid levels in early alzheimer disease. Arch Neurol. 66 (5), 646-651 (2009).
- Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
- Kuryatov, A., Luo, J., Cooper, J., Lindstrom, J. Nicotine acts as a pharmacological chaperone to up-regulate human a4b2 acetylcholine receptors. Mol Pharmacol. 68 (6), 1839-1851 (2005).
- Fox, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. The nicotine metabolite, cotinine, alters the assembly and trafficking of a subset of nicotinic acetylcholine receptors. J Biol Chem. 290 (40), 24403-24412 (2015).
- Henderson, B. J., et al. Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors. J Gen Physiol. 143 (1), 51-66 (2014).
- Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
- Ameen, N., Silvis, M., Bradbury, N. Endocytic trafficking of CFTR in health and disease. J. Cyst. Fibros. 6 (1), 1-14 (2007).
- Pauly, J. R., Marks, M. J., Robinson, S. F., van de Kamp, J. L., Collins, A. C. Chronic nicotine and mecamylamine treatment increase brain nicotinic receptor binding without changing alpha 4 or beta 2 mRNA levels. J Pharmacol Exp Ther. 278 (1), 361-369 (1996).
- Govind, A. P., Walsh, H., Green, W. N. Nicotine-induced upregulation of native neuronal nicotinic receptors is caused by multiple mechanisms. J Neurosci. 32 (6), 2227-2238 (2012).
- Mazzo, F., et al. Nicotine-modulated subunit stoichiometry affects stability and trafficking of alpha3beta4 nicotinic receptor. J Neurosci. 33 (30), 12316-12328 (2013).
- Moroni, M., Zwart, R., Sher, E., Cassels, B. K., Bermudez, I. α4β2 nicotinic receptors with high and low acetylcholine sensitivity: pharmacology, stoichiometry, and sensitivity to long-term exposure to nicotine. Mol Pharmacol. 70 (2), 755-768 (2006).
- Tsien, R. Y.
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Fox-Loe, A. M., Dwoskin, L. P., Richards, C. I. Neuromethods: Nicotinic Acetylcholine Receptor Technologies. Ming, L. 117, Humana Press. (2016).
- Khiroug, S. S., et al. Dynamic visualization of membrane-inserted fraction of pHluorin-tagged channels using repetitive acidification technique. BMC Neurosci. 10 (141), (2009).
- Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 11080-11085 (2010).
- Yudowski, G. A., et al. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J Neurosci. 27 (41), 11112-11121 (2007).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
- Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods Cell Biol. 89, 169-221 (2008).
- Paroutis, P., Touret, N., Grinstein, S. The pH of the secretory pathway: measurement, determinants, and regulation. Physiol (Bethesda). 19, 207-215 (2004).
