Summary
这个协议描述了在哺乳动物细胞中的G蛋白偶联受体（GPCR）的内化共聚焦显微镜检测。它包括基本细胞培养，转染，和共聚焦显微镜的程序和提供了一个高效和容易解释的方法来检测融合表达GPCR的亚细胞定位和内化。
Introduction
细胞具有贩卖货物机械运送细胞外材料-如配体，微生物，营养素，和跨膜蛋白，成信息，能源和其他目的1，2中的单元格。它是细胞内环境稳定，组织的功能和整体细胞存活的关键。荧光融合蛋白的基于细胞的表达是一个功能强大的方法来研究的定位和跨膜受体，如G蛋白偶联受体（GPCR），内化在信号通路3。
从水母Aequorea victoria的标记有绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白的表达，与直接荧光检测技术相结合，在已获得广泛的接受蛋白靶向研究4，5，6。基于GFP-detecti上具有允许活细胞，同时避免固定的工件7的实时成像的优点。一系列通用的克隆载体的已被构造成便于在各种细胞中8蛋白质融合到GFP的表达，9。的质粒pEGFP-N1载体是编码增强型绿色荧光蛋白（EGFP），它已被从野生型GFP优化用于在哺乳动物细胞更亮的荧光和更高的表达一种广泛使用的并商业化的质粒载体。观察EGFP的荧光信号在哺乳动物细胞中表达时，荧光显微术，应在488nm处激发和在507 nm处的发射，最好用共聚焦显微镜下进行。
监测的亚细胞定位和受体配体-介导的内是一种常用的技术来研究的GPCR 10的信号转导和功能>，11。在大多数情况下，内化导致的GPCR脱敏（尽管激动剂的存在下的刺激反应的衰减）12，13。内化受体可以结合到溶酶体和降解，或它们可以被再循环回到细胞表面，这取决于受体和在实验中使用的细胞系的性质。
促性腺激素释放激素受体（GnRHRs）属于GPCR家族，并具有典型的GPCR蛋白结构，具有细胞外氨基末端，一个细胞内-COOH终端，和七个跨膜（TM）结构域14。重组质粒Sj的 GnRH受体-EGFP的转染（从曼氏粳稻的促性腺激素释放激素受体基因）和EGFP标记的GnRH受体Sj的 （在HEK293细胞中表达）的共焦显微镜检测报道上10sly和GFP荧光确立为跨膜蛋白定位试验15个记者。现在，SJ GnRH受体的内在化，通过S.粳稻促性腺激素释放激素（GnRH的Sj的 ）激活，表现在通过共聚焦显微镜时间和剂量依赖性。
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Protocol
1.细胞的制备
- 细胞恢复
- 转移冷冻保存的人胚胎肾293（HEK293）细胞从液氮罐到37℃水浴中，并用于1连续摇 - 2分钟。
- 加入10 mL的平衡的生长培养基（Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM），10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素 - 链霉素溶液），以10厘米的细胞培养皿中。轻轻将解冻的细胞添加到平衡生长培养基。
- 孵育细胞在37℃的水夹套CO 2培养箱用含95％空气和5％CO 2 2的潮湿气氛中- 4小时。
- 2个后 - 4小时，检查该细胞附着。替换另外24平衡的生长培养基和培养 - 48小时。
注意：因为它消除二甲亚砜（DMSO），并防止细胞损伤改变平衡生长介质是有用的。
- <强>细胞通道
- 24个后 - 48小时，当细胞已经生长到接近汇合，弃去平衡生长培养基并用2ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞。轻轻摇动菜。
- 弃去PBS和加入1毫升胰蛋白酶-EDTA（盐水，0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA）。以完全消化细胞，小心摇动培养皿中并吸脱胰蛋白酶-EDTA溶液。放于37℃的水夹套CO 2培养箱培养皿3分钟。
注意：在此期间，准备了三个新的10cm细胞培养皿，并添加10毫升平衡生长培养基到每个。 - 使用光学显微镜，确定是否在细胞已经从培养皿的底部升起。加入2毫升平衡生长培养基的培养皿中。通过移液混合，并立即吸管0.6毫升细胞悬浮液的每一个的新菜肴。轻轻用移液管混合并允许细胞在37℃和5％CO 2孵育。
2.细胞接种
- 24个后 - 48小时，当传代的细胞已经生长到接近汇合，弃去平衡生长培养基，并用2毫升的PBS洗涤细胞。轻轻摇动菜。
- 弃去PBS和加入1毫升胰蛋白酶-EDTA。以完全消化细胞，小心摇动培养皿中并吸脱胰蛋白酶-EDTA。放于37℃的水夹套CO 2培养箱培养皿3分钟。
注意：在此期间，加入2毫升平衡生长培养基到每个孔中制备一个6孔板中。 - 加入1毫升平衡生长培养基的菜，如果，在显微镜观察下，将细胞已经从培养皿底部升起。通过移液混合，并立即吸管0.1毫升细胞悬浮液（体积根据细胞生长密度调节），以所制备的6孔板（用2mL平衡生长培养基的细胞较少6孔板）的每个孔中。轻轻吹打混合，并允许细胞在37℃下温育和5％CO 2。
3.细胞转染
- 转染方法1，用脂质体制剂
注：请参阅材料的表为转染试剂1。- 次日，确保细胞应该是85 - 95％汇合。
- 添加质粒DNA（500毫微克/微升）和100μL减少血清培养基中的3微克到无菌微量离心管中，并轻轻混合。孵育在室温下5分钟。
- 制备9μL试剂1和在另一微量离心管中加入100μL低血清培养基中，并轻轻混合。孵育在室温下5分钟。
- 结合用稀释的试剂1（总体积= 215微升）稀释的质粒混合物。轻轻混匀并孵育在室温下20分钟。
- 吸出培养基断细胞培养板，并加入1.5毫升新鲜不含FBS的DMEM。
- 添加DNA-TRANSF的215微升挠度试剂混合物到每个孔中的溶液，并通过旋动板轻轻混匀。
- 孵育在37℃和5％CO 2的4 - 8小时。用新鲜的含10％FBS更换。
- 孵育细胞在37℃和5％CO 2的另一个24 -运行的任何实验之前48小时。
- 转染方法2，用脂质体制剂
注：请参阅材料的表为转染试剂2。- 添加质粒DNA的2微克（500毫微克/微升），试剂2 4μL，和100μL减少血清培养基到无菌微量离心管中。轻轻混匀并孵育在室温下15分钟。
- 将转染混合物加入到细胞中以逐滴方式。
- 转染后，孵育细胞24 -在37℃下48小时和5％CO 2，在运行任何实验之前。
4.在盖玻片上的细胞培养
- 回覆移动从培养6孔板的生长培养基中。
- 洗用1mL PBS的细胞单层没有钙和镁。
- 添加0.5毫升胰蛋白酶-EDTA。小心摇动培养皿中并吸弃胰蛋白酶-EDTA。孵育培养板在37℃下3分钟和5％CO 2。实际的培养时间与所使用的细胞系不同而不同。
注意：在此期间，准备一个新的12孔板，并添加直径15mm无菌盖玻片到每个孔中。涂有赖氨酸，层粘连蛋白或胶原盖玻片可以改善HEK293细胞容易脱离细胞附着。 - 当细胞被分离，添加预热的1毫升完全生长培养基到每个孔中。通过移液混合，并立即将所需数量的细胞与盖玻片转移至12孔板。新鲜的完全的生长培养基添加到每个孔中以调节总体积至1mL
- 孵育细胞16 -在37℃下24小时和5％CO 2。
注：30后 -60分钟后，大部分细胞将已经粘附到无菌盖玻片上。
5.共聚焦显微镜检测
- 细胞定位
- 16个后 - 24小时，当细胞已经生长到接近汇合于在12孔板中的无菌盖玻片，添加膜探针的DiI，向每个孔中，得到的5μM的终浓度。使细胞温育在37℃下30分钟和5％CO 2。
- 30分钟后，取出平衡生长培养基并在冷PBS中洗涤细胞两次（2 - 8℃）。
- 通过加入1毫升4％的多聚甲醛溶液（在PBS中）到每个孔中固定细胞。轻轻搅动15分钟。
注意：多聚甲醛是通过皮肤接触或吸入有中等毒性，并指定为可能的人类致癌物。化学品通风柜，排出平衡外壳或其它保护性措施应的多聚甲醛的称重和处理过程中被使用。</ LI> - 洗固定细胞两次在PBS中。添加200-300 DAPI（4' ，6-二脒基-2-苯基吲哚）溶液（0.5微克/毫升）的μL到每个孔中，并孵育在室温下10分钟。
- 用PBS洗细胞两次。小心地从板上取下盖玻片和灯芯掉过量的PBS。倒置到装载有安装平台（50％v / v甘油/水）一滴显微镜载玻片上。从载玻片移除过量的安装平台。
- 细胞内
- 16个后 - 24小时，当细胞已经生长到接近汇合于在12孔板中的无菌盖玻片，取出平衡生长培养基并加入新鲜的，温热的DMEM培养基（37℃）。孵育所述细胞在37℃下1个小时和5％CO 2。
- 处理细胞用不同浓度（0，10 -12，10 -9，和10 -6 M）的配体的30分钟，并用10 -6 M的配体不同的时间（0对待它们，10，30和60分钟）。
- 清洗细胞两次在冷PBS（2 - 8℃）。通过加入1毫升4％的多聚甲醛溶液（在PBS中）到每个孔中固定细胞。轻轻搅动15分钟。
- 清洗细胞两次在PBS中。小心地从板上取下盖玻片和灯芯掉过量的PBS。倒置到装载有安装平台（50％v / v甘油/水）一滴显微镜载玻片上。从载玻片移除过量的安装平台。
- 共聚焦显微镜
- 打开共焦显微镜的硬件，包括汞灯功率，PC显微镜，扫描仪和激光。登录到操作系统帐户，启动软件，检查配置和选择激光。按照说明书的顺序打开激光共聚焦显微镜系统的不同单元。
- 放置制备玻片上的显微镜载物台上。在使用阶段控制器物镜样本位置。加上雪松油一滴被选择的油浸镜头时盖玻片。将盖玻片上面对镜头的幻灯片。
- 找到感兴趣的细胞中的荧光显微镜下。
- 切换到扫描模式。选择激光功率和发射荧光团的光谱范围。捕获由调谐激光强度和其它参数的高质量的共聚焦图像。
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Representative Results
图1显示了共焦显微镜系统的一个例子。 图2呈现的pEGFP-N1的在HEK293细胞中的表达。在细胞质和细胞核中检测到GFP信号。 图3显示了促性腺激素释放激素受体的从国槐在HEK293细胞中的亚细胞定位，与我们先前公布的结果一致15。该融合蛋白与GnRH受体Sj的 （Sj的 GnRH受体-EGFP）的C末端的EGFP标签在这个实验中出现绿色CLSM下时。用DAPI将细胞核揭示了蓝色。的DiI染色以红色突出显示的细胞膜。合并后的图像中的细胞表面上的黄色信号所表示的红色和绿色的重合，表明Sj的 GnRH受体的质膜定位。
图4和5显示在HEK293细胞中的Sj的促性腺激素释放激素受体的内化测定法的结果。为了显现Sj的 GnRH受体的内在化，将细胞与不同浓度的促性腺激素释放激素（Sj的促性腺激素释放激素）15处理30分钟（ 图4），或它们与单一浓度进行处理-为不同的持续时间（10 -6 M）（ 图5）。在没有Sj的促性腺激素释放激素的，控制（CTL）受体融合有质膜定位。 如图4中所示，在不同的配体浓度下，Sj的促性腺激素释放激素受体的内在化以剂量依赖的方式进行，并且该受体被完全从与10的细胞表面内化- -6 M的配体。 如图5所示，用10受体内在化的时间过程分析的结果- -6 M配体表明内化Sj的 GnRH受体可检测到的激动剂刺激后10分钟，通过发生60分钟极端内化。观察这两个数字共聚焦显微镜显示，荧光Sj的 GnRH受体-EGFP融合蛋白在细胞膜主要定位并且是显着和迅速内化至细胞中响应于在HEK293细胞中的Sj的 GnRH的肽。
图1.一个共聚焦显微镜系统的一个例子。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.在控制GFP蛋白的共聚焦显微镜的pEGFP-N1转染的HEK293细胞 。 请点击此处查看该图的放大版本。
在HEK293细胞中通过共聚焦显微镜Sj的 GnRH受体-EGFP融合蛋白的图3位置。用DAPI染色细胞核显示为蓝色。的DiI染色，以红色显示，突出了细胞膜。 SJ的GnRHR-EGFP融合蛋白显示为绿色。在合并后的图像，黄色表示红色和绿色信号的巧合。所有图像代表至少三个独立的实验。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图4.内化在时程由共聚焦显微镜HEK293细胞中的Sj的 GnRH受体-EGFP融合蛋白的。与GnRH受体Sj的 -EGFP质粒转染的HEK293细胞通过活化处理用不同浓度的GnRH的30分钟。该控制的情况下是没有GnRH刺激（CTL）。所有图像代表至少三个独立的实验。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5.内在Sj的 GnRH受体-EGFP融合蛋白在HEK293细胞中通过共聚焦显微镜以剂量依赖方式的。与GnRH受体Sj的 -EGFP质粒转染的HEK293细胞通过活化处理，用10 - -6 M的配体不同的Durations。该控制的情况下是没有GnRH刺激（CTL）。所有图像代表至少三个独立的实验。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这里介绍的协议提供了一种有效和容易解释的方法来检测在HEK293细胞中的亚细胞定位和表达GPCR融合蛋白的内在化。该技术可以容易地适用于许多不同基因和细胞类型，诸如用于从家蚕在HEK293和家蚕细胞16 corazonin受体的细胞定位和内化。
这个功能强大的试验的成功应用依赖于几个关键因素。最重要的是细胞的身体健康，这是转染效率和数据质量至关重要。将转染的培养时间，转染和其它实验中，和转染的细胞的通过成像之前盖玻片之间的间隔，是所有的步骤，其中所述培养的细胞的损伤是可能的。因此，保持细胞的健康是在这个实验中的所有步骤的重要前提。此外，避免了在密集的培养物中紧密压缩细胞是为了获取具有共焦显微镜的高品质的图像的关键。为了尽量减少对GPCR的本地化的荧光标签的影响，我们产生用EGFP受体融合于细胞内的C末端。该基因的成功和高效转染到细胞也很重要。转染效率可以在不同细胞系变化很大。因此，在协议某些步骤的优化可能是必要的，这取决于所使用的特定细胞类型。例如，在转染方法1，在DMEM转染的细胞的不含FBS的培养持续时间可以根据小区条件进行了优化。除了DNA质粒的剂量，脂质体试剂的还原血清培养基的剂量，并应根据特定的细胞系进行调整。否则，electrotransfection技术可同时进行，而不是脂质体试剂介导的转˚F或在特定的细胞系上可接受的转染效率。然而，额外的硬件是必需的，并且在细胞悬浮液，并在小体积难以通过electrotransfection转染。当前测定的真实强度，但是，在于急性处理，如Sj的 GnRH受体的响应于Sj的促性腺激素释放激素配体的内在化后相同的培养条件下在相同的细胞的变化之间的比较。
内化是主要的机制控制GPCR信号，以确保适当的细胞应答的刺激11中的一个。我们可以很容易地通过激光共聚焦显微成像观察内在的变化。 Sj的 GnRH受体的以剂量和时间依赖的方式内化在图4中清楚地显现出来。
我们已经描述了该协议可以很容易地适应其它真核PR的亚细胞追踪oteins，如核雌激素受体17。然而，在该协议某些步骤的优化将是必要的，这取决于所使用的特定细胞类型，这将需要进一步的探索和实践。不过，考虑到蛋白的亚细胞定位对基因，蛋白质修饰的识别有很大的影响，和信号通路，这个协议的基础上，发表的研究，可以提供可靠的数据和信息。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 cell line | |||
| DMEM/High glucose | Hyclone | SH30022.01 | High glucose 4.0 mM L-glutamine |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PuFei | 1101-100 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genom | GNM10010 | |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% Trypsin & 0.02% EDTA | Genom | GNM25200 | |
| Opti-MEM (1x) | GIBCO, by Life Technologies | 31985-062 | reduced serum media |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | Reagent 1 |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | Reagent 2 |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0126 | |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) | 80096618 | |
| 100 mm cell culture | CORNING | 430167 | |
| 6-well plate | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| 12-well plate | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| Cover Glass | NEST | 801007 | |
| Microscope Slides | Citoglas | 10127105P-G | |
| Thermo Scientific Forma CO2 Incubator | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II laser scanning confocal microscope | Leica | 5100001311 |
References
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