Summary
Dit protocol beschrijft confocale microscopie detectie van G-eiwit-gekoppelde receptor (GPCR) internalisatie in zoogdiercellen. Het omvat de basis-celkweek, transfectie, en confocale microscopie procedure en zorgt voor een efficiënte en gemakkelijk te interpreteren methode om de subcellulaire lokalisatie en de internalisering van-fusion uitgedrukt GPCR detecteren.
Introduction
Cellen bezitten lading handel machines te transporteren materialen extracellulaire-liganden zoals, micro-organismen, nutriënten en transmembraaneiwitten-in de cel informatie, energie en andere doelen 1, 2. Het is van cruciaal belang voor de cellulaire homeostase, de functie weefsel, en de algehele overleving cel. De cellen gebaseerde expressie van fluorescente fusieproteïnen is een krachtige manier om de lokalisatie en de internalisering van transmembraan receptoren zoals G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR), studeren signaalroutes 3.
De expressie van fusie-eiwitten gelabeld met groen fluorescent eiwit (GFP) vanaf kwal Aequorea Victoria, gecombineerd met directe fluorescentie detectie technieken is algemeen geaccepteerd in proteïnerichtsignaalsequentie onderzoek 4, 5, 6. -GFP gebaseerde detectiOp heeft het voordeel dat de real-time beeldvorming van levende cellen met vermijding fixatie artefacten 7. Een reeks veelzijdige kloneringsvectoren is geconstrueerd om de expressie van eiwit fusies met GFP in verschillende cellen 8 te vergemakkelijken, 9. De pEGFP-N1 vector is een veel gebruikte en in de handel plasmidevector die codeert voor een versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP), die is geoptimaliseerd van wildtype GFP voor helderdere fluorescentie en hogere expressie in zoogdiercellen. Waarnemen het fluorescentiesignaal van EGFP expressie in zoogdiercellen dient de fluorescentiemicroscopie verricht met excitatie bij 488 nm en emissie bij 507 nm, bij voorkeur met confocale microscopie.
Bewaken van de subcellulaire lokalisatie en ligand-gemedieerde internalisatie van receptoren is een gebruikelijke techniek om de signaaltransductie en functie van GPCRs 10 onderzoeken up>, 11. In de meeste gevallen leidt tot internalisatie desensitisatie van de GPCR (de verzwakking van de stimulusresponsie ondanks de aanwezigheid van agonisten) 12, 13. De geïnternaliseerde receptoren kunnen in het lysosoom worden opgenomen en afgebroken, of ze kunnen naar het celoppervlak worden gerecycleerd, afhankelijk van de aard van de receptoren en de cellijnen gebruikt in de experimenten.
Het gonadotropine afgevende hormoon receptoren (GnRHRs) behoren tot de GPCR-familie en een typische GPCR eiwitstructuur, met een extracellulair aminoterminaal, een intracellulaire -COOH terminal, zeven transmembraan (TM) domeinen 14. De transfectie van de recombinante plasmide Sj GnRHR-EGFP (met GnRHR gen uit Sepiella japonica) en confocale microscopie detectie van EGFP gelabeld Sj GnRHR (tot expressie gebracht in HEK293-cellen) gemeld Previously en GFP fluorescentie werd vastgesteld als een reporter voor transmembraan eiwit lokalisatie 15 assays. Nu, de internalisatie van Sj GnRHR, geactiveerd door S. japonica gonadotropine afgevende hormoon (GnRH Sj), werd aangetoond in tijd- en dosisafhankelijke manieren met confocale microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celbereiding
- Cell herstel
- Breng de gecryopreserveerde menselijke embryonische nier 293 (HEK293) cellen van een vloeibare stikstof tank naar een 37 ° C waterbad en schud continu gedurende 1-2 min.
- Voeg 10 ml geëquilibreerd kweekmedium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM), 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine-oplossing) tot 10 cm celkweekschaal. Voorzichtig de ontdooide cellen toe te voegen aan de geëquilibreerde groeimedium.
- Incubeer de cellen in een 37 ° C watermantel CO2 incubator met een vochtige atmosfeer die 95% lucht en 5% CO2 gedurende 2-4 uur.
- Na 2-4 h, controleer dat de cellen gevoegd. Vervang de geëquilibreerde groeimedium en cultuur voor een ander 24-48 uur.
LET OP: Het veranderen van de geëquilibreerde groeimedium is nuttig omdat het verwijdert dimethylsulfoxide (DMSO) en beschermt tegen celbeschadiging.
- <strong> Cell passage
- Na 24-48 uur, wanneer de cellen zijn gegroeid tot bijna confluentie, gooi de geëquilibreerde groeimedium en was de cellen met 2 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Zwenk de schaal voorzichtig.
- Gooi de PBS en voeg 1 ml trypsine-EDTA (saline, 0,25% trypsine en 0,02% EDTA). Om de cellen volledig te verteren, wervelen de schotel voorzichtig en zuig van de trypsine-EDTA-oplossing. Zet de schaal in de 37 ° C watermantel CO2 incubator gedurende 3 min.
LET OP: Tijdens deze periode, voor te bereiden drie nieuwe 10-cm celkweekschaaltjes en voeg 10 ml in evenwicht gebracht groeimedium aan elk. - Met behulp van een lichtmicroscoop, bepalen of de cellen van de bodem van de schaal zijn opgeheven. Voeg 2 ml in evenwicht gebracht groeimedium aan het gerecht. Meng door pipetteren en direct pipet 0,6 ml van de celsuspensie aan elk van de nieuwe gerechten. Meng door pipetteren en de cellen te laten incuberen bij 37 ° C en 5% CO2.
2. Cel zaaien
- Na 24-48 uur, wanneer de passage onderworpen cellen gekweekt tot bijna confluentie, gooi de geëquilibreerde groeimedium en was de cellen met 2 ml PBS. Zwenk de schaal voorzichtig.
- Gooi de PBS en voeg 1 ml trypsine-EDTA. Om de cellen volledig te verteren, wervelen de schotel voorzichtig en zuig van de trypsine-EDTA. Zet de schaal in de 37 ° C watermantel CO2 incubator gedurende 3 min.
Opmerking: In deze periode stelt een 6-wells plaat door toevoeging van 2 ml geëquilibreerd kweekmedium aan elke well. - Voeg 1 ml geëquilibreerd groeimedium om de schotel, indien onder microscopische waarneming, de cellen hebben de schaalbodem opgeheven. Meng door pipetteren en direct pipet 0,1 ml celsuspensie (het volume is aangepast aan de groei celdichtheid) aan elk putje van de bereide 6-well plaat (cell-less 6-wells plaat met 2 ml geëquilibreerd kweekmedium). Meng door pipetteren en laten de cellenincuberen bij 37 ° C en 5% CO2.
3. Cel Transfectie
- Transfectiemethode 1, met liposoomformuleringen
OPMERKING: Zie de tabel van materialen voor transfectiereagens 1.- De volgende dag, ervoor te zorgen dat de cellen 85 zou moeten zijn - 95% confluent.
- Voeg 3 ug plasmide DNA (500 ng / ul) en 100 ui gereduceerd serum medium in een steriele microcentrifugebuis en meng voorzichtig. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Bereid 9 pl reagens 1 en 100 pl verminderde serum media in een microcentrifugebuis en meng voorzichtig. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Combineer het verdunde plasmide mengsel verdund Reagens 1 (totaal volume = 215 ul). Meng voorzichtig en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
- Aspireren medium uit cellen gekweekt plaat en voeg 1,5 ml vers DMEM zonder FBS.
- Voeg 215 ul van DNA-transfectie reagensmengsel aan elk putje druppelsgewijs en meng voorzichtig door zwenken de plaat.
- Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 4-8 uur. Vervang met verse DMEM met 10% FBS.
- Incubeer cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende nog 24-48 uur voordat u enige experimenten.
- Transfectiemethode 2, met liposoomformuleringen
OPMERKING: Zie de tabel van materialen voor transfectiereagens 2.- Voeg 2 ug plasmide DNA (500 ng / pl), 4 pi van Reagens 2, en 100 ul gereduceerd serum medium in een steriele microcentrifugebuis. Meng voorzichtig en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg het transfectiemengsel aan de cellen op druppelsgewijze wijze.
- Na transfectie incubeer cellen voor 24-48 uur bij 37 ° C en 5% CO2, voordat u enige experimenten.
4. Cell Culture on Cover Slips
- Opnieuwbeweegt het groeimedium uit de kweek 6-wells plaat.
- Was de celmonolaag met 1 ml PBS zonder calcium en magnesium.
- Voeg 0,5 ml trypsine-EDTA. Swirl de schotel voorzichtig en zuig off trypsine-EDTA. Incubeer de kweekplaat gedurende 3 min bij 37 ° C en 5% CO2. De werkelijke incubatietijd afhankelijk van de gebruikte cellijn.
Opmerking: In deze periode stelt een nieuwe 12-wells plaat en voeg 15 mm diameter steriele dekglaasjes aan elk putje. Dekglaasjes bedekt met lysine, laminine of collageen kan celhechting te HEK293 cellen die gemakkelijk los te verbeteren. - Wanneer de cellen losgemaakt, voeg 1 ml voorverwarmd compleet kweekmedium aan elke well. Meng door pipetteren en geeft de vereiste aantal cellen dragen aan de 12-well plaat met dekglaasjes. Voeg vers compleet kweekmedium aan elke put om het totale volume op 1 ml te passen
- Incubeer de cellen gedurende 16-24 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
NB: Na 30 -60 min, zal de meerderheid van de cellen gehecht zijn aan de steriele dekglaasjes.
5. confocale microscopie Detection
- cellulaire lokalisatie
- Na 16-24 uur, wanneer de cellen op steriele dekglaasjes in de 12-well plaat tot bijna confluentie gegroeid, voeg het membraan probe, Dil, aan elk putje, hetgeen een uiteindelijke concentratie van 5 uM. Laat de cellen te incuberen gedurende 30 minuten bij 37 ° C en 5% CO2.
- Na 30 minuten, verwijder het geëquilibreerd kweekmedium en was de cellen tweemaal in koude PBS (2-8 ° C).
- Fixeer de cellen door toevoeging van 1 ml van een 4% paraformaldehyde oplossing (in PBS) aan elk putje. Schud gedurende 15 minuten.
Voorzichtig: paraformaldehyde matig toxisch bij contact met de huid of inhalatie, en aangeduid als mogelijk carcinogeen. Chemische afzuigkappen, geventileerde kasten balans of andere beschermende maatregelen tijdens het wegen en behandeling van paraformaldehyde worden toegepast. </ Li> - Was de gefixeerde cellen tweemaal in PBS. Voeg 200-300 ui DAPI (4' , 6-diamino-2-fenylindool) (0,5 ug / ml) aan elk putje en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de cellen tweemaal met PBS. Verwijder voorzichtig de dekglaasjes van de plaat en lont overtollige PBS. Inverteer op microscoopglaasjes geplaatst met een druppel montage medium (50% v / v glycerol / water). Verwijder overtollige montage medium van de dia's.
- Cellular internalisatie
- Na 16-24 uur, wanneer de cellen op steriele dekglaasjes in de 12-well plaat tot bijna confluentie gegroeid, verwijder de geëquilibreerde kweekmedium vervangen door vers, warm DMEM-medium (37 ° C). Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- Behandel de cellen met verschillende concentraties (0, 10 -12, -9 10 en 10 -6 M) van ligand gedurende 30 minuten en te behandelen met 10 -6 M ligand voor verschillende tijdstippen (0,10, 30 en 60 min).
- Was de cellen tweemaal met koud PBS (2-8 ° C). Fixeer de cellen door toevoeging van 1 ml van een 4% paraformaldehyde oplossing (in PBS) aan elk putje. Schud gedurende 15 minuten.
- Was de cellen tweemaal in PBS. Verwijder voorzichtig de dekglaasjes van de plaat en de pit van de overmaat PBS. Inverteer op microscoopglaasjes geplaatst met een druppel montage medium (50% v / v glycerol / water). Verwijder overtollige montage medium van de dia's.
- Confocale microscopie
- Zet de hardware van de confocale microscoop, met inbegrip van de kwiklamp macht, PC microscoop, scanner en laser. Meld u aan besturingssysteemaccount, start u de software, controleert u de configuratie en selecteer laser. Zet de verschillende eenheden van confocale microscopie systeem in de volgorde volgens de instructies.
- Plaats de voorbereide dia's op de microscoop podium. Plaats het monster via objectieflens via de platformbesturing. Voeg een druppel van cederhout olie opmet dekglaasje als de olie immersielens is geselecteerd. Plaats het deksel slips op dia's met uitzicht op de lens.
- Vind de cellen van belang in het kader van de fluorescentie microscopie.
- Schakelen naar de scanmodus. Kies het laservermogen en het spectrale gebied van de emissie fluorofoor. Leg de hoge kwaliteit confocale beelden door tuning intensiteit van de laser en andere parameters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont een voorbeeld van een confocale microscoop systeem. Figuur 2 toont de expressie van pEGFP-N1 in HEK293 cellen. Het GFP-signaal werd gedetecteerd in het cytoplasma en de kern. Figuur 3 toont de subcellulaire lokalisatie van GnRHR van S. japonica in HEK293-cellen, consistent met onze eerder gepubliceerde resultaten 15. De fusie-eiwit met de EGFP tag aan het C-uiteinde van Sj GnRHR (Sj GnRHR-EGFP) verscheen groen in dit experiment toen onder CLSM. De kern gekleurd met DAPI werd geopenbaard in blauw. DII vlekken gewezen op de celmembraan in het rood. Het gele signaal op het celoppervlak in de samengevoegde afbeelding aangegeven het samenvallen van rode en groene, waaruit de plasmamembraan lokalisatie van Sj GnRHR.
Figuren 4 en 5 tonende resultaten van de Sj GnRHR internalisatie assays HEK293 cellen. De internalisatie van Sj GnRHR visualiseren, werden cellen behandeld met gonadotropine afgevend hormoon (Sj GnRH) 15 bij verschillende concentraties gedurende 30 min (figuur 4) of werden behandeld met een enkele concentratie (10-6 M) voor verschillende tijdsduren ( figuur 5). Bij gebrek aan Sj GnRH, de besturing (CTL) receptorfusie had plasmamembraan lokalisatie. Zoals getoond in figuur 4, in verschillende ligandconcentraties, de internalisatie van de Sj GnRHR overgegaan op een dosis-afhankelijke wijze en de receptor werd volledig geïnternaliseerd van het celoppervlak met 10-6 M ligand. Zoals getoond in figuur 5, de resultaten van het tijdverloop analyse van receptor internalisatie met 10-6 M ligand aangetoond dat geïnternaliseerdSj GnRHR was detecteerbaar 10 min na agonist stimulatie en extreme internalisatie opgetreden 60 min. Observatie met confocale microscopie uit deze twee figuren gebleken dat de fluorescerende Sj GnRHR-EGFP-fusie-eiwit primair gelokaliseerd was in het plasmamembraan en was sterk en snel geïnternaliseerd in de cel als reactie op de Sj GnRHpeptide in HEK293 cellen.
Figuur 1. Een voorbeeld van een confocale microscoop systeem. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Confocale microscopie van GFP eiwit in het Configuratie pEGFP-N1-getransfecteerde HEK293 cellen . Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Lokalisatie van Sj GnRHR-EGFP-fusie-eiwit in HEK293 cellen door confocale microscopie. De kern gekleurd met DAPI is in blauw. Dii vlekken, rood weergegeven, wijst op de celmembraan. Sj GnRHR-EGFP-fusie-eiwit wordt getoond in groen. In de samengevoegde afbeelding, geel wijst op het samenvallen van de rode en groene signalen. Alle foto vertegenwoordigen ten minste drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
ig4.jpg"/>
Figuur 4. internalisering van Sj GnRHR-EGFP-fusie-eiwit in HEK293 cellen in een tijdsverloop van confocale microscopie. HEK293-cellen getransfecteerd met Sj GnRHR-EGFP plasmide werd geactiveerd door behandeling met verschillende concentraties van GnRH gedurende 30 min. De regelkast was vandaag GnRH stimulatie (CTL). Alle foto vertegenwoordigen ten minste drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Internalisatie van Sj GnRHR-EGFP-fusie-eiwit in HEK293 cellen op een dosisafhankelijke wijze door confocale microscopie. HEK293-cellen getransfecteerd met Sj GnRHR-EGFP plasmide werd geactiveerd door behandeling met 10-6 M ligand voor verschillende durations. De regelkast was vandaag GnRH stimulatie (CTL). Alle foto vertegenwoordigen ten minste drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier gepresenteerde protocol verschaft een efficiënte en eenvoudig te interpreteren methode om de subcellulaire lokalisatie en internalisatie van tot expressie gebracht GPCR fusie-eiwit in HEK293-cellen te detecteren. De techniek kan eenvoudig worden aangepast voor verschillende genen en celtypes, zoals de cellulaire lokalisatie en internalisatie van de receptor corazonin van Bombyx mori in HEK293 cellen 16 en BMN.
De succesvolle toepassing van deze krachtige test is gebaseerd op een aantal belangrijke factoren. Foremost is de goede gezondheid van de cellen, die essentieel is voor efficiënte transfectie en kwaliteit van de gegevens. De transfectie incubatietijd, het interval tussen transfectie en andere experimenten, en de passage van getransfecteerde cellen slippen afleggen alvorens beeldvorming, zijn alle stappen waarbij schade aan de gekweekte cellen mogelijk. Daarom is het behoud van de goede gezondheid van de cellen is een belangrijke voorwaarde voor alle stappen in dit experiment. Bovendien, het vermijden van strak samengeperst cellen in dichte culturen is van vitaal belang om hoge kwaliteit beelden te verwerven met confocale microscopie. Om de invloed van de fluorescente tag op de lokalisatie van de GPCRs minimaliseren genereerden wij receptoren met EGFP gefuseerd aan het intracellulaire C-terminus. De succesvolle en efficiënte transfectie van het gen in de cellen van belang. Transfectie-efficiëntie kan sterk variëren in verschillende cellijnen. Daarom kan de optimalisatie van bepaalde stappen in het protocol noodzakelijk zijn, afhankelijk van de specifieke gebruikte celtype. Bijvoorbeeld transfectie methode 1, de incubatie tijd van getransfecteerde cellen in DMEM zonder FBS kan worden geoptimaliseerd op basis van de cel aandoening. Naast de dosering van het DNA-plasmide, dient de dosering van het liposoom reagens en gereduceerd serum medium worden aangepast aan bepaalde cellijnen. Anders kan de electrotransfection techniek worden uitgevoerd in plaats van liposoom-bemiddelde transfectie reagens fof aanvaardbare transfectie efficiëntie in een bepaalde cellijn. Echter extra hardware nodig is, en cellen in suspensie en in een klein volume moeilijk te transfecteren door electrotransfection. De ware kracht van de huidige test, ligt echter bij de vergelijking van veranderingen in dezelfde cellen onder identieke kweekomstandigheden na een acuut manipulaties, zoals de internalisering van Sj GnRHR in reactie op de Sj GnRH ligand.
Internalisatie is een van de belangrijkste mechanismen die GPCR signalering te zorgen voor geschikte cellulaire responsen op stimuli 11. We kunnen gemakkelijk veranderingen in de internalisering te observeren door middel van beeldvorming met confocale microscopie. De internalisering van Sj GnRHR op een dosis- en tijdsafhankelijke wijze duidelijk geopenbaard in figuur 4.
De techniek die we hebben beschreven kan gemakkelijk worden aangepast aan de subcellulaire opsporing van andere eukaryote proteins, zoals de nucleaire oestrogeenreceptor 17. Echter, het optimaliseren van bepaalde stappen in het protocol noodzakelijk zijn, afhankelijk van de specifieke celtypen gebruikt, die verder onderzoek en de praktijk vereist. Niettemin, aangezien de subcellulaire locatie van eiwitten heeft een grote invloed op de identificatie van genen, eiwitten modificaties en signaalroutes Dit protocol op basis van de gepubliceerde onderzoek kunnen betrouwbare gegevens en informatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 cell line | |||
| DMEM/High glucose | Hyclone | SH30022.01 | High glucose 4.0 mM L-glutamine |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PuFei | 1101-100 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genom | GNM10010 | |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% Trypsin & 0.02% EDTA | Genom | GNM25200 | |
| Opti-MEM (1x) | GIBCO, by Life Technologies | 31985-062 | reduced serum media |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | Reagent 1 |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | Reagent 2 |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0126 | |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) | 80096618 | |
| 100 mm cell culture | CORNING | 430167 | |
| 6-well plate | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| 12-well plate | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| Cover Glass | NEST | 801007 | |
| Microscope Slides | Citoglas | 10127105P-G | |
| Thermo Scientific Forma CO2 Incubator | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II laser scanning confocal microscope | Leica | 5100001311 |
References
- Mellman, I.
- Hausott, B., Klimaschewski, L. Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons. Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).
- Kallal, L., Benovic, J. L. Using green fluorescent proteins to study G-protein-coupled receptor localization and trafficking. Trends Pharmacol Sci. 21, 175-180 (2000).
- Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111, 229-233 (1992).
- Spector, D. L., Goldman, R. D. Constructing and Expressing GFP Fusion Proteins. CSH protocols. 2006, (2006).
- Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli. FEBS Lett. 507, 220-224 (2001).
- von Arnim, A. G., Deng, X. W., Stacey, M. G. Cloning vectors for the expression of green fluorescent protein fusion proteins in transgenic plants. Gene. 221, 35-43 (1998).
- Webb, C. D., Decatur, A., Teleman, A., Losick, R. Use of green fluorescent protein for visualization of cell-specific gene expression and subcellular protein localization during sporulation in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 177, 5906-5911 (1995).
- Kain, S. R., et al. Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization. BioTechniques. 19, 650-655 (1995).
- Fukunaga, S., Setoguchi, S., Hirasawa, A., Tsujimoto, G. Monitoring ligand-mediated internalization of G protein-coupled receptor as a novel pharmacological approach. Life Sci. 80, 17-23 (2006).
- Yang, J., et al. Agonist-Activated Bombyx Corazonin Receptor Is Internalized via an Arrestin-Dependent and Clathrin-Independent Pathway. Biochemistry. 55, 3874-3887 (2016).
- Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. Regulation of G protein-coupled receptor kinases and arrestins during receptor desensitization. Mol Pharmacol. 63, 9-18 (2003).
- Ferguson, S. S., et al. Role of beta-arrestin in mediating agonist-promoted G protein-coupled receptor internalization. Science. 271, 363-366 (1996).
- Stojilkovic, S. S., Reinhart, J., Catt, K. J. Gonadotropin-releasing hormone receptors: structure and signal transduction pathways. Endocr Rev. 15, 462-499 (1994).
- Yan, Y. J., et al. Identification and Expression Profile of the Gonadotropin-Releasing Hormone Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. , (2016).
- Yang, J., et al. Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling cascades. J Biol Chem. 288, 11662-11675 (2013).
- Lu, Z. M., et al. Cloning, Characterization, and Expression Profile of Estrogen Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 325, 181-193 (2016).
