Summary
Labelen van de extracellulaire domein van een membraaneiwit met een pH-gevoelige fluorofoor, superecliptic pHluorin (SEP), maakt lokalisatie, expressie en mensenhandel worden bepaald. Imaging september-gemerkte eiwitten met totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) maakt de kwantificering van eiwitniveaus in de perifere ER en plasmamembraan.
Abstract
Inzicht membraaneiwit mensenhandel, assemblage en expressie vereist een aanpak die onderscheid maakt tussen degenen die woonachtig zijn in de intracellulaire organellen en die gelokaliseerd op het plasmamembraan. Traditionele fluorescentie metingen niet de mogelijkheid om membraaneiwitten die in verschillende organellen onderscheiden. Cutting edge methodologieën overstijgen traditionele methoden door het koppelen van pH-gevoelige fluoroforen met een totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM). TIRF verlichting wekt het monster tot circa 150 nm van het glas-monsterscheidingsvlak dus afneemt achtergrond, waardoor de signaal-ruisverhouding en verbeteren resolutie. De excitatie volume TIRFM omvat het plasmamembraan omgeving organellen zoals de perifere ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is een pH-gevoelige versie van GFP. Genetisch codeert september in het extracellulaire domein van een membraaneiwit plaats positioneert het fluorofoor opde luminale zijde van het ER en het extracellulaire gebied van de cel. September fluorescerend als de pH hoger dan 6, maar blijft in de uit-toestand bij lagere pH-waarden. Daarom receptoren gelabeld met september fluoresceren wanneer geïntegreerd in het endoplasmatisch reticulum (ER) of bij het inbrengen in het plasmamembraan (PM) maar niet als beperkt tot een handel blaasje of andere organellen zoals het Golgi. De extracellulaire pH kan worden ingesteld op de fluorescentie van receptoren dicteren op het plasmamembraan. Het verschil in fluorescentie tussen TIRF beelden bij neutrale en zure pH voor extracellulaire dezelfde cel overeen met een relatieve aantal receptoren op het plasmamembraan. Dit maakt een gelijktijdige meting van intracellulaire en plasmamembraan resident receptoren. Single blaasje inbrengen gebeurtenissen kunnen ook worden gemeten wanneer de extracellulaire pH-neutraal, wat overeenkomt met een lage pH mensenhandel blaasje fuseren met het plasmamembraan en de overgang naar een fluorescerende toestand. dit versatile techniek kan worden benut om de lokalisatie, expressie, en de handel van membraaneiwitten te bestuderen.
Introduction
Veranderingen in receptorexpressie, distributie en montage zijn verbonden met een groot aantal ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer, ziekte van Parkinson, cystische fibrose, en drugsverslaving 1, 2, 3, 4, 5. Bijvoorbeeld nicotine en andere nicotine liganden beïnvloeden de handel in nicotinische acetylcholinereceptoren (nAChRs) hetgeen leidt tot veranderingen in de handel, expressie en opregulatie 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Nicotine verhoogt het totale aantal verzamelde nAChRs in een cel verhoogt handel naar de plasmamembraan, eend verandert de assemblage van subeenheden om een hoge gevoeligheid versie van bepaalde subtypen bevorderen. Het oplossen van verschillende veranderingen in de handel, assemblage, en de expressie van receptoren in een ziektemodel biedt cruciale mechanistische details die essentieel zijn voor drug targets te definiëren zijn. Een ideale aanpak zou snel onderscheiden intracellulaire receptoren en die gelokaliseerd op het plasmamembraan. Deze Vooral in gevallen waarin een meerderheid van een bepaald eiwit intracellulair bevindt, zoals bij nAChRs. Aangezien het merendeel van de nAChRs worden gelokaliseerd in het endoplasmatisch reticulum, traditionele metingen missen de spatiotemporele resolutie die nodig zijn om de lokalisatie en de handel veranderingen langs de secretieroute lokaliseren. Receptor mensenhandel en expressie studies van nAChRs zijn voornamelijk uitgevoerd met behulp van radioligand binding 11, biotinylering assays 12, western blotting 13 of immunoprecipitatie techniq UES 12. Deze zijn afhankelijk van de bindingsspecificiteit van een reporter molecuul of fixatie van cellen missen het vermogen om gelijktijdig onderscheiden plasmamembraan inwoner intracellulaire receptoren. Daarom zijn studies van ionkanaal assemblage en blaasjes dynamiek grotendeels vertrouwd op low-throughput elektrofysiologische technieken 14.
Superieure ruimtelijke en temporele resolutie is mogelijk met de vooruitgang in fluorescentie microscopie. Genetisch gecodeerde reporter moleculen, zoals groen fluorescent eiwit (GFP) en varianten, niet-specifieke binding te elimineren problemen en gevoeligheid 15 verhogen. Een pH-gevoelige variant van GFP, bekend als superecliptic pHluorin (SEP), kan worden gebruikt om de pH inherente verschillen tussen compartimenten in een cel benutten om te bepalen lokalisatie 5, 7, 8,ref "> 9, 16, 17, 18. september fluoresceert bij een pH hoger dan 6, maar blijft in de uit-toestand bij lagere pH. Daarom receptoren gelabeld met SEP de luminale zijde worden wanneer in het endoplasmatisch reticulum onderhavige gedetecteerd ( ER) of bij het inbrengen in het plasmamembraan (PM), maar niet als beperkt tot een handel blaasje. Manipulatie van de extracellulaire pH in contact met receptoren op het plasmamembraan verandert bijgevolg de fluorescentie en daardoor detectie van deze receptoren. Als dezelfde cel achtereenvolgens afgebeeld op zowel neutrale extracellulaire pH en vervolgens een pH lager dan 6, wordt het verschil tussen de beelden toegeschreven aan receptoren op het plasmamembraan. Dit maakt een gelijktijdige meting van intracellulair (perifere ER) en plasmamembraan resident receptoren 5, 7, 8 p>, 9. Single blaasje inbrengen gebeurtenissen kunnen ook worden opgelost wanneer de extracellulaire pH-neutraal is. Zodra een lage pH handel vesicle gen met de plasmamembraan is de luminale zijde van het blaasje blootgesteld aan de extracellulaire neutrale oplossing, waardoor een transitie gedetecteerd als een uitbarsting van fluorescentie 7, 18, 19, 20. September maakt de meting van receptoren gelokaliseerd in het plasmamembraan en perifere endoplasmatisch reticulum, en een middel voor transport van receptoren tussen deze subcellulaire gebieden 5, 7, 18 te meten.
Een hogere resolutie in het plasmamembraan te bereiken is een receptor met september genetisch gecodeerde afgebeeld door totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM). Deze methode is vooralhandig als de meeste receptoren gelokaliseerd intracellulaire gebieden, aangezien TIRFM verhoogt de zichtbaarheid van het plasmamembraan. TIRFM maakt het ook mogelijk de resolutie van mensenhandel dynamica van enkele blaasjes dragen september-gelabelde receptoren bij het inbrengen in de PM. Totale interne reflectie optreedt bij het scheidingsvlak van materialen met verschillende brekingsindices, zoals tussen een cel en een glazen afdekplaat slip 21, 22. September fluoresceert bij bestraling met 488 nm excitatie, die is gericht op totale interne reflectie aan het grensvlak van het glas en cel oplossing. Dit levert een uitdovende golf dat ongeveer 150 nm doordringt in de steekproef, alleen spannend fluoroforen binnen dit volume. Slechts september bevattende receptoren in een neutrale pH omgeving binnen dit bereik excitatie gedetecteerd, overeenkomend met die die op het plasmamembraan of perifere endoplasmatisch reticulum. Aangezien detectie is beperkt to excitatie door de uitdovende golf, achtergrondfluorescentie van het intracellulaire gebied wordt gereduceerd en de signaal-ruisverhouding toeneemt 21, 22. Bovendien, omdat de straling niet het grootste deel van de cel doordringen, photodamage geminimaliseerd die beeldvorming van levende cellen in de loop van de tijd mogelijk maakt. Hierdoor TIRFM gekoppeld genetisch gecodeerde september levert de hoge resolutie en gevoeligheid vereist om subcellulaire lokalisatie en handel dynamica van membraanreceptoren te meten langs de secretieroute.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cel Cultuur en Transfectie
- Handhaaf muis neuroblastoma 2a (N2a) cellen in de groei media.
- Maak 500 ml N2a groeimedia van 200 ml Dulbecco's Eagle medium (DMEM) met een hoge glucose, 250 ml verminderd serum media, 50 ml foetaal runderserum (FBS) en 5 ml penicilline / streptomycine (100x).
- Handhaaf cellen in een T75 fles bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
- Gesplitste cellen 1:15 indien nodig, of ongeveer 80-90% confluentie. Dit is typisch 2-3 keer per week.
- Coat 35 mm glazen bodem schotel met poly-D-lysine.
- In een laminaire stroming bioveiligheid kast, voeg 200 pl 0,1 ug / ml poly-D-lysine op glas bodemgebied steriele 35 mm schaal.
- Plaats schotel in een 37 ° C incubator gedurende 1 uur.
- Spoel zorgvuldig gerecht met DDH 2 O 3-4 keer.
- Sta gerechten volledig drogen langer dan 1 uur.
- sterilize gerechten met UV-licht in de bioveiligheid kast indien nodig.
- Plate N2a cellen voor TIRFM beeldvorming.
- Verwijder groeimedia uit hechtende cellen.
- Los cellen uit de kolf door het incuberen met 1 ml 1 x trypsine (+ EDTA) gedurende 5 minuten bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
- Inactiveer trypsine door toevoeging van 9 ml kweekmedium. Meng media, trypsine en vrijstaande cellen met behulp van een pipet.
- Visueel tellen cellen met een hemocytometer en bereken het juiste volume 90.000 cellen aan elke poly-D-lysine beklede glazen onderste schaal. Deze dichtheid is vereist voor efficiënte transfectie en eencellige TIRF imaging.
- Voeg 2 ml groei media om elk gerecht met glazen bodem met 90.000 cellen.
- Incubeer de schotel bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator gedurende 16-24 uur.
- n2a transfectie
- Het verkrijgen van een plasmide construct dat een fluorofoor september opgenomenin het extracellulaire gebied van het eiwit van belang. Standaard kloneringstechnieken zoals PCR-amplificatie 5 kan worden gebruikt om het construct te genereren.
OPMERKING: september moet worden opgenomen in het extracellulaire gebied van het membraaneiwit zodat deze zich bevindt binnen het lumen van het endoplasmatisch reticulum of handel blaasjes en wordt blootgesteld aan extracellulaire oplossing als op het plasmamembraan. September is vergelijkbaar in grootte met GFP en soortgelijke kloneringstrategieën kunnen worden gebruikt. - Vervang de groeimedia op geplateerde cellen met 1,5 ml gereduceerd serum medium (bijvoorbeeld, Opti-MEM), ongeveer 30 minuten voor de toevoeging van het transfectiereagens.
OPMERKING: drugs geïnduceerde veranderingen in receotiren kan een geschikte concentratie geneesmiddel op het moment van transfectie toegevoegd. - Voeg 500 ng elke gewenste plasmide construeren 250 ul gereduceerd serum medium (tube 1).
- Voeg 2 ul van het transfectiereagens een afzonderlijke buis containing 250 pl verminderde serum media. Incubeer buis 2 bij kamertemperatuur gedurende 5 min. De verhouding van transfectiereagens tot DNA plasmide moet worden geoptimaliseerd voor elk eiwit van interesse tot expressie.
- Combineer pijpen 1 en 2 aan een oplossing die 500 ui transfectiereagens en plasmide mix maken. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 25 min.
- Voeg 500 ul transfectie mix pre-geplateerde cellen voor een totaal volume van 2 ml per schaal.
- Incubeer cellen bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator gedurende 24 uur.
- Na 24 uur werd het transfectiemengsel verwijderd en spoel de cellen met kweekmedium en voeg vervolgens 2 ml groeimedium aan elk gerecht.
OPMERKING: Indien een geneesmiddel op het moment van transfectie toegevoegd, kan weer worden aangevuld in deze stap. - Incubeer cellen bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator gedurende 24 uur.
- Afbeelding cellen 48 uur na transfectie.
- Het verkrijgen van een plasmide construct dat een fluorofoor september opgenomenin het extracellulaire gebied van het eiwit van belang. Standaard kloneringstechnieken zoals PCR-amplificatie 5 kan worden gebruikt om het construct te genereren.
2. Live-cell imaging van Total Inexterne Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM)
- Imaging opgericht
- Voer beeldvorming met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop opstelling met een scannend platform zoals weergegeven in figuur 1. Dit vraagt een aanpassing van 488 nm DPSS laserbron, een stappenmotor 488 nm bundelpositie en een hoge numerieke apertuur (NA 1,49) 60x of 100x olie-immersie objectief passen.
- Passeer de laserstraal door de juiste excitatie-filter (bandpass 488/10 nm). Lijn de gepolariseerde laserstraal door een single mode glasvezel aangesloten op een draagraket gemonteerd op een stappenmotor. In epifluorescentie modus wordt de excitatiebundel gecentreerd in het midden van de rug apertuur van het objektief.
- TIRF te bereiken, gebruiken de stappenmotor om de gefocusseerde laserbundel over de rug apertuur van de objectieflens vertalen totdat de kritische hoek bereikt en balk niet langer overgebracht door het monster en in plaats daarvan volledig gereflecteerd door het glas-cell interface.
- Maak foto's met behulp van een EMCCD (512 x 512 pixels) bediend met imaging software (bijv Metamorph) met de juiste emissie-filter gemonteerd in de emissie-pad (525/50 nm).
- Bereid de imaging-oplossing
- Bereid 200 ml extracellulaire oplossing (ECS) door mengen van 150 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM HEPES en 10 mM glucose in DDH 2 O. Voorraadoplossingen van NaCl, KCl, MgCl2, en CaCl2 kan worden voorbereid en gecombineerd met verse HEPES en glucose op de dag van beeldvorming.
- Breng de pH van een oplossing die 100 ml ECS tot pH 7,4. Stel de resterende 100 ml ECS tot een pH van 5,4. Spoel de getransfecteerde cellen met 2 ml ECS (pH 7,4).
- Voeg 2 ml ECS (pH 7,4) aan de getransfecteerde cellen voor de beeldvorming.
- Live cell imaging in TIRF
- Zet het gehele systeem, including 488 nm laser, camera, vertaling podium en imaging programma. De focus van de epifluorescentie balk en stel de macht om ongeveer 1 mW bij de 60X objectief.
- olie toe te voegen aan de doelstelling en plaats een gerecht van getransfecteerde cellen op de vertaling podium. Zet de schotel vast met fase mounts waardoor het apparaat niet bewegen ten opzichte van de fase, zodat de cellen meerdere malen kunnen worden afgebeeld.
- In epifluorescentie-modus, de focus van de microscoop en zoek de fluorescerende, getransfecteerde cellen. Cellen zullen blijven richten tussen verschillende nadruk vliegtuigen. Lokaliseren single, geïsoleerde cellen door te gaan met TIRF.
- In de imaging-programma, stelt u de belichtingstijd tot 200 msec en optimaliseren van de fluorescentie-intensiteit door de EM gewin.
- Overgang de laserbundel in TIRF door het vertalen van de bundel over het doel stapsgewijs met behulp van de stappenmotor. Als de kritische hoek nadert, zal de bundel zichtbaar vertalen over de rand van de schaal totdat deze convergeert bij The punt van de totale interne reflectie op het monster vlak.
- Controleer of de cellen zijn in TIRF modus door het aanpassen van de scherpstelling knop. In TIRF, kan slechts één vlak van cellen worden gericht (dat wil zeggen ongeveer 150 nm van glas interface), het produceren van een zeer gedefinieerd beeld met een hoge resolutie van het plasmamembraan.
- Imaging september tot subcellulaire lokalisatie te bepalen
- Lokaliseren gezonde, getransfecteerde, enkele cellen in het beeldvlak.
- Het verwerven van een gerichte beeld van de cel bij een pH van 7,4. September gemerkte receptoren op het plasmamembraan en endoplasmatisch reticulum zichtbaar zijn.
- Snel blokkeren de laserbundel bereiken het monster fotobleken te voorkomen.
- Onthoud het podium posities die overeenkomen met elke cel met behulp van microscoop imaging software geschikt voor het opnemen van meerdere xy locaties.
- Herhaal stappen 2.4.1-2.4.4 20-30 cellen per schaal tijdens het gebruik van de software om de positie van elke cel opnemen.
- After alle celbeelden bij pH 7,4 worden verzameld, handmatig pH 7,4 ECS oplossing wordt met een pipet verwijderd. Raak de schotel niet aanraken omdat dit de opgeslagen podium posities kon bewegen.
- Voeg voorzichtig 2 ml van pH 5,4 ECS aan het gerecht en wacht 10 min. Gedurende deze tijd, bespaart eerder verworven beelden.
- Onder de identieke reeks voorwaarden gebruikt om beelden te verzamelen bij een pH van 7,4, bewegen het podium om elke opgeslagen positie en het verwerven van een beeld van dezelfde cel bij een pH van 5,4. De cellen moeten er minder zin omdat alle gedetecteerde fluorescentie is afkomstig van endoplasmatisch reticulum beperkt september gelabeld receptoren. Sla de pH 5,4 cel beelden.
- Imaging enkele blaasje inbrengen gebeurtenissen in levende cellen
- Vervang kweekmedia van getransfecteerde cellen met 2 ml pH 7,4 ECS, of Leibovitz L-15 medium. De pH van Leibovitz L-15 medium CO 2 onafhankelijke, waarbij beeldvorming plaatsvindt gedurende een langere tijd indien nodig.
- Place de schotel van getransfecteerde cellen op het stadium van de microscoop. Beveiligen en de focus van een enkele cel in TIRF volgende stap 2.3.
- Indien uitgerust, zet de automatische scherpstelling, zodat de focus niet over de periode van de beeldvorming doet drijven.
- Neem een reeks van 1000 frames, continu het vastleggen van beelden met een frame rate van 200 msec. Uitbarstingen van fluorescentie wordt getoond in deze tijd, overeenkomend met lage pH handel vesicles fuseren met de plasmamembraan, waardoor de SEP de extracellulaire pH 7,4.
- Zoek een ander enkele cel en herhaal de bovenstaande stap. Reset autofocus indien nodig.
3. Beeldanalyse en gegevensverwerking
- Het analyseren van september fluorescentie subcellulaire lokalisatie te bepalen
- Open de cel beelden met behulp van een beeldanalyse-software zoals Metamorph of ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). Trek de achtergrond van zowel pH 5,4 en pH 7,4 beelden met behulp van de rollende bal setting.
- Gebruik een intensiteit van drempelwaarden om fluorescentie te kwantificeren van een enkele cel. Selecteer handmatig een regio van belang rond de cel in beeld de pH 7,4.
- Meet de cel gebied, gemiddelde intensiteit, en geïntegreerde dichtheid met behulp van een plugin in ImageJ of met behulp van de ingebouwde functie "Measure" onder de tab Analyseren.
- Herhaal stappen 3.1.1-3.1.3 voor dezelfde cel bij pH 5,4, nauwkeurig instellen van de intensiteit van drempelwaarden en omgeving plaats op dezelfde manier.
- Nadat de geïntegreerde dichtheid wordt verkregen celbeelden bij zowel pH 7,4 en 5,4 Bereken het plasmamembraan geïntegreerde dichtheid door het aftrekken van de pH waarde van 5,4 7,4 pH waarde. Het verschil komt overeen met het relatieve aantal receptoren op het plasmamembraan binnen de TIRF excitatiegebied.
- Als maat voor handel Bereken het relatieve percentage september gemerkte receptoren op het plasmamembraan opzichte van de resterende receptoren toegankelijk in de TIRF excitativolume wordt door het plasmamembraan integratie dichtheid van de totale geïntegreerde dichtheid bij pH 7,4, vermenigvuldigd met 100.
- Het analyseren van enkele blaasje inbrengen evenementen
- Open de reeks van 1000 tiff beelden met behulp van beeldanalyse-software. Trek de achtergrond van alle frames met behulp van de rollende bal setting.
- Pas de kleurbalans van de opname intense gebieden die overeenkomen met insertie gebeurtenissen vesikel maximaliseren. Handmatig tellen van de uitbarstingen van fluorescentie die langer dan 3 frames (> 600 msec).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
September opname in een receptor maakt directe detectie van die receptor in een levende cel. Gekoppeld aan TIRFM, dit maakt de evaluatie van de relatieve expressieniveaus van de plasmamembraan en de verdeling van receptoren in de subcellulaire locaties in de regio TIRF excitatie. Single blaasje mensenhandel gebeurtenissen kunnen ook worden opgelost.
Relatieve expressieniveaus SEP-gemerkte receptoren op plasmamembraan
September fluorescentie bij excitatie wordt bepaald door de pH van de omringende oplossing. Wanneer september gefuseerd met plasmamembraan resident receptoren kunnen de extracellulaire pH gemanipuleerd worden om deze fluorescentie of uitschakelen 5, 7, 8, 9, 17. wanneer the pH van de extracellulaire oplossing een fysiologisch 7,4, receptoren van zowel de plasmamembraan en het endoplasmatisch reticulum binnen de regio TIRF excitatie fluoresceren. De extracellulaire oplossing kan vervolgens worden uitgewisseld met een overigens identieke oplossing met pH 5,4. Dit zorgt ervoor dat het plasmamembraan bewoner september om de overgang naar een off staat, wat betekent dat alle waargenomen fluorescentie is nu uit het endoplasmatisch reticulum. Figuur 2 toont een voorbeeld van cellen afgebeeld zowel pH 7,4 (A) en pH 5,4 (B). Het relatieve aantal receptoren op het plasmamembraan opzichte van de perifere endoplasmatisch reticulum binnen de regio TIRF excitatie wordt vervolgens wiskundig berekend door de integrale densiteit van de fluorescentie bij pH 5,4 dan die bij pH 7,4, weergegeven in figuur 2C. Deze berekende plasmamembraan geïntegreerde dichtheid overeenkomt met het relatieve aantal SEP-gemerkte receptoren op het plasmamembraan binnen de TIRF excitatievolume. Aangezien het plasmamembraan omgeving perifere endoplasmatisch reticulum worden bij voorkeur opgewekt met TIRF Deze subcellulaire verdeling vergelijking tussen receptoren gelokaliseerd op deze gebieden, en niet de gehele intracellulaire gebied van de cel.
Subcellulaire verdeling van september-gelabelde receptoren
Handel receptoren kan worden gemeten door de verhouding tussen receptoren op het plasmamembraan opzichte van het endoplasmatisch reticulum. Verdelen van het plasmamembraan integratie dichtheid van de totale geïntegreerde dichtheid bij pH 7,4, vermenigvuldigd met 100, geeft een relatieve percentage SEP-gemerkte receptoren op het plasmamembraan 5, 7. Als controle Brefeldine A kan worden toegevoegd aan cellen intracellulaire van proteïnen verstoren. Wanneer Brefeldine A aanwezig is, vrijwel alle gedetecteerde receptors binnen de regio TIRF excitatie wordt beperkt tot het endoplasmatisch reticulum, resulterend in een lagere% PM. Bovendien kan gemuteerd (Δ508-I539T) cystische fibrose transmembraan regulator (Δ508-I539T-CFTR) worden gebruikt als een positieve controle. In aanwezigheid van commercieel verkrijgbaar VX-809, Δ508-I539T CFTR-expressie op het celoppervlak stijgt 2-3-voudig.
Single Vesicle Insertion Events
September niet fluoresceert of photobleach in de lage pH van een transportblaasje, maar herwint fluorescentie na blootstelling aan een extracellulaire pH van 7,4 in de plasmamembraan 7, 16, 18. Insertie gebeurtenissen worden gevisualiseerd als een burst van fluorescentie op het plasmamembraan van minimaal 3 frames (600 msec), overeenkomend met volledige versmelting van de vesicle transport naar het plasmamembraan, zoals getoond in figuur 3. Voordat een insertie (figuur 3B), geen waarneembare burst aanwezig. Een toename in fluorescentie intensiteit gezien als transportblaasje komt (figuur 3C), diffunderen door het membraan (Figuur 3D - 3G), tot het opnemen in de bulk fluorescentie van de cel (Figuur 3H - 3I).
Figuur 1: Schema van TIRF microscoop. Deze TIRF opstelling maakt gebruik van een 488 nm laser DPSS SEP excitatie vezel gekoppeld met een stappenmotor om de kritische hoek van de activeringsbundel aanpassen door het vertalen van de bundel over de rug apertuur van het objektief. Cellen worden afgebeeld met behulp van een 60X, 1,49 NA olie-immersie objectief. Emissie wordt gedetecteerd met een elektronen vermenigvuldigen ladingsgekoppelde inrichting.bestanden / ftp_upload / 55466 / 55466fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Expressie en handel op het plasmamembraan. N2a een cel die α3-september / β4 gew nAChRs bij pH 7,4 (A) toont receptoren op het plasmamembraan en endoplasmatisch reticulum. Bij pH 5,4 (B), hebben receptoren op het plasmamembraan niet fluoresceren, zodat alleen het endoplasmatisch reticulum resident receptoren toegankelijk. Het verschil tussen de geïntegreerde dichtheid bij pH 7,4 en pH 5,4 (C) voldoet aan receptoren gelokaliseerd in het plasmamembraan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Single bolletjes Insertion Event. N2a een cel die α3-september / β4 gew nAChRs met een extracellulaire pH 7,4 wordt getoond in (A). Onmiddellijk voorafgaand aan een insertie (B) geen uitbarsting van fluorescentie zichtbaar. Een handel vesicle dragende september komt (C) en september gemerkte receptoren diffunderen door het plasmamembraan (D - G), totdat onderscheiden van eerder aangebracht receptoren (H - I). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De pH gevoeligheid van september maakt receptoren die zich op de plasmamembraan te onderscheiden van intracellulaire receptoren in het endoplasmatisch reticulum, en kan worden gebruikt om het inbrengen gebeurtenissen lossen receptor-dragende vesicles 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 . Diverse technieken zoals oppervlakte biotinylatie en ligandbinding worden veel gebruikt om eiwitten te meten oppervlak. In sommige gevallen, kunnen Western blots worden gebruikt om onderscheid te maken tussen ER en PM resident eiwit. Deze september-gebaseerde techniek complementair is aan traditionele metingen verschaffen een snelle uitlezing van oppervlakte-expressie en het vermogen om veranderingen in eiwitten gelokaliseerd op het ER naar de PM kwantificeren. Aangezien september genetisch gecodeerd in het eiwit van belang, problemen met nonspefieke binding worden weggewerkt en de gevoeligheid verhoogd. September ondergaat 488 nm excitatie bij neutrale pH, maar is niet geëxciteerd onder zure omstandigheden van pH <6. Wanneer de extracellulaire pH 7,4, wordt fluorescentie gemeten nAChRs die in het endoplasmatisch reticulum en het plasmamembraan, maar niet voor die in de lagere pH secretorische blaasjes of Golgi (pH <6) 23. Tijdens de beeldvorming, het ECS van pH 7,4 wordt ingeruild voor een anderszins identiek bij pH 5,4. Het verschil tussen de geïntegreerde dichtheid in deze beelden is het plasmamembraan integratie dichtheid van een cel. Dit getal te delen door de totale geïntegreerde dichtheid in het gebied van TIRF excitatie bij pH 7,4, vermenigvuldigd met 100, geeft het percentage aan de plasmamembraan 5, 7, 8, 9. Hoewel deze studies gebruikt TIRFM kunnen soortgelijke analyses worden uitgevoerd met epi-fluorescentie.Voor membraan receptoren als nAChR, waar een meerderheid van de receptoren bevinden zich in de ER, TIRM is ideaal omdat de smalle excitatie volume de fractie van zichtbare PM resident receptoren versus intracellulaire receptoren verhoogt. Dit verhoogt de gevoeligheid van de assay verschuivingen van receptoren tussen organellen. Voor eiwitten met hogere expressieniveaus van de PM, epi-fluorescentie gebaseerde september studies volstaan om veranderingen in receptor expressie te meten. Echter, enkele blaasje inbrengen gebeurtenissen die ook worden gemeten bij een pH van 7,4 vereisen TIRFM. De uitbarsting van fluorescentie die overeenkomt met de lage pH mensenhandel blaasje fuseren met de hogere pH plasmamembraan terwijl gemakkelijk te zien in TIRFM is meestal niet waarneembaar in epi-fluorescentie.
Integratie van september met TIRF Imaging Voorwaarden
September kunnen genetisch worden opgenomen in het extracellulaire domein van een membraaneiwit. Vanwege de grootte en locatie van september, is het essentieel om verif y dat de gemodificeerde eiwit niet significant in de handel of functie verschilt van een wild-type eiwit. Testen worden uitgevoerd met de september gemerkte eiwit is opname van het label controleren niet verstoren activiteit. Voor ionenkanalen, elektrofysiologie en ionpermeabiliteit metingen zijn ideaal, terwijl voor andere receptoren fluorescente ligandbinding en Western blotting kan worden gebruikt om handel verifiëren. Hechtende cellen zijn ideaal voor transfectie commerciële transfectie reagentia en beeldvorming met TIRFM omdat zij rechtstreeks op de glazen onderste schaal. Deze bevestiging is nodig om TIRF excitatie te verzekeren door de uitdovende golf binnen ongeveer 150 nm van de glas-sample interface. Voor het bereiken van een hoge resolutie TIRF beelden, het monster moet plat te blijven tijdens de beeldvorming 21. Poly-D-lysine coating is voordelig bij beeldvorming N2a cellen omdat het een bevestiging matrix die celbewegingen minimaliseert een vlak oppervlak te handhavenlass = "xref"> 7. Boordwanden celdichtheid moet worden geoptimaliseerd om ervoor cellen die op het glazen schaaltje met TIRF bereiken. Cel clustering belemmert totale interne reflectie door het voorkomen van platte cel hechting in een enkele optische vlak. Aangezien slechts één vlak gericht in TIRF, behoud van een goede celmorfologie is cruciaal voor beeldvorming. Dit is vooral belangrijk wanneer oplossingen worden uitgewisseld SEP studies. Om morfologische veranderingen te minimaliseren, beelden bij pH 7,4 en pH 5,4 snel moeten worden verzameld. Daarnaast zal de ECS (pH 5,4) uiteindelijk permeaat intracellulaire membranen, wijzigen organel structuur en fluorescentie van de interne september gemerkte receptoren. Dit is eenvoudig te voorkomen door beelden te verzamelen onder elke pH staat binnen een paar minuten. Gegevens van meerdere schotels in dezelfde opnamesessie kunnen worden gecombineerd om het aantal geanalyseerde cellen verhogen. Bij het wisselen van oplossingen, verwijder voorzichtig de pH 7,4 ECS-oplossing met een pipet en voeg pH 5,4 ECS druppelsgewijs in tHij schotel. Verwijderen of toevoegen oplossing te snel kunnen de cellen benadrukken of verplaatst de schaal met betrekking tot de opgeslagen posities fase. Een perfusiesysteem uitwisselen oplossingen kunnen ook worden toegepast, zolang de oplossing uitwisseling volledig en snel plaats. Exact zoutconcentraties in elke oplossing moeten cel verstoring te minimaliseren. Een etappe top incubator kan worden opgenomen om de schommelingen in de temperatuur te verlagen, terwijl beeldvorming.
TIRF Imaging
TIRF imaging vermindert de achtergrond fluorescentie door te focussen op een enkele optische vlak. Dit verhoogt de signaal-ruisverhouding door het selectief opwekken fluoroforen binnen ongeveer 150 nm van het glas-monsterscheidingsvlak 21, 22. Binnen dit gebied wordt de resolutie sterk toegenomen, met name op het plasmamembraan. Dit is noodzakelijk om de meeste receptoren intracellulair bevinden. Als een hoge fractie membraanreceptoren isgelegen op het plasmamembraan, kan deze september gebaseerde benadering worden gebruikt om subcellulaire lokalisatie epifluorescentie bepalen. Indien echter een klein percentage van de totale receptoren gedistribueerd naar de plasmamembraan, zoals met nAChRs, TIRFM moet pH afhankelijke veranderingen kwantificeren fluorescentie op het plasmamembraan. Ook TIRFM maakt het oplossen van enkele blaasje mensenhandel gebeurtenissen en de verdeling van receptoren in de secretieroute. Een basis TIRF opstelling maakt gebruik van een 488 nm laser DPSS SEP excitatie vezel gekoppeld met een stappenmotor om de kritische hoek van de excitatiebundel te passen. TIR te bereiken, wordt de bundel lateraal vertaald over de rug apertuur van het objectief tot een kritische hoek wordt bereikt. Cellen worden afgebeeld met behulp van een 60X of 100X, 1,49 NA olie-immersie objectief. Een numerieke apertuur groter is dan de brekingsindex van het monster (> 1,38 voor cellen) nodig om de kritische hoek nodig TIRF bereikt. Een 1,45 NA doelstelling zou volstaan, maar 1,49NA is praktischer voor het manipuleren van de hoek van excitatie. Emissie wordt gedetecteerd met een elektronen vermenigvuldigen ladingsgekoppelde inrichting (EMCCD) met een 8 mm matrix van 512 x 512 pixels. Met behulp van een 60X objectief kunnen meerdere geïsoleerde cellen worden meegenomen binnen een gezichtsveld.
Een van de belangrijkste nadelen basis van eiwit expressie fluorescentiestraling 15 fotobleken. Deze excitatie geïnduceerde ontleding van de fluorofoor leidt tot een onomkeerbare afname in fluorescentie-intensiteit in de tijd. Daarom succesvol beeldvorming gebaseerd op een delicaat evenwicht tussen de intensiteit van de straal van excitatie en on-chip gain gebruikt in de EMCCD. De excitatie-intensiteit moet hoog genoeg zijn om een fluorofoor om detectie prikkelen, maar niet zo hoog dat het molecuul snel photobleach zijn. Gain camera kan worden gebruikt om het signaal voor detectie vermenigvuldigen, in tegenstelling tot toenemende excitatie-intensiteit, maar verhoogt ook de achtergrond inintensiteit. Bovendien moet erop worden gelet bij het kiezen van de gain-instellingen EM, tot verzadiging van de beelden te voorkomen. Tussen metingen blokkeren van de excitatiebundel voordat zij tot het monster minimaliseert fotobleken. Dit is nodig bij het verzamelen van celbeelden op een ECS pH 7,4 te vergelijken met pH 5,4. Fotobleken optreedt tussen de twee beelden niet te onderscheiden van een gebrek aan fluorescentie door pH verandering, zodat dit effect geminimaliseerd te worden. Men dient laag laservermogen gebruikt en de cel bloot uitsluitend zolang noodzakelijk is om de gewenste beelden. Voor elk experiment, kan een aantal cellen gemeten bij pH 7 onder identieke omstandigheden beeldvorming als controle. Gebruik geen pauze en het blootstellen gedurende een periode die passen bij de belichtingstijd nodig voor het uitvoeren van de test verschaft een controle voor de mate van fotobleken bepalen. Als fotobleken groter is dan 10% van de oorspronkelijke intensiteit, kan een correctiecurve worden vanaf de waargenomen fotobleking rate door het verzamelen van een tijdpad van fluorescentie-intensiteit. Voor enkele blaasje inbrengen gebeurtenissen, september-gelabelde receptoren in mensenhandel blaasjes zijn niet enthousiast tot fusie met de plasmamembraan, hetzij omdat de pH dicteert een off staat of ze zijn buiten de regio TIRF van excitatie. Daarom september hebben receptoren niet photobleach tot insertie, waardoor hogere excitatievermogen worden gebruikt om het ene september moleculen te detecteren.
Concluderend kan deze techniek worden gebruikt met verschillende hechtende celtypen. September kan in vrijwel elke membraaneiwit worden opgenomen, zolang eiwitfunctie en handel eigenschappen worden gehandhaafd. TIRF verbetert de resolutie van het plasmamembraan. September maakt de differentiatie van gemerkte eiwitten op het plasmamembraan van die in de perifere endoplasmatisch reticulum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm2 | VWR | 82050-856 | |
| 35 mm glass bottom Petri dishes, sterile | Cell E&G | GBD00002-200 | |
| Poly-D-lysine | vwr | 215017510 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Fisher Scientific | 11-965-084 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco / Fisher Scientific | 31-985-088 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered) | Gibco / Fisher Scientific | 16-000-044 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Fisher Scientific | 12604-021 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | VWR | 45000-652 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco / Fisher Scientific | 21083027 | Optional |
| Lipofectamine | Fisher Scientific | 11668030 | Gently mix; Do not vortex |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-10 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Objective immersion oil | Olympus | Type F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Microscope | Olympus | IX81 | |
| Camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 60X, 1.49 NA oil immersion objective | Olympus | APON 60XOTIRF | |
| Motorized stage | Prior | IXPROXY | |
| Motorized actuator (stepper motor) | Thorlabs | ZST213 | |
| MetaMorph (or other imaging program) | Metamorph | ||
| 488 nm laser | Market Tech | ||
| Single mode fiber | Thorlabs | SM450 | |
| Mirrors | Thorlabs | BB1-E01 | |
| Dichroic 488 nm LP | Semrock | Di02-R488-25x36 | |
| Bandpass filter, 488 nm | Semrock | LL01-488-12.5 | |
| Bandpass filter, 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 |
References
- Lester, H. A., et al. Nicotine is a selective pharmacological chaperone of acetylcholine receptor number and stoichiometry. Implications for drug discovery. AAPS J. 11 (1), 167-177 (2009).
- Henderson, B. J., Lester, H. A.
- Banerjee, C., et al. Cellular expression of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor protein in the temporal cortex in Alzheimer's and Parkinson's disease--a stereological approach. Neurobiol Dis. 7 (6 Pt B), 666-672 (2000).
- Ikonomovic, M. D., Wecker, L., Abrahamson, E. E., et al. Cortical α7 nicotinic acetylcholine receptor and β-amyloid levels in early alzheimer disease. Arch Neurol. 66 (5), 646-651 (2009).
- Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
- Kuryatov, A., Luo, J., Cooper, J., Lindstrom, J. Nicotine acts as a pharmacological chaperone to up-regulate human a4b2 acetylcholine receptors. Mol Pharmacol. 68 (6), 1839-1851 (2005).
- Fox, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. The nicotine metabolite, cotinine, alters the assembly and trafficking of a subset of nicotinic acetylcholine receptors. J Biol Chem. 290 (40), 24403-24412 (2015).
- Henderson, B. J., et al. Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors. J Gen Physiol. 143 (1), 51-66 (2014).
- Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
- Ameen, N., Silvis, M., Bradbury, N. Endocytic trafficking of CFTR in health and disease. J. Cyst. Fibros. 6 (1), 1-14 (2007).
- Pauly, J. R., Marks, M. J., Robinson, S. F., van de Kamp, J. L., Collins, A. C. Chronic nicotine and mecamylamine treatment increase brain nicotinic receptor binding without changing alpha 4 or beta 2 mRNA levels. J Pharmacol Exp Ther. 278 (1), 361-369 (1996).
- Govind, A. P., Walsh, H., Green, W. N. Nicotine-induced upregulation of native neuronal nicotinic receptors is caused by multiple mechanisms. J Neurosci. 32 (6), 2227-2238 (2012).
- Mazzo, F., et al. Nicotine-modulated subunit stoichiometry affects stability and trafficking of alpha3beta4 nicotinic receptor. J Neurosci. 33 (30), 12316-12328 (2013).
- Moroni, M., Zwart, R., Sher, E., Cassels, B. K., Bermudez, I. α4β2 nicotinic receptors with high and low acetylcholine sensitivity: pharmacology, stoichiometry, and sensitivity to long-term exposure to nicotine. Mol Pharmacol. 70 (2), 755-768 (2006).
- Tsien, R. Y.
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Fox-Loe, A. M., Dwoskin, L. P., Richards, C. I. Neuromethods: Nicotinic Acetylcholine Receptor Technologies. Ming, L. 117, Humana Press. (2016).
- Khiroug, S. S., et al. Dynamic visualization of membrane-inserted fraction of pHluorin-tagged channels using repetitive acidification technique. BMC Neurosci. 10 (141), (2009).
- Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 11080-11085 (2010).
- Yudowski, G. A., et al. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J Neurosci. 27 (41), 11112-11121 (2007).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
- Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods Cell Biol. 89, 169-221 (2008).
- Paroutis, P., Touret, N., Grinstein, S. The pH of the secretory pathway: measurement, determinants, and regulation. Physiol (Bethesda). 19, 207-215 (2004).
